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Artículo de método

Marcaje de isótopos estables in vivo para la identificación por espectrometría de masas de metabolitos paternos transferidos del espermatozoide al ovocito durante la fertilización

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DOI:

10.3791/67765

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17 de junio de 2025

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1Biogem Scarl, Institute of Molecular Biology and Genetics Research, 2Department of Experimental Medicine, University della Campania Luigi Vanvitelli, 3Department of Biology, University of Naples "Federico II ", 4Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Salerno, 5Department of Pharmacy, University of Naples "Federico II "

En este artículo

Resumen

Este procedimiento tiene como objetivo identificar los metabolitos transferidos de los espermatozoides a los ovocitos durante la fertilización mediante el uso de marcadores de isótopos estables con glucosa 2H2O oU 13C, seguido de un análisis metabolómico. Los sementales marcados con deuterio se aparean con madres no marcadas. Los embriones preimplantacionales recolectados se analizan mediante espectrometría de masas para separar los metabolitos paternos (deuterados) de los maternos (no deuterados).

Resumen

La contribución paterna a la genética embrionaria se ha limitado hasta ahora a secuencias alélicas durante décadas. Una década de resultados sugiere, en cambio, que los factores epigenéticos (metilación del ADN, modificaciones de histonas, organización cromosómica y ARN reguladores) desempeñan un papel crucial en la herencia paterna e influyen en el desarrollo embrionario y la expresión génica del cigoto. Junto con los ácidos nucleicos, el metaboloma de los espermatozoides (lípidos, carbohidratos, aminoácidos libres) puede actuar como señal epigenética. Este protocolo tiene como objetivo identificar los metabolitos transferidos de espermatozoide a ovocito mediante espectrometría de masas. El procedimiento incluye el marcaje de isótopos estables de los espermatozoides con glucosa 2H2O oU 13C para rastrear, por metabolómica, los metabolitos paternos transferidos al ovocito durante la fecundación. El objetivo general del protocolo es revelar el papel del metaboloma del espermatozoide paterno en la susceptibilidad de la descendencia al dismetabolismo, y puede adaptarse para proporcionar información sobre cómo las condiciones ambientales, como la dieta y la exposición a contaminantes, alteran los mensajes metabólicos paternos, lo que podría afectar la salud y la predisposición de la descendencia a la diabetes, la obesidad y las enfermedades cardiovasculares.

Introducción

El epigenoma paterno influye en la susceptibilidad de la descendencia al dismetabolismo
A diferencia de la plétora de funciones pre y postconcepcionales que explotan las madres durante el desarrollo embrionario, durante décadas se ha pensado que la contribución de los espermatozoides es exclusivamente genética. De acuerdo con la teoría de la herencia genética, la contribución paterna a la variabilidad fenotípica de un individuo (incluida su susceptibilidad a la enfermedad) debía atribuirse exclusivamente a la secuencia genética de las variantes alélicas heredadas por vía paterna y a sus interacciones con las heredadas por vía materna1. Hoy en día, está claro que los alelos no son los únicos mensajes genéticos transmitidos por el padre a su descendencia durante la fecundación y que, en cambio, una multitud de señales epigenéticas contribuyen a la herencia paterna 2,3,4. Las señales epigenéticas identificadas hasta ahora incluyen: (1) grupos metilo agregados covalentemente a las citosinas del genoma parental 5,6,7, (2) modificaciones postraduccionales (acetilación, metilación) de histonas asociadas con los cromosomas de los espermatozoides y entregadas a los ovocitos8, (3) la organización 3D de los cromosomas paternos que conduce a la interacción intracromosómica (también conocida como dominios de asociación topológica, TAD) que persiste en el cigoto9,10, y (4) moléculas de ARN regulador (miARN, fragmentos derivados de ARNt y ARN que interactúan con piwi)11,12, así como ARNr13 y ARNt14 liberados por el espermatozoide en el ovocito durante la fertilización.

El epigenoma paterno es un importante vehículo de información para la progenie. La información paterna influirá en el cigoto, en el embrión durante su desarrollo y, después del nacimiento, en la propensión de la descendencia al desmetabolismo y a las enfermedades. Esta herencia no mendeliana (denominada intergeneracional o transgeneracional según si afecta a una o varias generaciones consecutivas), es considerada por muchos autores como uno de los factores encubiertos que contribuyen al aumento drástico de las enfermedades dismetabólicas que se producen en los países occidentales desarrollados15. En efecto, de acuerdo con las teorías PoHaD (Origen Paternal de la Salud y la Enfermedad) y DoHaD (Origen del Desarrollo de la Salud y la Enfermedad), la contribución epigenética de los padres es uno de los factores que predisponen a la descendencia a desarrollar diabetes, obesidad y enfermedades cardiovasculares en la edad adulta16,17. Curiosamente, el epigenoma parental es excepcionalmente susceptible a los estímulos ambientales y puede verse influenciado por condiciones metabólicas (como el consumo de drogas, hábitos dietéticos y aptitud metabólica)18, así como por parámetros estrictamente ambientales (como la exposición a contaminantes, las relaciones sociales y el estrés mental y relacional)5,11. Así, cada uno de los estímulos mencionados puede alterar los epigenomas de las células germinales (espermatozoides y ovocitos) e influir en las generaciones futuras.

El consumo de dietas altas en grasas (HFD) representa uno de los estímulos ambientales más estudiados, capaz de alterar el epigenoma paterno y conducir a mensajes deletéreos entregados a la descendencia19. Este estímulo afecta al fenotipo de la descendencia (hasta la tercera generación), que a menudo muestra una mayor propensión a desarrollar dismetabolismo, independientemente de su ingesta calórica. Los descendientes de padres que consumen HFD manifiestan retraso en el crecimiento, intolerancia a la glucosa y resistencia a la insulina tanto en ratones como en ratas20,21. En los seres humanos, la herencia epigenética se ha estudiado principalmente en las generaciones nacidas durante e inmediatamente después de períodos de hambruna o sobrealimentación22. En la cohorte de Överkalix, la disponibilidad de alimentos de los abuelos paternos durante su período de crecimiento lento se correlacionó con el riesgo de mortalidad general, enfermedades cardiovasculares, IMC, circunferencia de la cintura y masa grasa de sus nietos23. Recientemente, se han confirmado evidencias de transmisión intergeneracional paterna en otras cohortes24.

Metabolitos paternos implicados en la herencia intergeneracional
A pesar de la evidencia clínica y epidemiológica, los detalles moleculares de la herencia intergeneracional paterna siguen sin estar claros. Al principio, la identificación de todos los transductores moleculares de la información epigenética aún no se ha completado. La evidencia científica sugiere que el componente nucleico de los espermatozoides, por sí solo, no puede explicar la complejidad de la herencia intergeneracional. De hecho, se han medido variaciones en la metilación del ADN en los espermatozoides de ratones y ratas alimentados con HFD, pero en un porcentaje tan bajo de la población de espermatozoides que esto no puede explicar la alta penetrancia del fenotipo dismetabólico observada en la descendencia25. Por otro lado, el conjunto de ARN señalizadores transferidos de los espermatozoides a los ovocitos tiene una vida media muy corta y, aunque es capaz de influir en la expresión génica cigótica, parece poco probable que se mantenga en concentraciones efectivas después de la fertilización, en el cigoto en embriones de día 2 y día, en mórulas y en blastocistos. Así, parece evidente que nuevos determinantes moleculares deben estar implicados en el mecanismo de herencia intergeneracional.

Junto con los ácidos nucleicos, los espermatozoides también aportan componentes metabolómicos al cigoto, como lípidos, carbohidratos y aminoácidos 26,27,28,29. Estos metabolitos, en particular los dotados de actividades moduladoras, podrían influir en la expresión génica cigótica y en el desarrollo embrionario y, por lo tanto, podrían actuar como señales epigenéticas30. Además, al igual que los ácidos nucleicos, la concentración y la abundancia relativa de estos metabolitos en los espermatozoides pueden estar influenciadas por las condiciones ambientales experimentadas por el padre y, por lo tanto, representan vehículos de información para la descendencia28,30,31,32,33,34. De hecho, se ha demostrado que el metaboloma espermático de los espermatozoides maduros depende del estado de salud del padre y está influenciado por factores ambientales como la dieta, el ejercicio físico, las sustancias tóxicas y los disruptores endocrinos.

La comprensión del papel de los metabolitos de los espermatozoides en el desarrollo embrionario se complica por varias limitaciones técnicas: (1) la diferencia de tamaño entre el espermatozoide y el ovocito, que da como resultado una contribución mínima de masa metabólica del espermatozoide para el cigoto, y (2) las diversas variaciones metabolómicas que sufre el espermatozoide durante sus etapas de producción (espermatogénesis), maduración del epidídimo, eyaculación y fusión con el ovocito.

Fluctuación del metaboloma de los espermatozoides durante la maduración de los espermatozoides
En los mamíferos, los espermatozoides se producen en los testículos a través de la espermatogénesis, un proceso dependiente de células madre espermatogoniales por el cual las espermatogonias comprometidas se convierten en espermatocitos primarios que entran en meiosis y producen espermátidas haploides redondas. La morfogénesis de estas células en espermatozoides ocurre a través de la espermiogénesis, una remodelación morfofuncional masiva de las espermátidas, de células redondas a células alargadas/condensadas/altamente especializadas, que corresponden a la última fase de la espermatogénesis. Sin embargo, los espermatozoides resultantes son inmóviles y aún no son capaces de fecundar35. Después de la espermiación, a medida que los espermatozoides se liberan de la red testicular al epidídimo, los espermatozoides interactúan con las células epiteliales del epidídimo y se involucran con las proteínas y vesículas exosomales secretadas por estas células (epidídimos, ricos en esfingomielina y ácido araquidónico). El paso a través del epidídimo permite que los espermatozoides alcancen la madurez completa y, aunque se mantengan en un estado pre-capacitado, adquieren competencia para la motilidad36. Durante el tránsito del epidídimo, la membrana del espermatozoide se carga más negativamente y se enriquece en esfingomielina. La membrana espermática también se vuelve más fluida debido a una reducción progresiva del colesterol y un aumento concomitante de los ácidos grasos poliinsaturados (principalmente ácidos araquidónico, docosapentaenoico y docosahexaenoico). Después de la eyaculación, en el tracto genital femenino, las proteínas del líquido seminal y la albúmina promueven la capacitación de los espermatozoides al promover la hiperpolarización y la afluencia de calcio para activar la motilidad de los espermatozoides. La membrana plasmática de los espermatozoides capacitados presenta una mayor fluidez, una baja relación colesterol/fosfolípidos y una reducción del contenido de ácido siálico, gangliósido GM1 y triglicéridos31,37.

Antes de encontrarse con el ovocito, el espermatozoide sufre la reacción acrosómica, una fusión del acrosoma (un orgánulo membranoso derivado de Golgi que cubre la parte anterior del núcleo del espermatozoide y se forma durante la espermiogenisis) con la membrana plasmática del espermatozoide, que facilita la reorganización de la membrana plasmática del espermatozoide y la competencia para penetrar en la zona pelúcida (ZP), una matriz de glicoproteínas que rodea al ovocito35, Artículo 38. Como paso final, la hemifusión entre el espermatozoide y la membrana del ovocito, promovida por las proteínas espermáticas IZUMO1, SPACA6 y TMEM9539, da lugar a la incorporación de lípidos espermáticos en las membranas del ovocito y a la transferencia del contenido nucleico y metabólico al ovocito.

Justificación del procedimiento
El objetivo de este procedimiento es identificar los metabolitos transportados por el espermatozoide y transferidos al ovocito en el momento de la fecundación (Figura 1). Para distinguir entre los metabolitos derivados de los espermatozoides y los ovocitos en el cigoto, los espermatozoides se marcan con deuterio (2H, un isótopo de hidrógeno) o 13C (un isótopo de carbono) utilizando un marcado metabólico in vivo con óxido de deuterio, 2H2O40, o marcados uniformemente con U13C glucosa41. Los ratones machos marcados con isótopos se aparean con hembras no marcadas para recolectar cigotos, mórulas y blastocistos. Los embriones en etapa temprana se procesan para extraer (1) metabolitos polares, (2) metabolitos no polares y (3) esteroles. A continuación, los metabolomas se analizan mediante técnicas de espectrometría de masas. Los metabolitos marcados isotópicamente (paternos) se identificarán y distinguirán de los no marcados (maternos), demostrando inequívocamente su origen paterno.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Nápoles Federico II, Italia. Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Selección y agrupación de machos C57BL/6J

  1. Seleccione machos C57BL/6J de aproximadamente 12 semanas.
  2. Divida a los machos en dos grupos y asígneles el nombre MARCADO (sometido a un marcaje de isótopos estables) o SIN ETIQUETAR (utilizado como control y para medir la eficacia del marcaje de isótopos en espermatozoides y mórulas).
  3. Para vaciar el epidídimo de los espermatozoides no marcados, permita que los machos se apareen con hembras emparejadas.

2. Marcaje isotópico estable de machos C57BL/6J

  1. Si utiliza 2H2O para el etiquetado in vivo , prepare agua enriquecida al 10% v/v 2H2O para utilizarla como agua potable mezclando 100 mL de 2H2O con 900 mL de agua del grifo. Si utiliza U13C-glucosa para el etiquetado in vivo , prepare agua con 5%-15% de U13C-glucosa para utilizarla como agua potable disolviendo 50-150 g de U13C-glucosa en 1 L de agua del grifo;
    PRECAUCIÓN: El consumo prolongado de 2H2O es tóxico para los ratones. Establezca para cada cepa específica de ratón, la cantidad máxima de 2H2O que se debe agregar en el agua potable para lograr la máxima eficiencia de etiquetado y los mínimos efectos secundarios. El consumo prolongado de glucosa causa hiperglucemia y diabetes en ratones. Establezca la cantidad máxima de U13C-glucosa para agregar al agua potable para lograr la máxima eficiencia de etiquetado y los mínimos efectos secundarios.
  2. Reemplace las botellas de agua por aquellas que contengan agua potable marcada con isótopos y permita que los ratones la beban durante 2,5-5 semanas (cubriendo al menos la mitad de la espermatogénesis), renovando el líquido dos veces por semana.
  3. Al final del período de tratamiento, permita que los machos marcados se apareen con hembras superovuladas.

3. Superovulación de hembras C57BL/6J

  1. Seleccione hembras de aproximadamente 4 semanas con un peso entre 12,5-14 g, en edad prepuberal.
  2. Inducir la maduración del folículo mediante inyección intraperitoneal de 5 UI/50 μL/ratón de PMSG (Suero de yegua preñada).
  3. A las 47 h, inyectar por vía intraperitoneal la hormona luteinizante HCG (gonadotropina coriónica humana, 5 UI/50 μL/ratón) para favorecer la finalización de la maduración del folículo e inducir la ovulación y la formación del cuerpo lúteo.
  4. Después de la inyección de HCG, permita que las hembras se apareen con ratones ETIQUETADOS y NO ETIQUETADOS, de acuerdo con el paso 1 de la Figura 1.
  5. Después del apareamiento, realice el control del tapón vaginal42. Separe a las hembras positivas y enjaularlas.

4. Recogida embrionaria preimplantacional por lavado

  1. Sacrificar las hembras con tapón vaginal positivo siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente (2,5 días después del coito para recolectar mórulas).
  2. Coloque los animales en decúbito dorsal sobre la mesa; humedecer el abdomen con etanol al 70% y realizar una laparotomía amplia.
  3. Extirpar el útero de un lado pellizcando el cuello uterino y cortando en el extremo caudal del cuello uterino; por el otro lado, mediante un corte en el extremo del cuerno uterino (porción infundibular).
  4. Coloque los úteros en la placa de Petri con PBS para enjuagarlos y luego transfiéralos a otra placa de Petri limpia para evitar la presencia de residuos.
  5. Para enjuagar el útero, cargue una jeringa de 2,5 ml con el medio de cultivo y conéctela a una aguja Hamilton de punta roma de 33 G.
  6. Inserte la aguja en el infundíbulo del oviducto preparado como se describió anteriormente y lave todo el útero.
  7. Recoja las mórulas en una gota de medio de cultivo para lavarlas de cualquier residuo de mucosa y sangre.
  8. Transfiera las muestras recolectadas en nuevos tubos de recolección y agrúpelas en MORULAE MARCADAS y MORULAE NO MARCADAS, dependiendo de si se derivan de eventos de apareamiento que involucran toros MARCADOS o NO MARCADOS. Congele las muestras en nitrógeno líquido.
  9. Sacrificar un grupo de hembras superovuladas no apareadas (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente) con el fin de recolectar ovocitos no fertilizados. Transfiera las muestras recolectadas a nuevos tubos de recolección y etiquételos como OOCITOS NO ETIQUETADOS. Congele las muestras en nitrógeno líquido.

5. Recolección de espermatozoides de la cola del epidídimo

  1. Sacrificar sementales ETIQUETADOS o SIN ETIQUETAR.
  2. Colocar los animales en decúbito dorsal sobre la mesa, mojar el abdomen con etanol al 70% y realizar una laparotomía amplia.
  3. Retire el epidídimo y sumérjalo inmediatamente en 3 mL de PBS (pH 7,6) y córtelo sin apretar para drenar los espermatozoides de los conductos.
  4. Filtra las muestras de esperma a través de la gasa.
  5. Centrifugar los espermatozoides a 800 x g durante 10 min (a temperatura ambiente).
  6. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de agua desionizada fría. Solo los espermatozoides resistirán la solución hipotónica, mientras que los no espermatozoides explotarán.
  7. Centrifugar los espermatozoides a 800 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
  8. Etiquete los tubos y agrúpelos como ESPERMAS MARCADOS y ESPERMATOZOIDES NO ETIQUETADOS, dependiendo de si se recolectaron de sementales MARCADOS o NO ETIQUETADOS.
  9. Congele las muestras en nitrógeno líquido y almacene las muestras a -80 °C.

6. Extracción de lípidos y metabolitos polares

  1. Equilibrar la muestra de los pasos 1 a 5 a 4 °C en hielo.
  2. Añadir 225 μL de metanol helado (MeOH) a las muestras e incubar a -30 °C durante 1 min y, posteriormente, ponerlas en un baño sónico durante 10 min.
    1. Opcional: al establecer la condición experimental, agregue 0,1-2 ppm de clorhidrato C16-Ceramida-13 C3-15 N y L-Lisina-ε-15N como estándares internos para medir la eficiencia de la extracción de metabolitos polares y no polares, respectivamente.
  3. Agregue 750 μL de metil terc-butil éter (MTBE) frío como hielo en un termomezclador durante 1 h a 4 °C (550 rpm).
  4. Añadir 188 μL deH2O a las muestras después de centrifugarlas. Separar las fases superiores (lípidos) de la fase inferior (metabolitos polares) y secarlas.
    PRECAUCIÓN: El MeOH causa ceguera y daño al hígado, los riñones y el corazón si se ingiere. La sobreexposición tiene un efecto acumulativo en el sistema nervioso central. El MTBE puede causar irritación de la piel, los ojos y las vías respiratorias. Trabaje debajo de una campana extractora.
  5. Seque la muestra con un concentrador de vacío. Almacene las muestras secas a -80 °C hasta el análisis de masas/espectrometría.
    NOTA: Las muestras secas pueden almacenarse a -80 °C durante un máximo de 6 meses, a la espera de un análisis de espectrometría o masas. Para la identificación de metabolitos menos representados en los embriones preimplantatorios, podría ser necesario agrupar muestras obtenidas de la misma pareja de apareamiento y evento de apareamiento.

7. Extracción de esteroles

NOTA: Evite el uso de tubos y puntas de plástico [serán disueltos por el solvente orgánico no polar]; en su lugar, use tubos de vidrio y pipetas Pasteur de vidrio para dispensar líquidos.

  1. Equilibrar la muestra de los pasos 1 a 5 a 4 °C en hielo. Vuelva a suspender las muestras recogidas en 500 μL de una solución de metanol/H20 70% v/v y transfiera la suspensión a un tubo de vidrio.
    1. Homogeneizar por vórtice durante 30 s. Dejar el homogeneizado durante 16 h a 4 °C.
    2. Opcional: mientras establece la condición experimental, agregue 0.1-2 ppm del esterol vegetal Sitostanol-5,6,22,23-d4 como estándares internos para medir la eficiencia de la extracción de esteroles.
      PRECAUCIÓN: El MeOH causa ceguera y daño al hígado, los riñones y el corazón si se ingiere. La sobreexposición tiene un efecto acumulativo en el sistema nervioso central.
  2. Centrifugar la muestra a 3.220 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Transfiera el sobrenadante a un tubo de vidrio limpio y complémpelo con 500 μL de PBS.
  3. Agregue 7 mL de éter dietílico helado y vórtice durante 1 min. Deje reposar la muestra durante 1-2 minutos y espere a que se separe la fase. Congele sumergiendo el tubo en un baño de hielo seco / acetona. Transfiera la fase de éter dietílico descongelado a un tubo de vidrio recién etiquetado.
    PRECAUCIÓN: El éter dietílico es un líquido y vapor extremadamente inflamable y se descompone en peróxidos explosivos en el aire y la luz. No trabaje en contacto cercano con las llamas. El éter dietílico es peligroso si se ingiere y es dañino para la piel.
  4. Descongele la fase acuosa a 37 °C y repita el paso 4.3. Combine las fases del éter dietílico recogidas en los pasos 4.3-4.4 en un solo tubo de vidrio.
  5. Seque la muestra con un concentrador de vacío. Almacene las muestras secas a -80 °C hasta el análisis de masas/espectrometría.

8. Derivatización de muestras

NOTA: Las muestras se beneficiarían de la derivatización de TMS para el análisis de metabolitos específicos (colesterol, ácidos grasos, aminoácidos).

  1. Equilibrar las muestras a temperatura ambiente
    PRECAUCIÓN: El equilibrio incompleto puede causar condensación de agua atmosférica en las paredes de los tubos y las muestras. El agua compite severamente por la derivatización de TMS.
  2. Solubilizar las muestras en 50 μL de piridina y derivatizarlas añadiendo 25 μL de N,O-Bis(trimetilsilil(TMS)trifluoroacetamida (BSTFA). Incubar las muestras durante 90 min a 60 °C. Gire las muestras e inmediatamente proceda con el análisis GC-MS.
    PRECAUCIÓN: La piridina es inflamable, irritante y tóxica. El BSTFA es inflamable, corrosivo e irritante. Trabaje debajo de una campana extractora y use guantes protectores.

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Resultados

Con el fin de monitorear la transferencia de metabolitos del espermatozoide al ovocito, se recolectan y analizan mórulas aisladas de hembras C57 BL/6J apareadas con sementales de los grupos ETIQUETADOS y NO MARCADOS mediante metabolómica basada en espectrometría de masas. Los metabolitos se extrajeron como se describe en los pasos 6-7 y se derivatizaron con TMS como se describe en el paso 8. Se realizó un perfil metabolómico y lipidómico de mórulas MARCADAS, MÓRULAS NO MARCADAS, OVOCITOS NO MARCADOS, MARCADOS y SIN MARCA...

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Discusión

El protocolo descrito permite la identificación de los metabolitos transferidos de los espermatozoides a los ovocitos durante la fecundación mediante el uso de marcadores de isótopos estables en ratones machos con glucosa 2H2O oU 13C, seguido de un análisis metabolómico. Los metabolitos marcados isotópicamente que se encuentran en las mórulas son de origen paterno.

Aunque el hidrógeno y el deuterio son isótopos, no son completa...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2H2O filtrado, 99,8 % atómico 2HSigma Aldrich756822
AcetonaSigma Aldrich179124
Agilent  SIL-8Agilent (Santa Clara, CA, EE. UU.)
C16-Ceramida-13C3-15NEstándar LGCTRC-C342770-25MG
diclorometanoSigma Aldrich34856
Éter dietílico Sigma Aldrich673811
etanolSigma Aldrich1,11,727
HCG (gonadotropina coriónica humana,Sigma AldrichCG5-1VL
Clorhidrato de L-lisina-&épsilon;-15NSigma Aldrich608971
Hombres y mujeres  Ratones C57BL/6JOlaHsdInotiv C57BL/6JOlaHsd
metil terc-butil éter (MTBE)Sigma Aldrich306975
MetOHSigma Aldrich1,06,035
N,O-Bis(trimetilsilil(TMS)
trifluoroacetamida (BSTFA)		Supelco15238
PBSAplicarA0965-9010
PMSG (yegua preñada) s suero)Lee Biosolutions493-10
piridinaSigma Aldrich360570
Shimadzu GCMS 2010plus Shimadzu
Sitostanol-5,6,22,23-d4Sigma Aldrich680028
trifluoracetato de sodioSigma Aldrich1615138
SolariX XR 7T Bruker Daltonics
TimsTOF Pro Q-TOF Bruker Daltonics
U13C glucosa Sigma Aldrich389374
Ultimate RS3000 UHPLC Thermo Fisher Scientific
Precolumna VanGuard CSHTM (5,0 &tiempos; 2,1 mm; 1,7 μ m, 130 Å)Aguas

Referencias

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