Un protocolo eficiente para evaluar la modulación de la actividad de ERK en modelos tempranos de síndrome de Noonan de pez cebra mediante microscopía FRET en vivo e inmunofluorescencia

Giulia Fasano; Valeria Bonavolontà; Catia Pedalino; Martina Venditti; Graziamaria Paradisi; Stefania Petrini; Marco Tartaglia; Antonella Lauri

doi:10.3791/67831

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Un protocolo eficiente para evaluar la modulación de la actividad de ERK en modelos tempranos de síndrome de Noonan de pez cebra mediante microscopía FRET en vivo e inmunofluorescencia

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DOI:

10.3791/67831

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2 de mayo de 2025

Giulia Fasano¹ , Valeria Bonavolontà² , Catia Pedalino² , Martina Venditti² , Graziamaria Paradisi² , Stefania Petrini³ , Marco Tartaglia² , Antonella Lauri²

¹Research laboratories, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS, ²Molecular Genetics and Functional Genomics, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS, ³Microscopy facility, Research laboratories, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS

Autores correspondientes: Antonella Lauri <antonella.lauri@opbg.net>

En este artículo

Resumen

Las rasopatías son síndromes genéticos multisistémicos causados por la hiperactivación de la vía RAS-MAPK. Las variantes potencialmente patógenas que están a la espera de validación surgen continuamente, mientras que la escasa evidencia preclínica limita el tratamiento. Aquí, describimos nuestro protocolo in vivo para probar y validar los niveles de activación de ERK asociados a RASopatía y su modulación farmacológica durante la embriogénesis mediante imágenes FRET en vivo en pez cebra reportero.

Resumen

Las rasopatías son síndromes genéticos causados por la hiperactivación de ERK y que dan lugar a enfermedades multisistémicas que también pueden conducir a la predisposición al cáncer. A pesar de la amplia heterogeneidad genética, en la mayoría de los casos subyacen mutaciones de ganancia de función de la línea germinal en reguladores clave de la vía RAS-MAPK y, gracias a técnicas de secuenciación avanzadas, se siguen identificando variantes potencialmente patógenas que afectan a la vía RAS-MAPK. La validación funcional de la patogenicidad de estas variantes, esencial para un diagnóstico preciso, requiere protocolos rápidos y fiables, preferiblemente in vivo. Dada la escasez de tratamientos eficaces en la primera infancia, estos protocolos, especialmente si son escalables en modelos animales rentables, pueden ser fundamentales para ofrecer una base preclínica para el reposicionamiento/readaptación de fármacos.

Aquí describimos paso a paso el protocolo para la generación rápida de modelos transitorios de RASopatía en embriones de pez cebra y la inspección directa de los cambios vivos en la actividad de ERK asociados a enfermedades que ocurren ya durante la gastrulación a través de imágenes multiespectrales de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) en tiempo real. El protocolo utiliza un reportero ERK transgénico recientemente establecido e integrado con el hardware de los microscopios comerciales. Proporcionamos un ejemplo de aplicación para modelos de pez cebra con síndrome de Noonan (SN) obtenidos por expresión del Shp2^D61G. Describimos un método sencillo que permite el registro del cambio de señal de ERK en el modelo de peces NS antes y después de la modulación de la señal farmacológica por los inhibidores de MEK de dosis baja disponibles. Detallamos cómo generar, recuperar y evaluar señales FRET ratiométricas a partir de adquisiciones multiespectrales antes y después del tratamiento y cómo validar los resultados mediante inmunofluorescencia clásica en embriones enteros en etapas tempranas. A continuación, describimos cómo, mediante el examen de los parámetros morfométricos estándar, se pueden consultar los cambios tardíos en la forma del embrión, indicativos de un deterioro resultante de la gastrulación, en los mismos embriones cuya actividad de ERK se evalúa mediante FRET vivo a las 6 h después de la fertilización.

Introducción

Las rastopías son síndromes genéticos que alteran el desarrollo normal y afectan a diversos órganos y tejidos. Estas afecciones a menudo son causadas por mutaciones de ganancia de función (GoF) de la línea germinal en los genes clave y los actores involucrados en la señalización de RAS/MAK, lo que resulta en una hiperactivación (aumento de la fosforilación) de la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK). ERK regula algunos procesos fundamentales importantes durante el desarrollo, como el crecimiento de los tejidos, mediante la translocación al núcleo ^1,2. Las....