Artículo de método

Aislamiento y caracterización de neutrófilos de densidad baja y normal a partir de sangre total

DOI:

10.3791/67805

⸱

7 de febrero de 2025

 ,  , 
1TB Immunology Group, Department of Clinical Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, St James's Hospital, Trinity College Dublin, The University of Dublin

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, proporcionamos un enfoque confiable para aislar neutrófilos de densidad baja y normal de la sangre total utilizando aislamiento magnético (selección negativa) y medio de gradiente de densidad discontinuo. Garantiza el aislamiento intacto de las células de alta pureza (≥93%), lo que facilita el análisis preciso de las subpoblaciones de neutrófilos, crucial para comprender sus funciones en la salud y la enfermedad.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La investigación emergente muestra que la población de neutrófilos circulantes en los seres humanos consta de diversos subtipos y no debe estudiarse como una sola población, como se ha hecho históricamente. En particular, se ha demostrado que los neutrófilos de baja densidad y de densidad normal (LDN, NDN) tienen perfiles funcional y metabólicamente distintos, un factor que debe tenerse en cuenta al publicar investigaciones sobre neutrófilos. Aquí, presentamos un método modificado para el aislamiento y la separación intacta de LDN y NDN de la sangre completa.

El medio de gradiente de densidad (1,135 g/mL) se combina a 9:10 con PBS 10x. Posteriormente, se realizan gradientes de densidad específicos de 55%, 70% y 81% combinando el medio de gradiente de densidad del 100% con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x. Los neutrófilos aislados de 12 mL de sangre total periférica obtenida de donantes consentidos utilizando un kit de aislamiento magnético basado en selección negativa se resuspenden en la fracción del 55%. Un volumen de 3 mL de las fracciones del 81% y del 70% se coloca en capas en un tubo de 15 mL, seguido de la fracción del 55% que contiene el total de neutrófilos. A continuación, los gradientes de densidad se centrifugan a 720 x g durante 30 min. Se obtienen dos bandas distintas en la interfaz 55%/70% (LDN) y 70%/81% (NDN). Las células se pipetean cuidadosamente en tubos separados y se lavan con PBS. La pureza de las fracciones aisladas se determina mediante citometría de flujo. Tanto las LDN como las NDN se definieron como CD14lo CD15+ SSChi por citometría de flujo. La pureza del aislamiento se calculó en ≥93% de las células viables para ambos tipos.

Este método proporciona un enfoque fiable y eficiente para separar las LDN y las NDN de la sangre periférica, lo que garantiza una alta pureza y viabilidad de las células aisladas. La mejora de la precisión del aislamiento de neutrófilos facilita análisis posteriores más precisos de estas distintas subpoblaciones de neutrófilos. Estos son críticos para avanzar en nuestra comprensión de la heterogeneidad de los neutrófilos y sus implicaciones en diversos contextos fisiológicos y patológicos.

Introducción

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Los neutrófilos son células inmunitarias granulares y el leucocto más abundante en la sangre periférica, constituyendo alrededor del 50%-70% de los leucocitos en promedio. Se desarrollan en la médula ósea a partir de precursores de granulocitos y monocitos (GMP), que a su vez se desarrollan a partir de células progenitoras hematopoyéticas (HPC) en presencia del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF). En la homeostasis, tienen una vida útil de ~ 24 h, pero los estudios han demostrado que su vida útil se puede extender en condiciones fisiológicas específicas y sus microentornos asociados, como la activación inmune crónica1, la inflamación1 e incluso la residencia del tejido en estado estacionario2. Los neutrófilos se han considerado durante mucho tiempo la primera línea de defensa contra los patógenos y provocan sus efectos antimicrobianos a través de 3 funciones efectoras principales: degranulación, fagocitosis y activación y liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) (NETosis).

La mayoría de los estudios sobre la función y la biología de los neutrófilos examinan los resultados de la población total de neutrófilos. Sin embargo, a partir de los estudios en entornos oncológicos que delinean los subtipos N1 (antitumoral)/N2 (protumoral) hasta la clasificación de los neutrófilos en función de la madurez, la enfermedad y el estado fisiológico, e incluso la densidad celular (neutrófilos de baja densidad y densidad normal), se ha hecho cada vez más evidente que la población humana de neutrófilos constituye subtipos fenotípicamente diversos. Ya sea que la existencia de estos subtipos de neutrófilos pueda atribuirse a ser tipos de células completamente distintos o debido a la naturaleza compleja de la plasticidad, existe un creciente cuerpo de literatura sobre neutrófilos atípicos y presenta una oportunidad convincente para estudiar los neutrófilos de baja densidad separados de los neutrófilos de densidad normal3.

Descrito por primera vez en pacientes con LES como un subconjunto de neutrófilos proinflamatorios4, las LDN se han identificado desde entonces en enfermedades crónicas, embarazo e incluso en circulación sana, tanto en capacidad proinflamatoria como supresora 5,6,7,8. Las LDN se encuentran simultáneamente con las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) cuando la sangre entera se centrifuga en medios de gradiente de densidad. Su densidad específica corresponde aproximadamente a 1,077 g/mL, en comparación con los NDN a 1,083 g/mL9. Si bien todavía existe un debate considerable sobre el tema, existe especulación de que las LDN se asemejan a un fenotipo de granulocitos más inmaduro (similar a los promielocitos y mielocitos, con una densidad inferior a 1,080 g/mL)9,10. Otros todavía especulan que hay fenotipos de LDN maduros e inmaduros dependiendo de la presencia o ausencia de la enfermedad 11,12,13. Sin embargo, también se han detectado LDN en individuos sanos; sin embargo, su inclusión en algunos estudios es limitada debido a la dificultad de aislarlos en número suficiente5.

El objetivo de este estudio fue aislar estas dos poblaciones en cantidades que permitieran realizar experimentos metabólicos in situ posteriores (mínimo 0,5 × 106 células/mL). De este modo, se optimizó un protocoloexistente 5 con marcadores fenotípicos comúnmente reportados13,14 que proporcionan el mejor resultado para aislar y caracterizar las LDN y las NDN de la sangre total (Figura 1A).

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Protocolo

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Las muestras de sangre se recogieron con el consentimiento informado de los participantes sanos. El estudio recibió la aprobación del Comité de Ética de Investigación del Hospital St. James y del Hospital Universitario de Tallaght.

1. Preparación del medio de gradiente de densidad, fracciones de soluciones de trabajo isotónicas y tampón de separación celular

  1. Preparación de soluciones de trabajo isotónicas a partir de medio de gradiente de densidad
    1. Preparación de solución de trabajo isotónica al 100% (~1.123 g/mL)
      1. Para preparar la solución isotónica de trabajo al 100%, combine 27 mL de medio de gradiente de densidad con 3 mL de PBS 10x. Esto da como resultado una solución isotónica adecuada para diluciones posteriores.
    2. Preparación de solución de trabajo isotónica al 81% (~1,0996 g/mL)
      1. Prepare la solución de trabajo isotónica al 81% mezclando 8,1 mL de la solución de trabajo isotónica al 100% (preparada en el paso 1.1.1) con 1,9 mL de PBS 1x. Mezclar bien para asegurar la homogeneidad.
    3. Preparación de solución de trabajo isotónica al 70% (~1,0861 g/mL)
      1. Para preparar la solución de trabajo isotónica al 70%, combine 7 mL de la solución de trabajo isotónica al 100% con 3 mL de PBS 1x. Asegúrese de que la solución esté bien mezclada.
    4. Preparación de solución de trabajo isotónica al 55% (1,0676 g/mL)
      1. Prepare la solución de trabajo isotónica al 55% mezclando 5,5 mL de la solución de trabajo isotónica al 100% con 4,5 mL de PBS 1x. Homogeneizar.
  2. Estratificación de fracciones de gradiente
    1. Capas de fracciones de degradado
      1. Usando un tubo cónico de 15 mL, coloque cuidadosamente 3 mL de la solución de trabajo isotónica al 81% en la parte inferior. A continuación, coloque lenta y suavemente 3 mL de la solución de trabajo isotónica al 70% encima, evitando mezclar las capas. Este gradiente se utilizará para la separación de celdas.
  3. Preparación del tampón de separación celular
    1. Preparación de 500 mL de tampón de separación celular
      1. Para preparar el tampón de separación celular, combine un 2% de suero fetal bovino (FBS) y 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) con 1x PBS hasta un volumen total de 500 mL. Utilice este tampón para lavar y resuspender las células durante el proceso de aislamiento.
        NOTA: Asegúrese de que las capas estén bien separadas y sin alteraciones. En este protocolo, las soluciones de trabajo isotónicas se denominan "100%", "81%", "70%" y "55%" según el método de preparación, de acuerdo con estudios previos5. Sin embargo, es importante aclarar que estas etiquetas no representan las concentraciones finales reales de las soluciones de trabajo. Por ejemplo, el medio de gradiente de densidad "100%" se prepara mezclando 27 mL de medio de gradiente de densidad pura con 3 mL de PBS 10x, lo que da como resultado una concentración final de solución de trabajo isotónica al 90%. Las diluciones posteriores (por ejemplo, "81%", "70%" y "55%") reflejan de manera similar las proporciones de preparación en lugar de las concentraciones porcentuales reales. Esta nomenclatura se mantuvo para mantener la coherencia con la terminología utilizada en la literatura anterior sobre el tema.

2. Aislamiento de neutrófilos de sangre total mediante selección negativa

  1. Preparación de perlas magnéticas
    1. Agite las perlas magnéticas a fondo durante 30 segundos para asegurarse de que se resuspendan por completo antes de su uso.
  2. Preparación de la sangre
    1. Para cada donante, alícuota 4 mL de sangre entera en tres tubos separados de 14 mL de fondo redondo.
  3. Adición de cóctel de aislamiento de neutrófilos y perlas magnéticas
    1. Agregue 50 μL de cóctel de aislamiento de neutrófilos y 50 μL de perlas magnéticas por mL de sangre a cada tubo. Para 4 ml de sangre, agregue 200 μl de cada reactivo.
    2. Vuelva a suspender bien la mezcla pipeteando suavemente e incube a temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos para permitir que los reactivos se unan a las células no deseadas.
  4. Lavado y separación magnética - primera ronda
    1. Rellene cada tubo hasta 12 ml con un tampón de separación celular y mezcle bien.
    2. Coloque los tubos sin tapa en un imán y déjelos incubar a RT durante 10 minutos para permitir que las perlas magnéticas unidas a las células no deseadas sean atraídas a la pared del tubo.
  5. Colección de células no enlazadas
    1. Transfiera cuidadosamente la suspensión de células claras que contiene neutrófilos de cada tubo a un tubo nuevo y limpio utilizando una pipeta de transferencia. Retire el tubo original del imán.
  6. Reaplicación e incubación de perlas magnéticas - segunda ronda
    1. Vuelva a vórtice las perlas magnéticas durante 30 s. Agregue el mismo volumen de perlas magnéticas a la suspensión de celdas recién transferida que en el paso 2.3. Vuelva a suspender completamente e incube en RT durante otros 5 minutos.
  7. Separación magnética final y recogida
    1. Vuelva a colocar los tubos en el imán sin tapas e incube a RT durante otros 10 minutos.
    2. Transfiera con cuidado la suspensión de celda transparente a un tubo nuevo. Esta suspensión final representa la población total aislada de neutrófilos.

3. Separación de los neutrófilos de baja densidad (LDN) y los neutrófilos de densidad normal (NDN) de la población total de neutrófilos

  1. Agrupación y preparación de suspensiones celulares
    1. Para cada donante, agrupe las suspensiones de neutrófilos aislados en tubos de 50 ml. Rellene cada tubo hasta un volumen total de 50 ml utilizando el tampón de separación de células.
  2. Centrifugación
    1. Centrifugar los tubos a 400 x g durante 5 min a RT con el freno puesto.
  3. Resuspensión y recuento celular
    1. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender la pellets de neutrófilos en 1 mL de tampón de separación celular. Realice un recuento de células para determinar el número total de neutrófilos.
  4. Preparación del medio de gradiente de densidad
    1. Vuelva a centrifugar los tubos a 400 x g durante 5 min en RT con el freno puesto. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de neutrófilos en 3 mL del medio con gradiente de densidad del 55%. Para una resolución óptima, utilice 3 mL de medio con gradiente de densidad del 55% por cada 5-6 × 106 neutrófilos totales.
    2. Si es necesario, divida las células resuspendidas en varios tubos de gradiente de densidad prefabricados, asegurándose de que 3 ml de la suspensión celular estén en capas en cada tubo.
  5. Estratificación sobre tubos de gradiente de densidad
    1. Coloque lentamente la suspensión celular de 3 mL que contiene el medio de gradiente de densidad del 55% sobre los tubos de gradiente de densidad prefabricados (preparados como se describe en la sección 1). Asegúrese de que las capas sean cuidadosas para evitar alterar el degradado.
  6. Centrifugación en gradiente de densidad
    1. Centrifugar los tubos a 720 x g durante 30 min sin utilizar el freno. Después de la centrifugación, manipule los tubos con cuidado para evitar alterar las capas.
  7. Aislamiento de fracciones de neutrófilos
    1. Después de la centrifugación, observe que los neutrófilos se separan en dos capas distintas:
      Los neutrófilos de baja densidad (LDN) se ubicarán en la interfaz 55%/70%, formando una banda superior aproximadamente a la marca de 3 mL, y los neutrófilos de densidad normal (NDN) estarán en la interfaz 70%/81%, apareciendo como una banda inferior alrededor de la marca de 6 mL.
    2. Con una pipeta de transferencia, aísle cuidadosamente cada capa y transfiéralas a tubos separados de 15 mL.
  8. Lavado de fracciones aisladas
    1. Para lavar cualquier medio de gradiente de densidad residual, agregue 1x PBS a cada tubo de 15 mL hasta la marca de 15 mL.
    2. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a RT con el freno puesto. Si las celdas no forman un pellet firme y, en cambio, permanecen suspendidas, repita este paso de lavado, indicando la presencia de medio de gradiente de densidad restante.
  9. Recuento de células y aplicaciones posteriores
    1. Cuente las células de cada fracción y proceda con aplicaciones posteriores, como experimentos metabólicos, tinción por citometría de flujo, extracción de ARN o lisis de proteínas, según sea necesario.
      NOTA: Después de enchapar las celdas, se recomienda girar la placa a 210 × g durante 1 min (freno).

4. Fenotipado de LDN y NDN aisladas

  1. Aísle ~0.5-1 ×10 6 LDN y NDN. Haga una mezcla maestra de anticuerpos concentrados 2x usando CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, bloque Fc y tinción de viabilidad.
  2. Teñir las poblaciones aisladas de LDN y NDN con un volumen equivalente de la mezcla maestra de anticuerpos para que la dilución final de los anticuerpos que tiñen las células sea 1:100 (CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, bloque Fc) y 1:50 (tinción de viabilidad), respectivamente.
  3. Incuba las células durante 10 minutos en la oscuridad en RT.
    NOTA: Asegúrese de que las células estén completamente mezcladas con la mezcla maestra de anticuerpos y el bloque Fc.
  4. Lave las células una vez con PBS, luego centrifugue a 400 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
  5. Fije las células en paraformaldehído (PFA) al 1% durante 15 minutos en RT en la oscuridad.
  6. Lavar las células de nuevo con PBS, centrifugar a 400 × g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
  7. Vuelva a suspender las células en 200 μL de PBS o según sea necesario y adquiera las células en un citómetro de flujo lo antes posible.
    NOTA: Las células teñidas y fijadas pueden almacenarse a corto plazo a 4 ◦C en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo de los fluoróforos. Sin embargo, idealmente, el procedimiento de fenotipado debe llevarse a cabo inmediatamente después de la tinción y la fijación para garantizar una viabilidad celular óptima y resultados precisos.

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Resultados

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La estratificación exitosa de neutrófilos totales sobre el medio de gradiente de densidad se puede observar en la Figura 1B. Se deben obtener dos bandas distintas. Si se produce una mezcla de los gradientes, o el número total de neutrófilos estratificados por tubo es alto (mayor que aproximadamente 5-6 × 106), las bandas se verán difusas (Figura 1C) y el riesgo de que los dos subtipos de neutrófilos se mezclen aumenta significativamente. Para evitar e...

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Discusión

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Aquí, presentamos un método optimizado para dividir la población total de neutrófilos en neutrófilos de baja densidad y de densidad normal, junto con la caracterización fenotípica de cada tipo de célula mediante citometría de flujo adaptada de métodos anteriores5.

Este protocolo se basa en el aislamiento de LDNs y NDNs de sangre entera. Un paso crucial es que los neutrófilos totales se aíslan mediante métodos de selección negativa. Los ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen divulgaciones.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación en Salud EIA-2024-002 y el Royal City of Dublin Hospital Trust. Nos gustaría agradecer a la Dra. Lorraine Thong y al Dr. Kevin Brown por su ayuda en la recolección de muestras de donantes sanos para este manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de polipropileno de 14 ml de fondo redondo (17 x 100 mm)Corning Science352059
APC anti-humano CD14 (63D3)BioLegend367118
Brilliant Violet 421 anti-humano CD10 (25 pruebas)BioLegend312217
Dulbecco's Solución salina tamponada con fosfatoSigmaD8537-1L
EasyEights EasySep MagnetStemCell Technologies#18103
EasySep Buffer (tampón de separación celular)StemCell Technologies#20144
EasySep Kit de aislamiento directo de neutrófilos humanosStemCell Technologies#19666
FcR Reactivo de bloqueo, humanoMiltenyi Biotec130-059-901
FITC anti-humano CD16 (3G8)BioLegend302005
OneComp eBeads Cuentas de compensacióneBioscience Inc.01-1111-42
PE/Cy7 anti-humano CD86 (BU63)BioLegend374209
PE/Dazzle 594 anti-humano CD15 (SSEA-1)BioLegend323037
Tabletas de solución salina tamponada con fosfato Gibco18912-014
Zombie NIR Kit de Viabilidad Reparable BioLegend423105

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tracchi, I., et al. Increased neutrophil lifespan in patients with congestive heart failure. Eur J Heart Fail. 11 (4), 378-385 (2009).
  2. Ballesteros, I., et al. Co-option of neutrophil fates by tissue environments. Cell. 183 (5), 1282-1297.e18 (2020).
  3. Mckenna, E., et al. Neutrophils: Need for standardized nomenclature. Front Immunol. 12, 602963(2021).
  4. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis Rheumatol. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  5. Hardisty, G. R., et al. High purity isolation of low density neutrophils casts doubt on their exceptionality in health and disease. Front Immunol. 12, 625922(2021).
  6. Scapini, P., Marini, O., Tecchio, C., Cassatella, M. A. Human neutrophils in the saga of cellular heterogeneity: Insights and open questions. Immunol Rev. 273 (1), 48-60 (2016).
  7. Ssemaganda, A., et al. Characterization of neutrophil subsets in healthy human pregnancies. PLoS One. 9 (2), e85696(2014).
  8. Tay, S. H., Celhar, T., Fairhurst, A. M. Low-density neutrophils in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheumatol. 72 (10), 1587-1595 (2020).
  9. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. J Leukoc Biol. 107 (5), 809-818 (2020).
  10. Cowland, J. B., Borregaard, N. Isolation of neutrophil precursors from bone marrow for biochemical and transcriptional analysis. J Immunol Methods. 232 (1-2), 191-200 (1999).
  11. Blanco-Camarillo, C., Aleman, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Front Immunol. 12, 672520(2021).
  12. Park, J., et al. Low-density granulocytes display immature cells with enhanced NET formation in people living with HIV. Sci Rep. 13 (1), 13282(2023).
  13. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  14. Ui Mhaonaigh, A., et al. Low density granulocytes in anca vasculitis are heterogenous and hypo-responsive to anti-myeloperoxidase antibodies. Front Immunol. 10, 2603(2019).
  15. Mosca, T., Forte, W. C. Comparative efficiency and impact on the activity of blood neutrophils isolated by Percoll, Ficoll and spontaneous sedimentation methods. Immunol Invest. 45 (1), 29-37 (2016).
  16. Ren, Y., et al. Increased apoptotic neutrophils and macrophages and impaired macrophage phagocytic clearance of apoptotic neutrophils in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 48 (10), 2888-2897 (2003).
  17. Connelly, A. N., et al. Optimization of methods for the accurate characterization of whole blood neutrophils. Sci Rep. 12 (1), 3667(2022).
  18. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes in systemic autoimmunity and autoinflammation. Immunol Rev. 314 (1), 313-325 (2023).
  19. Yennemadi, A. S., Keane, J., Leisching, G. Mitochondrial bioenergetic changes in systemic lupus erythematosus immune cell subsets: Contributions to pathogenesis and clinical applications. Lupus. 32 (5), 603-611 (2023).
  20. Futoh, Y., et al. Peripheral low-density granulocytes after colorectal cancer surgery in predicting recurrence. BJS Open. 7 (1), zrac154(2023).
  21. Dwivedi, A., et al. Emergence of dysfunctional neutrophils with a defect in arginase-1 release in severe COVID-19. JCI Insight. 9 (17), e171659(2024).

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