Artículo de método

Detección rápida de virulencia y tipificación de Helicobacter pylori mediante la tecnología de etiquetado de puntos cuánticos

DOI:

10.3791/67792

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13 de junio de 2025

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1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Entre los numerosos métodos de diagnóstico para Helicobacter pylori, la inmunofluorescencia de puntos cuánticos puede tipificar y detectar rápidamente Helicobacter pylori, proporcionando una base para las decisiones clínicas de tratamiento. Este artículo proporciona una introducción detallada al valor de aplicación de la tecnología de puntos cuánticos en la tipificación y detección de Helicobacter pylori.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos un método basado en la tecnología de marcaje de puntos cuánticos para detectar rápidamente la virulencia de Helicobacter pylori y realizar la tipificación, con el objetivo de superar las limitaciones de los métodos de diagnóstico convencionales y proporcionar una base para el tratamiento clínico personalizado. Se diseñó un kit utilizando el método de sándwich de doble antígeno. Esto implicó una serie de pasos meticulosos, incluido el establecimiento de sistemas de reacción tampón y la realización de procesos de activación y acoplamiento para las reacciones antígeno-anticuerpo durante la preparación del kit. Además, existían procedimientos específicos para las operaciones de recolección, procesamiento y análisis de muestras para determinar el estado de infección y el tipo de virulencia de Helicobacter pylori. Mediante el establecimiento de modelos de datos para diferentes resultados (negativos, tipo II y tipo I), se verificó la eficacia de la tecnología de puntos cuánticos en la detección de tipeos. En el caso de las muestras negativas, hubo valores de señal débiles o no significativos en las áreas de detección relevantes. Para las muestras de tipo II, se observó un patrón específico de valores de señal positivos y negativos para diferentes anticuerpos, y para las muestras de tipo I, se observó un conjunto distinto de valores de señal positiva correspondientes a anticuerpos clave. Además, su aplicación en estudios relacionados con la gastritis crónica y el cáncer gástrico demostró su valor como indicador de cribado. El método basado en puntos cuánticos tiene ventajas como una mayor sensibilidad y especificidad en comparación con los métodos de diagnóstico tradicionales. Sin embargo, también se enfrenta a desafíos como los posibles impactos del tiempo de almacenamiento de muestras y los costos relativamente altos. Sin embargo, con las continuas innovaciones tecnológicas, se espera que desempeñe un papel más importante en el campo biomédico para la detección de Helicobacter pylori y el diagnóstico de enfermedades relacionadas en el futuro.

Introducción

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Helicobacter pylori (H. pylori) es una bacteria gramnegativa que se encuentra entre la mucosa pilórica y la submucosa del antro gástrico 1,2. En 1994, la Organización Mundial de la Salud/Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (OMS/IARC) lo clasificó como un carcinógeno de clase I. En función de si expresan citotoxina vacuolar A (VacA) y toxinas del gen A () relacionadas con la citotoxina, se dividen en dos tipos: Cepa virulenta de infección por H. pylori tipo I: más virulenta y más dañina para los pacientes. Estrechamente relacionada con la incidencia de úlceras gástricas, duodenales y cáncer gástrico, la infección por H. pylori tipo II involucra cepas de baja virulencia con patogenicidad débil, que generalmente se manifiesta como indigestión leve 3,4. Los investigadores han descubierto que la tasa de infección del tipo I es más alta que la del tipo II, siendo las tasas de infección del tipo I y del tipo II del 72,4% y del 27,6%, respectivamente5. La detección rápida de los tipos de H. pylori, especialmente la distinción entre el tipo I y el tipo II, es crucial para el tratamiento clínico y la prevención de enfermedades.

La gastritis crónica causada por la infección por H. pylori puede provocar enfermedades graves del sistema digestivo, como gastritis atrófica, úlcera péptica, adenocarcinoma gástrico y linfoma de tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT) en pacientes infectados 6,7,8. El Estudio sobre la Carga Mundial de Morbilidad 2014 predice que, a partir de 2010, aproximadamente 3,5 muertes por cada 100.000 personas serán causadas por la úlcera péptica cada año9. Los informes de investigación encontraron que casi 800,000 nuevos casos de cáncer gástrico en todo el mundo en 2018 estuvieron relacionados con la infección por H. pylori 10. En los últimos años, los estudios han encontrado que la infección por H. pylori también está estrechamente relacionada con enfermedades neurológicas, enfermedades cardiovasculares, diabetes, etc. La infección por H. pylori se ha convertido en un problema de salud pública mundial. Por lo tanto, la detección precisa de la infección por H. pylori es importante para la detección de enfermedades relacionadas. El tratamiento es crucial, lo que convierte a la detección precisa de H. pylori en un punto caliente de investigación.

Dado que la tasa de infección por H. pylori es alta en China, la detección oportuna y precisa de la infección por H. pylori es útil para la detección y el tratamiento tempranos y tiene una importancia positiva para la prevención y el tratamiento del cáncer gástrico. Existen varios métodos para detectar la infección por H. pylori, incluidos métodos invasivos como la prueba rápida de ureasa (RUT), la microscopía teñida de secciones de tejido de la mucosa gástrica, la endoscopia y la prueba de aliento con urea C13 o C14. (UBT), prueba de antígeno en heces de H. pylori (SAT) y otros métodos no invasivos 11,12,13. Estos métodos de detección tienen ciertas limitaciones. Por ejemplo, el examen histológico puede dar resultados falsos negativos debido a la calidad y el tamaño de la muestra de biopsia seleccionada en el sitio de la biopsia; la prueba del aliento puede verse afectada por el uso reciente de antibióticos o inhibidores de la bomba de protones (IBP) por parte del paciente y la influencia de diversos factores influyentes 11,14,15. En vista de las limitaciones de los métodos tradicionales, como la sensibilidad y especificidad lentas e insuficientes, el desarrollo de métodos de diagnóstico rápido basados en la inmunofluorescencia de puntos cuánticos (QD-IF) ha demostrado un gran potencial de aplicación en el campo de los bioensayos16,17. El análisis QD-IF introduce sondas fluorescentes de puntos cuánticos para lograr la detección específica de objetivos moleculares a través de la unión específica a objetivos moleculares18,19.

Los puntos cuánticos son nanopartículas semiconductoras con un radio menor o cercano al radio del excitón de Bohr, generalmente de 1 a 10 nm. Los puntos cuánticos se utilizan como sondas fluorescentes. Las señales de fluorescencia se generan mediante puntos cuánticos excitantes, y los datos cuantitativos se obtienen midiendo el dispositivo. Sus ventajas incluyen una amplia gama de longitudes de onda de excitación, longitudes de onda de emisión estrechas, tamaño de fluorescencia ajustable, alta sensibilidad, buena estabilidad óptica, larga vida útil de la fluorescencia, gran desplazamiento de Stokes y alta eficiencia de fluorescencia cuántica. Los puntos cuánticos superan las deficiencias de otros marcadores, como el corto tiempo de luminiscencia, los requisitos ambientales precisos, la poca repetibilidad, la poca estabilidad (como los tintes fluorescentes), la inactivación de enzimas y la baja sensibilidad. El inmunoensayo de fluorescencia de punto cuántico combina las ventajas del inmunoensayo de fluorescencia de punto cuántico y el inmunoensayo de fluorescencia de biomarcadores y tiene las ventajas de simplicidad, rapidez, alta especificidad y alta sensibilidad20,21.

Las herramientas diagnósticas tradicionales para la detección de H. pylori, como el cultivo bacteriano, la prueba de aliento con urea y las pruebas serológicas, tienen sus propias limitaciones. El cultivo bacteriano requiere mucho tiempo y condiciones estrictas de laboratorio, lo que a menudo resulta en una sensibilidad relativamente baja debido a los exigentes requisitos de crecimiento de H. pylori. La prueba de aliento con urea puede arrojar resultados falsos negativos en ciertas circunstancias, como el uso reciente de antibióticos o inhibidores de la bomba de protones 22,23,24. En algunos casos, las pruebas serológicas solo pueden indicar la exposición pasada en lugar del estado actual de la infección, y carecen de la capacidad de distinguir entre los diferentes tipos de virulencia del patógeno.

Por el contrario, la tecnología de inmunofluorescencia de puntos cuánticos (QD-IF) se ha convertido en una alternativa prometedora. QD-IF combina las excelentes propiedades ópticas de los puntos cuánticos, como la alta intensidad de fluorescencia, los espectros de emisión estrechos y la buena fotoestabilidad, con la especificidad de las reacciones inmunológicas. Esto permite una detección rápida y sensible de antígenos o anticuerpos de H. pylori en muestras biológicas. Además, tiene la ventaja única de poder identificar simultáneamente el tipo de virulencia de la cepa infectante, algo que los métodos tradicionales tienen dificultades para lograr. Al llenar este vacío en el proceso de diagnóstico, la tecnología QD-IF tiene un gran potencial para revolucionar la forma en que diagnosticamos y manejamos las infecciones por H. pylori , facilitando intervenciones médicas más personalizadas y efectivas.

En general, existe una necesidad clínica urgente de un método diagnóstico no invasivo y eficaz que pueda detectar la infección por H. pylori y sus tipos de virulencia (tipo I y tipo II) simultáneamente. Este artículo tiene como objetivo utilizar el método QD-IF para evaluar la presencia de infección por H. pylori en muestras de tejido y construir un método rápido y preciso para detectar los tipos de infección por H. pylori . La detección rápida de la infección por H. pylori y sus tipos de virulencia es de gran importancia para lograr una medicina de precisión, mejorar los efectos del tratamiento, reducir el riesgo de enfermedades relacionadas y prevenir el cáncer gástrico. Proporciona una base teórica científica para que el personal clínico elija métodos precisos de detección de la infección por H. pylori .

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Protocolo

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Este estudio (KY2025-191-01) se realizó siguiendo las directrices del comité de ética de investigación en humanos del Hospital Popular Provincial de Guangdong (Academia de Ciencias Médicas de Guangdong), Universidad Médica del Sur. Este artículo da cumplimiento a la solicitud de exención del consentimiento informado.

NOTA: Este estudio tiene como objetivo utilizar la tecnología de puntos cuánticos para diseñar y desarrollar un kit para diagnosticar si las especies de sangre de los participantes contienen anticuerpos contra la ureasa contra Helicobacter pylori (Urease), anticuerpos contra la citotoxina A (VacA) vacuolar y anticuerpos contra la toxina del gen A () relacionados con la citotoxina para determinar si H. pylori está infectado y si la cepa infectada es de tipo I o tipo II. Este kit diseñado utiliza un método de sándwich de doble antígeno para medir los anticuerpos Helicobacter pylori Urease, los anticuerpos y los anticuerpos VacA. Cuando la muestra de ensayo que contiene la sustancia objetivo se añade a la almohadilla de muestra, fluye a través de la almohadilla cuántica y la membrana mediante la acción del sifón, formando un complejo antígeno-anticuerpo en fase sólida. Después de la detección, el analizador lee la línea de detección y la masa respectivamente. El valor de la señal de la línea de control se utiliza para determinar el estado negativo y positivo del anticuerpo Urase, el anticuerpo y el anticuerpo VacA en función de los valores de señal T/C de cada uno de los tres anticuerpos. El diagrama de diseño se muestra en la Figura 1.

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Figura 1: Diagrama esquemático de la tarjeta de prueba de tipificación de H. pylori . La figura muestra la estructura y composición de la tarjeta de prueba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparación del kit

  1. Establecimiento de un sistema de reacción tampón de ácido etanosulfónico (MES) QDs-2-(n-morfina)
    1. Equilibre la solución QDs original a temperatura ambiente (RT). A continuación, aspire 1000 μL y añada un volumen igual de 2x solución MES (la concentración final de MES fue de 10 mmol/L).
    2. Mezclar, agitar y sonicar durante 30 s a 3 min.
  2. Activación
    1. Añadir 20 mg/mL de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)/N-hidroxisuccinimida (NHS) en el sistema tampón QDs-MES en una proporción de 10:1. Mézclalo, agítalo y sonicéalo durante 3 minutos.
    2. Colocar la solución preparada en un baño de agua a 37 °C durante 15 min y centrifugar a 13.000 × g durante 20 min.
    3. Retire el sobrenadante de la solución centrífuga y vuelva a disolverlo con 1x solución MES. Sople la solución repetidamente con una pipeta, agítela para mezclarla uniformemente y sonicéla durante 3 minutos.
    4. Coloque la solución anterior en un baño de agua a 37 °C durante 15 min y centrifugue a 13.000 × g durante 20 min.
  3. Acoplamiento
    1. Añadir 0,03 mg de antígeno de ureasa, antígeno, antígeno VacA e IgG anti-ratón de cabra a 1000 μL de la solución de activación, pipetear la punta repetidamente, agitar y sonicar durante 3 min.
    2. Coloque la solución anterior en un baño de agua a 37 °C y reaccione durante 3 h.
  4. Cierre y almacenamiento
    1. Añadir 100 μL de solución bloqueante (Tabla suplementaria 1) e incubar durante 1 h.
    2. Centrifugar la solución bloqueada a 13.000 × g durante 15 min.
    3. Retirar el sobrenadante de la solución centrifugada, añadir 750 μL de solución de reconstitución (Tabla suplementaria 1), pipetear repetidamente, agitar y sonicar durante 5 min, luego almacenar a 4 °C.

2. Preparación de placas revestidas

  1. Preparación de almohadillas cuánticas
    1. Diluya el complejo de antígenos de H. pylori marcado con puntos cuánticos 1:5 con tampón de dilución de puntos cuánticos para preparar la cantidad requerida de acuerdo con la producción por lotes.
    2. Tome la almohadilla cuántica y rocíe uniformemente una cierta cantidad de complejo de antígenos de H. pylori marcado con puntos cuánticos sobre la almohadilla con un rociador de película y seque a 37 °C durante 30 minutos.
  2. Preparación de la membrana
    1. Utilice el tampón de impresión para diluir los materiales de recubrimiento de la línea de control y la línea de prueba y prepare la cantidad requerida de acuerdo con el volumen de producción por lotes.
    2. Pegue la membrana de nitrocelulosa en la placa de cloruro de polivinilo (PVC), use un rociador de oro para rayar la película para cubrir uniformemente la línea de control de calidad y los materiales de la línea de prueba en la membrana, y seque a 57 °C durante 24 h.

3. Montaje

  1. Pegue los pads de cuanto y muestra en la placa de PVC recubierta con película en secuencia.

4. Corte en tiras

  1. Use un cortador de tiras para cortar la tabla grande ensamblada en tiras reactivas.

5. Embalaje interior

  1. Complete el empaque de acuerdo con los requisitos de composición del kit.
    NOTA: Los componentes del kit son los siguientes: (i) Tarjeta de prueba: Consta de una carcasa de tiras reactivas y una tira reactiva. La tira reactiva consta de una placa de PVC, una almohadilla de muestra, una almohadilla cuántica (un complejo de antígenos marcado con puntos cuánticos; el complejo contiene antígeno de ureasa, antígeno, antígeno VacA e IgG de ratón), una membrana de nitrocelulosa (el área de detección se fija con antígeno VacA, antígeno y antígeno ureasa (expresión eucariota de antígeno recombinante), y el área de control de calidad está recubierta con IgG anti-ratón de cabra (anticuerpo poli de cabra)), y papel absorbente. Las diferentes especificaciones de empaque tienen diferentes cantidades de tarjetas de prueba. Se requiere una tarjeta de prueba para el reactivo de una persona. (ii) Tarjeta SD: 1 pieza/caja. No se deben mezclar los componentes de la tarjeta de prueba y la tarjeta digital segura (SD) de diferentes lotes de kits de prueba.

6. Procesamiento de muestras

NOTA: Para la recolección de muestras, consulte los Procedimientos Nacionales de Operación de Laboratorios Clínicos.

  1. Recolecta sangre en un tubo de gel de separación. Tenga cuidado de evitar la hemólisis.
  2. Analice la muestra de suero separada dentro de las 4 horas a temperatura ambiente (RT). Si no se puede analizar a tiempo, almacene la muestra a 2-8 °C durante 3 días. Para a largo plazo (dentro de 1 año), séllalo y guárdalo por debajo de -20 °C.
  3. Restaure las muestras a RT y mézclelas bien antes de usarlas.
    NOTA: Las muestras congeladas y descongeladas deben descongelarse completamente antes de su uso, y el número de ciclos de congelación y descongelación no debe exceder los cinco. Las muestras congeladas y descongeladas repetidas pueden hacer que el analito se deteriore y deben evitarse. Las muestras graves de quilo y hemólisis también afectarán la prueba y deben evitarse.

7. Procedimiento para la prueba

  1. Saque el kit de reactivos y los materiales de control de calidad para equilibrar a RT.
  2. Preparación de la muestra: Centrifugar las muestras de sangre entera a 1467 g durante 10 min.
  3. Verifique que el número de lote de la tarjeta SD coincida con el del kit de reactivos. Inserte la tarjeta SD en el instrumento para la calibración automática.
  4. Encienda el instrumento y la computadora de operación. Inicie el software designado y seleccione el módulo Prueba . Elija Initialization Settings (Configuración de inicialización ) para inicializar el instrumento y esperar a que se complete correctamente.
  5. Acceda al área de reactivos del instrumento y retire la ranura de la tarjeta de prueba. Abra el kit de reactivos y seleccione el número requerido de tarjetas de prueba.
  6. Abra las bolsas de aluminio de las tarjetas de prueba y colóquelas en la ranura de acuerdo con la orientación indicada. Vuelva a insertar la ranura de la tarjeta en el área de reactivos del instrumento.
  7. Pruebas de control de calidad (QC)
    1. Dentro del módulo Prueba , seleccione Entrada manual. Haga clic en Entrada de información e ingrese la información específica del material de control de calidad. Haga clic en Generar. Coloque los materiales de control de calidad en el estante de muestras designado, asegurando el orden y la orientación correctos.
    2. Haga clic en Iniciar prueba para iniciar las pruebas de control de calidad. La aguja de muestra del instrumento aspirará 80 μL de la muestra y la dispensará verticalmente en el pocillo de la muestra. El instrumento comenzará a cronometrar automáticamente después de la dispensación de la muestra. Después de 15 minutos, el instrumento realizará la detección, leerá los valores de medición y emitirá los resultados.
  8. Pruebas de muestra: Dentro del módulo Prueba , seleccione LIS bidireccional. Coloque las muestras que se van a analizar en el estante de muestras designado, asegurando el orden y la orientación adecuados. Haga clic en Iniciar prueba. De manera similar, el instrumento aspirará 80 μL de muestra de cada uno y las procesará de manera idéntica al proceso de control de calidad.
  9. Una vez finalizada la prueba, retire las tarjetas de prueba usadas del instrumento y deséchelas como desechos médicos.

8. Control de calidad

  1. H. pylori negativo: Compruebe y asegúrese de que los resultados de los productos de referencia negativos para Helicobacter pylori , es decir, el anticuerpo Urease, el anticuerpo y el anticuerpo VacA, sean todos negativos.
  2. Infección por H. pylori tipo II: Comprobar y asegurarse de que el producto de referencia de Helicobacter pylori tipo II, es decir, el anticuerpo Urasa, es positivo, y que los resultados del anticuerpo y del anticuerpo VacA son todos negativos.
  3. Infección por H. pylori tipo I: Comprobar y asegurarse de que el producto de referencia contra Helicobacter pylori tipo I, es decir, el anticuerpo Ureasa es positivo, el anticuerpo y/o el anticuerpo VacA son positivos.

9. Análisis de resultados

  1. Infección tipo II con cepas débiles o no toxigénicas: cuando la lectura del anticuerpo Ureasa es positiva y las lecturas del anticuerpo y del anticuerpo VacA son negativas, interpretarlo como una infección con una cepa débil o no toxigénica de H. pylori .
  2. Infección tipo I con cepas productoras de toxinas altamente patógenas: cuando la lectura del anticuerpo Urease es positiva, y la lectura del anticuerpo o del anticuerpo VacA es positiva, o ambas son positivas, se interpreta como una infección por una cepa altamente patógena productora de toxina H. pylori .
  3. Negativo: Cuando las lecturas del anticuerpo Urasa, el anticuerpo y el anticuerpo VacA son todas negativas, interprete que no hay infección por cepas de H. pylori .
  4. No válido: Cuando el instrumento juzgue que el resultado no es válido, compruebe si hay un funcionamiento incorrecto o un fallo del kit de reactivos y vuelva a intentar el procedimiento.

10. Calibración del analizador de fluorescencia

  1. Primero, encienda el analizador y deje que se caliente durante unos 15 minutos para estabilizar su rendimiento. A continuación, inserte el patrón de calibración proporcionado por el fabricante en el portamuestras.
  2. A continuación, acceda a la función de calibración en la interfaz del analizador e inicie el proceso. El analizador detectará automáticamente la fluorescencia del patrón y ajustará sus parámetros internos en consecuencia para que coincidan con los valores de referencia preestablecidos.
  3. Después de eso, retire el patrón de calibración e inserte una muestra en blanco para verificar que las lecturas estén dentro del rango aceptable.
  4. Repetir regularmente estos pasos según el programa recomendado ayuda a mantener la precisión del analizador para obtener mediciones fiables.

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Resultados

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La Figura 2 muestra el principio de funcionamiento del inmunoanalizador de fluorescencia de punto cuántico. Consta principalmente de una fuente de luz de excitación, una fuente de luz receptora, un módulo de circuito de conversión fotoeléctrica, un circuito de procesamiento de señales, un circuito de conversión de valor AD y un módulo de cálculo de procesamiento de señales; La fuente de luz de excitación genera marcadores fluorescentes. Absorbe luz monocromática con una longitud de onda simi...

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Discusión

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Los métodos diagnósticos actuales para Helicobacter pylori se dividen principalmente en dos categorías: invasivos y no invasivos26. Métodos como la prueba rápida de ureasa (RUT), la histología, la biología molecular y el cultivo bacteriano tienen limitaciones en cuanto a invasividad, sensibilidad, especificidad, limitaciones de tiempo, costo, requisitos de equipo, manejo de muestras y monitoreo en tiempo real. Más comunes son los diagnósticos rápidos ...

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación fue financiada por el Proyecto del Fondo Provincial de Investigación Básica y Básica Aplicada de Guangdong (Nº de subvención: 2021A1515220022, 2022A1515220023).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1-(3-dimetilaminopropilo) -3-clorhidrato de etilcarbodiimida (EDC)Sigma25952-53-85 g / botella
2-(n-morfina) ácido etanosulfónico (MES)Sigma145224-94-8100 g / botella
CentrífugaAnalizador3K15
Guangzhou Labsim Biotech Co., LtdProvincia de Guangdong Registro de dispositivos médicos No.
Kit de prueba de tipificación 2017221743 Helicobacter pylori Chongqing iSIA BIO-Technology Co., LtdRegistro nacional de dispositivos médicos No. 20203400330QDs Método de inmunofluorescencia
Sal de sodio de N-hidroxitiosuccinimida (NHS)Sigma106627-54-71 g / botella
inmunológico de fluorescencia Sigma

Referencias

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Detecci n de Helicobacter pyloritipificaci n de la virulenciauni n ant geno anticuerporeactivos de inmunocromatograf as ndwich de doble ant genocribado de gastritis cr nicabiomarcadores de c ncer g stricocaracter stica operativa del receptorsensibilidad diagn stica

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