Establecimiento y evaluación de un modelo avanzado de fibrosis pulmonar basado en humanos in vitro

Summary

Se desarrolló un método de imagen para evaluar la activación de fibroblastos en cortes de pulmón humanos cortados con precisión basado en la proteína de activación de fibroblastos (FAP). Esta metodología establece una plataforma robusta y reproducible para estadificar la progresión fibrótica, avanzando en modelos in vitro traslacionales para el desarrollo terapéutico y manteniendo la fidelidad del microambiente del tejido humano.

Abstract

La fibrosis pulmonar se caracteriza por la destrucción irreversible de la estructura alveolar y el depósito excesivo de matriz extracelular. Aunque los modelos animales se han utilizado ampliamente en la investigación de la fibrosis pulmonar, ninguno de los modelos disponibles actualmente recapitula completamente la naturaleza progresiva de la FPI o su característica histológica definitoria, como los focos fibroblásticos. Los modelos in vitro avanzados, incluidos los cortes pulmonares de precisión (PCLS), a menudo se consideran el sistema de prueba pulmonar más relevante fisiológicamente y se han empleado con éxito para la detección de fármacos. Sin embargo, la incapacidad de diferenciar el grado de fibrosis en el pulmón de la FPI ha dado lugar a cegamiento e incertidumbre en el PCLS obtenido. Investigaciones anteriores demostraron que la proteína de activación de fibroblastos (FAP) podría evaluar la actividad profibrótica de la EPI, lo que podría contribuir al diagnóstico temprano y a la selección de ventanas terapéuticas adecuadas. En este estudio, se obtendrán 600 μm de PCLS de donantes sanos y pacientes con FPI utilizando un cortador de choque y se evaluarán utilizando sondas moleculares dirigidas a la FAP para determinar el grado de actividad de los fibroblastos en función de la intensidad de la señal fluorescente. Este enfoque proporciona un modelo in vitro avanzado y una técnica de evaluación para la investigación de la fibrosis pulmonar, lo que mejora la capacidad de estudiar los mecanismos de la enfermedad y evaluar las intervenciones terapéuticas.

Introduction

La fibrosis pulmonar (PF) es una forma frecuente de etiología desconocida y de pronóstico especialmente malo, con una mediana de supervivencia a cinco años de solo el 25%¹. El modelo de administración intratraqueal de bleomicina es actualmente el modelo animal más utilizado para estudios preclínicos². Sin embargo, la fibrosis inducida por la bleomicina es transitoria y se resuelve con el tiempo, lo que contrasta fuertemente con la naturaleza irreversible de la FPI³. Además, el modelo de bleomicina intratraqueal presenta desafíos significativos debido a la gravedad heterogénea de la fibrosis resultante de la administración endotraqueal, ya sea quirúrgica o no quirúrgica. Estas limitaciones de los modelos animales actuales contribuyen a la alta tasa de fracaso de los ensayos clínicos dirigidos a la FPI⁴.

Los cortes pulmonares cortados con precisión (PCLS) se han utilizado en una variedad de enfermedades porque preservan fielmente las redes de diafonía celular específicas de la enfermedad y el microambiente ^5,6,7. En la fibrosis pulmonar, el PCLS de los pulmones de FPI conserva la arquitectura del tejido nativo y la heterogeneidad celular, lo que permite la observación de varios tipos de células y las interacciones célula-matriz extracelular ^8,9, estableciéndolas como un modelo ex vivo representativo para la investigación de la fisiopatología pulmonar. Sin embargo, debido a que la fibrosis pulmonar se caracteriza por lesiones fibróticas heterogéneas en los pulmones, el muestreo de PCLS es inherentemente ciego. No es posible distinguir visualmente si las secciones obtenidas representan áreas fibróticas en la fase quiescente, en la fase activa o en el tejido pulmonar normal. Esta limitación subraya la necesidad de herramientas de evaluación visual y detección. Investigaciones anteriores encontraron que la proteína de activación de fibroblastos (FAP) se expresaba de manera alta y específica en el tejido pulmonar de los pacientes con FPI, lo que indica que la FAP podría evaluar la actividad profibrótica de la ILD¹⁰.

En este estudio, un anticuerpo de cadena única contra la FAP se marcó con verde de indocianina (ICG) para desarrollar una sonda de imagen molecular dirigida con una mayor penetración en el tejido. Las 600 μm de PCLS obtenidas de donantes sanos y pacientes con FPI se fotografiaron con esta sonda, y la actividad de los fibroblastos se evaluó en función de la intensidad de la señal fluorescente. Esta modalidad de imagen supera a las técnicas convencionales de evaluación de la fibrosis (Western blot, qPCR, tinción tricrómica de Masson o inmunofluorescencia) por su simplicidad de operación, manteniendo la integridad y viabilidad de la citoarquitectura, al tiempo que permite el seguimiento longitudinal de la progresión patógena. Más importante aún, es fácil de operar y requiere solo 90 minutos. Esto proporciona una herramienta de cribado avanzada para el modelo in vitro PCLS, lo que facilita la investigación de la fibrosis pulmonar.

Protocol

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Primer Hospital de la Universidad Médica de Guangzhou (2021G-29). El diagnóstico de FPI se basó en los hallazgos de la exploración física y la tomografía computarizada de tórax de alta resolución, siguiendo los criterios diagnósticos establecidos por ATS/ERS/JRS/ALAT (2022). Todos los especímenes de pacientes con FPI se obtuvieron mediante trasplante de pulmón o biopsia de pulmón. Se obtuvieron muestras de tejido pulmonar sano de donantes de órganos diagnosticados de muerte encefálica10. Se obtuvo el consentimiento por escrito para la recolección de tejido de cada paciente o de la familia del paciente antes de la recolección. Para obtener detalles sobre todos los materiales, soluciones e instrumentos utilizados en este protocolo, consulte la Tabla de materiales.

1. Preparación de PCLS humanos

NOTA: Los pacientes se someten a pruebas de detección rutinarias de virus como el VIH, el VHC o la sífilis antes del trasplante de pulmón o la biopsia, y deben dar negativo antes de continuar con los experimentos posteriores para garantizar la seguridad laboral del personal del laboratorio.

1. Preparación de soluciones
   1. Prepare la solución tamponada con fosfato (1× PBS) y preenfríe a 4 °C.
   2. Prepare la solución de agarosa al 2%. Pesar 2 g de agarosa y pasarla a un matraz Erlenmeyer. Agregue 100 mL de PBS, mezcle bien y caliente en un microondas hasta que la mezcla alcance un hervor vigoroso (≥95 °C), volviéndose completamente clara, homogénea y libre de partículas o rayas visibles. Agite el matraz de vez en cuando durante el calentamiento para evitar que hierva demasiado. Colocar la solución en un baño de agua a 37 °C hasta su uso.
2. Cortes de pulmón cortados con precisión
   1. Lave la superficie externa del tejido pulmonar con PBS para eliminar el exceso de impurezas y sangre.
   2. Utilice una jeringa de 20 ml (aguja de 1,2 mm) para aspirar un volumen adecuado de agarosa e insertarlo en la tráquea. Inyecte agarosa en los lóbulos pulmonares lentamente hasta que esté completamente inflado. Suspenda la inyección cuando encuentre una resistencia marcada para evitar fugas de agarosa.
      NOTA: Se requieren aproximadamente 10 mL de agarosa por cada bloque de tejido de 5 × 2 × 1 cm, evitando el desbordamiento. Para piezas de tejido más pequeñas, use una jeringa de 5 ml y moldes de inclusión (por ejemplo, moldes de silicona, bandejas de plástico o tubos de centrífuga cortados a medida) para ayudar a la incrustación. Vierta una capa base de agarosa de 1-2 mm de espesor en el molde y deje que se semisolidifique. Coloque suavemente el tejido pulmonar sobre la agarosa semisólida, luego vierta lentamente agarosa adicional para cubrir completamente el tejido, evitando burbujas. Deje que la agarosa se solidifique por completo.
   3. Coloque los pulmones en hielo durante aproximadamente 30 minutos para permitir la polimerización de la agarosa. Verifique la dureza y el enfriamiento de la pleura para confirmar la polimerización; Continúe enfriando si es necesario.
   4. Corta el tejido pulmonar en losas de 1-2 cm con una cuchilla afilada.
   5. Centre la bandeja del baño de hielo en el banco de corte y llénela con cubitos de hielo con anticipación para que se enfríe previamente.
   6. Encienda el interruptor de encendido y mantenga presionado el botón UP para elevar la etapa de muestra a una posición adecuada.
   7. Cargue con cuidado la hoja en el portacuchillos.
      NOTA: Manipule la hoja con cuidado para evitar lesiones. Deseche las cuchillas usadas en recipientes designados para objetos punzantes.
   8. Corta un trozo de cinta adhesiva de aproximadamente 3 cm de largo y 1 cm de ancho. Fije el lado adhesivo a la bandeja y cubra uniformemente el lado no pegajoso con adhesivo de cianoacrilato.
   9. Toma un pedazo de tejido pulmonar con fórceps. Seque la superficie con papel absorbente y colóquela sobre la cinta adhesiva. Presione suavemente para asegurar una adherencia firme.
   10. Una vez que el pegamento se asiente, cargue la bandeja en la bandeja del baño de hielo. Llene con PBS preenfriado hasta que el bloque de tejido esté sumergido.
   11. Ajuste la frecuencia de vibración a "10" y la velocidad de corte a "2". Presione el botón FWD para comenzar a cortar. Una vez que la primera rebanada esté completamente cortada, presione el botón STP para detenerse, luego presione el botón RVE para retraer la cuchilla. Deseche la primera rebanada.
   12. Gire manualmente la plataforma giratoria 6 veces para establecer el grosor de la sección en 600 μm. Presione el botón FWD para reanudar el corte y presione el botón STP después de cortar la sección. Presione RVE para retraer el cuchillo y recuperar el corte de pulmón con pinzas. Coloque la rebanada en PBS que contenga 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) y manténgala en hielo.
   13. Repita los pasos de corte anteriores para obtener PCLS adicionales, cada uno de aproximadamente 600 μm de grosor.
   14. Cuando el bloque de tejido actual esté casi agotado, reemplácelo con un nuevo bloque de tejido y repita los pasos 1.2.4 a 1.2.13.

2. Purificación del anticuerpo FAP

NOTA: Genere el anticuerpo de dominio único específico de FAP que contiene una etiqueta His C-terminal como se describió anteriormente^11,12.

1. Realice la visualización de fagos para permitir la selección de alto rendimiento de fragmentos de anticuerpos específicos de FAP (scFv) mediante el paneo repetitivo de bibliotecas combinatorias contra objetivos inmovilizados o en fase de solución. Recupere los fagos ligados a través de un lavado y elución estrictos. Amplifica los fagos reinfectando E. coli y enriquece los aglutinantes objetivo durante 3-4 ciclos. Validar clones utilizando ELISA de fagos y secuenciación de ADN para identificar anticuerpos de alta afinidad¹².
2. Clonar la secuencia de ADN que codifica el fragmento variable de cadena simple anti-FAP en el vector pET-28a(+) fusionado con una etiqueta His para la expresión en E. coli¹³.
3. Transformar el plásmido recombinante en células de E. coli BL21 (DE3). Inducir la expresión de proteínas utilizando isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en cultivos de matraces incubados durante la noche a 20 °C¹⁴.
4. Purifique el anticuerpo FAP del sobrenadante utilizando perlas de ácido níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA). Realice el intercambio de búfer con PBS para aplicaciones posteriores.
5. Evaluar la pureza de los anticuerpos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Una sola banda dominante al peso molecular esperado indica una alta pureza.

3. Evaluación de la afinidad de los anticuerpos FAP

1. Cultivo de células embrionarias de riñón humano 293T (HEK 293T) en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina.
2. Agregue lentivirus que sobreexpresa la proteína de activación de fibroblastos humanos (hFAP) a las células 293T con una confluencia del 90%. Incubar durante 96 h para generar una línea celular estable de 293T-hFAP.
3. Digiera las células 293T y 293T-hFAP con tripsina-EDTA al 0,25% y recoja las células.
4. Lave las células con PBS e incube con el anticuerpo FAP seguido de Alexa Fluor 488 anti-His IgG.
5. Analice la intensidad de fluorescencia utilizando un citómetro de flujo NovoCyte^15,16.

4. Etiquetado de la sonda de molécula scFv-FAP-ICG

1. Ajuste la concentración de FAP-scFv a 2 mg/mL usando PBS.
2. Agregue éster de indocianina verde NHS (ICG-NHS) para lograr una relación molar de 5:1 (ICG-NHS:FAP-scFv).
3. Mezcle bien mediante vórtice y agitación.
4. Incubar la reacción en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 h.
5. Retire el tinte suelto con una columna de desalinización. Almacene el producto conjugado final a 4 °C en la oscuridad.

5. Sonda molecular scFv-FAP-ICG para evaluar el grado de actividad de fibroblastos en PCLS

1. Después de cortar el PCLS, coloque una sección por pocillo en una placa de 12 pocillos. Enjuague cada pocillo dos veces con 1 mL de PBS para eliminar la sangre y los desechos residuales.
2. Sumerja el PCLS en 1 mL DMEM sin FBS. Añadir scFv-FAP-ICG a una concentración final de 5 μg/mL. Incubar en un agitador a temperatura ambiente durante 1 h con una agitación suave, protegido de la luz.
3. Lave las muestras con PBS tres veces, cada una durante 5 min.
4. Adquiera imágenes de fluorescencia ICG de PCLS utilizando el sistema de imágenes animales in vivo con los siguientes ajustes: longitud de onda de excitación a 785 nm y longitud de onda de emisión a 810 nm.
5. Evaluar la actividad de fibrosis de PCLS en función de la intensidad de la fluorescencia. Defina regiones de interés (ROI) utilizando software compatible, con radiación de fluorescencia expresada como fotones/s/cm²/sr.
   1. Haga clic en el botón Seleccionar ROI para permitir que el software delinee automáticamente el área pseudocoloreada. Si la ubicación del ROI es inexacta, ajústela manualmente. Haga clic en Calcular para determinar la intensidad de la señal dentro de la región. Si se seleccionan varias subregiones, sume los valores de todas las subregiones.

Results

El procedimiento de preparación para el PCLS del tejido pulmonar humano se describe en la Figura 1. El tejido pulmonar humano se incrustó en agarosa y posteriormente se recortó en bloques de tejido de aproximadamente 1^cm3 de tamaño con una hoja de afeitar. Los tejidos recortados y aplanados se fijaron a una plataforma para seccionarlos a 600 μm de espesor utilizando un micrótomo (Figura 1A,B). Los PCLS se incubaron en placas de 12 pocillos (

Discussion

A través de los métodos de investigación anteriores, se prepararon PCLS de donantes sanos y pacientes con FPI. Simultáneamente, se utilizaron células de mamíferos para expresar fragmentos variables de cadena simple de FAP, y se verificó su pureza y especificidad. Se empleó una sonda molecular dirigida a la FAP y marcada con ICG para detectar los niveles de expresión de FAP, lo que refleja el grado de activación de los fibroblastos. Este enfoque proporciona un método de evaluación avanzad...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 % tripsina-EDTA	Gibco	15050-057
2&veces; Color SYBR Green qPCR Master Mix (ROX2)	EZBioscience	A0012-R2
Jeringa de 20 ml	Winner	V532159
293T célula	Beyotime	C6008
502 pegamento	Zhuolide	D-40
Agarosa, baja temperatura de gelificación	Sigma Aldrich	A9414-25G
Anticuerpo anticolágeno I	abcam	ab138492
Anticuerpo anti-Fibronectina	abcam	ab2413
Anti-His-tag mAb-Alexa Fluor 488	MBL	D291-A48
BL21	Beyotime	D1009S
Blade	de color Gillette	7in83a7Q
con removedor de ADNg)	EZBioscience	A0010CGQ
Coomassie Blue Super Fast Solución de tinción	Beyotime	P0017F
DMEM	Gibco	12800017
Matraz Erlenmeyer	Sichuan Shunbo	GG-17
FAP Rabbit mAb	CST	66562
FBS	Gibco	10099-141
Pinzas	Roboz	RS-5135
ICG-NHS	Ruixibio	R-TE-157
IPTG	MCE	367-93-1
microbalanza	Secura	Secura225D-1CN
microondas	Mideo	PM2002
Sistema de imágenes animales in vivo multimodo	BioLight	AniView600
Ni-NTA	Genscript	L00250
Citómetro de flujo NovoCyte	ACEA  Biosciences	Novocyte
PBS	Gibco	10010023
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122
SDS-PAGE	Beyotime	P00528
Purificación universal de ARN	EZBioscience	EZB-RN4
Vibratome	DOSAKA	DTK-1000N
β-actin Rabbit pAb	Yeasen	30102ES
Primer
β-actin primer-F	iGenebook Biotech		CATGTACGTTGCTATCCAGGC
β-actin primer-R	iGenebook Biotech		CTCCTTAATGTCACGCACGAT
FAP primer-F	iGenebook Biotech		TTGAGTGGATGGGAGGGAT
FAP primer-R	iGenebook Biotech		GCTGTGCTCGTGGATTTGT
Imprimación de colágeno-I-F	iGenebook Biotech		GAGGGCCAAGACGAAGACATC
Imprimación de colágeno-I-R	iGenebook Biotech		CAGATCACGTCATCGCACAAC
Imprimación de fibronectina-F	iGenebook Biotech		CGGTGGCTGTCAGTCAAAG
Imprimación de fibronectina-R	iGenebook Biotech		AAACCTCGGCTTCCTCCATAA