Este estudio evalúa la tolerancia a la sequía mediada por Arabidopsis DREB1A en caña de azúcar transgénica. Bajo estrés, se observó una mejor fotosíntesis, eficiencia en el uso del agua y acumulación de biomasa. DR-21 exhibió la expresión más alta de DREB1A , mejorando la resiliencia a la sequía. Los hallazgos proporcionan información sobre los mecanismos moleculares y ofrecen una estrategia potencial para desarrollar variedades de caña de azúcar resistentes al clima en regiones con escasez de agua.
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Artículo de investigación
Mejora de la fotosíntesis y la eficiencia en el uso del agua en caña de azúcar transgénica que expresa Arabidopsis DREB1A bajo estrés por sequía
En este artículo
Resumen
Resumen
El estrés por sequía impone una limitación crítica a la productividad de la caña de azúcar, lo que requiere el desarrollo de cultivares resistentes al estrés para una agricultura sostenible. El presente estudio tuvo como objetivo mejorar la tolerancia a la sequía en la caña de azúcar mediante la introducción del gen DREB1A de Arabidopsis bajo el control del promotor rd29A inducible por estrés. Las líneas transgénicas de caña de azúcar se generaron mediante transformación mediada por bombardeo de partículas y posteriormente se evaluaron mediante evaluaciones moleculares, fisiológicas y agronómicas en condiciones controladas y de estrés por sequía.
El análisis molecular confirmó la integración estable de transgenes, con líneas transgénicas que exhiben un aumento de hasta 10 veces en la expresión de DREB1A en relación con las plantas de tipo silvestre. Las evaluaciones fisiológicas demostraron que, bajo estrés por sequía al 60% de la capacidad de campo (FC), las líneas transgénicas mantuvieron tasas fotosintéticas (PN) que fueron 224-270% más altas, la conductancia estomática (g s) aumentó en un 84-167% y el contenido relativo de agua (RWC) aumentó en un 25-31% en comparación con los controles notransgénicos. Además, las hojas de caña de azúcar transgénica mostraron una mejor regulación osmótica y eficiencia en el uso del agua. Las evaluaciones agronómicas revelaron además mejoras significativas en el crecimiento y la productividad de las plantas. Bajo estrés por sequía (60% FC), las líneas transgénicas exhibieron un 76-109% más de altura de caña, con un diámetro de caña 71-86% mayor. La biomasa de brotes aumentó en un 39-87% y la biomasa de raíces aumentó en un 65-103%.
Además, el porcentaje de Brix, indicativo de acumulación de sacarosa, aumentó entre un 36 y un 55% en las plantas transgénicas al 60% FC. Estos hallazgos establecen una correlación sólida entre la expresión de DREB1A , la mejora de la resiliencia fisiológica y la mejora del rendimiento agronómico en condiciones de sequía. La capacidad de la caña de azúcar transgénica que expresa DREB1A para mantener una mayor actividad fotosintética, una eficiencia superior en el uso del agua y una mayor acumulación de biomasa subraya su potencial como estrategia genética para desarrollar variedades de caña de azúcar resistentes a la sequía. Este estudio ofrece nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la tolerancia a la sequía y proporciona un enfoque prometedor para garantizar el cultivo sostenible de la caña de azúcar en regiones con escasez de agua.
Introducción
La caña de azúcar (Saccharum officinarum L.) es el segundo cultivo comercial más importante de Pakistán, cultivado principalmente por su alto contenido de sacarosa. Sin embargo, rara vez se logra una producción óptima debido a la escasez periódica de agua 1,2. Es miembro de la familia de gramíneas Poaceae y se agrupa en el clado PACCAD de la subfamilia Panicoideae3. Los miembros de este clado a menudo se denominan pastos de estación cálida y exhiben un sistema fotosintético C4 4. El modo primario de fijación de CO2 en la caña de azúcar es la fotosíntesis de C4 con fotorrespiración mínima5. Las gramíneas C4, como la caña de azúcar, pueden fijar másCO2 que las gramíneas C3, produciendo niveles más altos de sacarosa y exhibiendo una mejor eficiencia en el uso de nitrógeno (NUE) y eficiencia en el uso del agua (WUE)6,7,8. Sin embargo, los requisitos de humedad del suelo para la caña de azúcar son bastante altos 9,10,11.
Debido al clima cambiante y la disponibilidad limitada de agua, es crucial producir variedades de caña de azúcar tolerantes al estrés hídrico de alto rendimiento 12,13,14. La tolerancia de las plantas al estrés hídrico es un rasgo multigénico influenciado por la intensidad, el tiempo y la duración del estrés. Debido a la ubicación geográfica de Pakistán (30.3753° N, 69.3451° E), las prácticas convencionales de mejoramiento no son factibles debido a la baja floración y viabilidad del polen15. Por lo tanto, el mejoramiento varietal a través del mejoramiento tradicional depende de la variación genética y de la posterior selección de los rasgos agronómicos deseados16. En este contexto, la transformación de genes relacionados con el estrés a través de la ingeniería genética es uno de los enfoques alternativos más prometedores para mejorar la tolerancia al estrés de las plantas 17,18,19.
Las respuestas al estrés abiótico en las plantas están reguladas por múltiples familias de factores de transcripción (TF) y elementos que actúan contra cis, incluidos WRKY, MYB, bHLH, ERF y NAC. Estos TF regulan las redes en el ajuste osmótico, la eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS), la regulación estomática y las vías de señalización de estrés 20,21,22,23,24,25,26. Por ejemplo, los TF WRKY modulan la señalización del estrés a través de vías dependientes de ABA, mientras que las proteínas MYB regulan la biosíntesis de flavonoides y la función estomática bajo estrés por sequía27. De manera similar, los factores bHLH y ERF interactúan con la señalización del etileno, mejorando así la resiliencia a la sequía28. Dada la complejidad de las respuestas al estrés, apuntar a reguladores clave como DREB1A es una estrategia prometedora para mejorar la tolerancia a la sequía.
En este estudio, investigamos el papel de ArabidopsisDREB1A en la caña de azúcar transgénica, centrándonos en su impacto en la fotosíntesis, las relaciones hídricas y los rasgos de rendimiento en condiciones de estrés hídrico. El papel de las proteínas de unión a DRE (DREB) en la modulación de la tolerancia al estrés hídrico se ha informado previamente 27,29,30. Por ejemplo, Kasuga et al. observaron que DREB regula positivamente la expresión de la secuencia DRE en Arabidopsis thaliana31. Además, muchos investigadores han sugerido que la caña de azúcar transgénica que sobreexpresa DREB1A exhibe una expresión constitutiva de genes inducibles por estrés y niveles de azúcar más altos que la caña de azúcar de tipo salvaje 17,28,32,33.
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Protocolo
Generación de rd29A: Vector de expresión DREB1A (Figura 1)
El marco de lectura abierto de longitud completa de DREB1A (ORF, 651 pb) se amplificó a partir de Arabidopsis thaliana L. ADNc utilizando cebadores específicos de genes que incorporan sitios de restricción BamHI y EcoRI: 5 / -GGCGGATCCATGAACTCATTTTCTGCT-3 / hacia adelante y 5 / -GGCGAATTCTTAATAACTCCATAACGA-3 /. De manera similar, el promotor rd29A (499 pb) se amplificó a partir del ADN genómico de Arabidopsis utilizando cebadores que contenían sitios KpnI y BamHI: 5 / -GCGGGTACCCCTATTAGAACGATTAAGGAG-3 / y 5 / -GGCGGATCCGGTGGTTCCTCTGTTTGATCC-3 /. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen de 25 μL que contenía 2,5 μL de tampón de PCR 10x, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 0,4 μM de cada cebador, 1 U de ADN polimerasa Taq y 1 μL de molde de ADN (aproximadamente 100 ng para ADN genómico o 50 ng para ADNc), con agua libre de nucleasas añadida al volumen final. Las condiciones de amplificación para los fragmentos promotores de DREB1A y rd29A fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min; 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 s, recocido a 58 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 1 min; seguido de una extensión final a 72 °C durante 7 min. Los productos amplificados se resolvieron en un gel de agarosa al 0,7% y se purificaron con gel utilizando un kit de extracción de gel de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Los productos de PCR promotores amplificados de DREB1A y rd29A se clonaron en el vector de clonación, pTZ57R/T, mediante clonación de TA, y los productos se sometieron a secuenciación de Sanger para su confirmación. La secuencia DREB1A (Nº de acceso AM992886) se envió a GenBank (el promotor rd29A se insertó en los sitios KpnI y BamHI, y la secuencia codificante DREB1A se insertó aguas abajo en los sitios BamHI y EcoRI, reemplazando así el promotor 2x35S original y posicionando DREB1A bajo el control de rd29A. El casete final (rd29A::DREB1A::CamV) se extirpó utilizando KpnIy EcoRV y se clonó en la región T-DNA del vector binario pGA482 para generar la construcción utilizada para la transformación de plantas (Figura 1). Después de la secuenciación inicial de Sanger para validar los productos clonados, no se llevó a cabo ninguna verificación de secuenciación adicional.
Análisis de secuencias genéticas
Utilizando la herramienta bioinformática referenciada, se realizó un análisis filogenético de las secuencias de proteínas de AtDREB1A y DREB1 de 13 especies diferentes de dicotiledóneas y monocotiledóneas y se comparó mediante el método de unión de vecinos. Las secuencias de aminoácidos se recuperaron de Phytozome (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) y GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). El análisis de alineación de secuencias múltiples se realizó utilizando el programa en línea Clustal Omega. Una vez que se han adquirido las secuencias esenciales de Phytozome y GenBank, no es necesaria más recuperación de secuencias.
Preparación de explantes y pistola de inducción de callos20,34
El cultivar de caña de azúcar se cultivó en el campo experimental de NIBGE, Faisalabad. Después de 6 meses, la parte superior de la caña sana se extirpó para recuperar la región apical, que se recortó hasta la yema terminal. En condiciones estériles, los rollos de hojas se pelaron en segmentos cilíndricos de ~ 5 mm y se esterilizaron en superficie con etanol al 70%. De la región inmediatamente superior al meristemo apical, se prepararon aproximadamente 10-15 discos apicales (~ 3 mm de tamaño) por caña. Los discos se cultivaron en el medio de inducción de callos (CIM) como se describió anteriormente 1,20,34. Después de 4-6 semanas, los callos embriogénicos resultantes se subcultivaron en CIM fresco para una mayor proliferación. NOTA: El uso de etanol al 70% para la desinfección de superficies se consideró suficiente y no se requirieron pasos de esterilización adicionales.
Transformación genética de rd29A: DREB1A en caña de azúcar a través de Gene Gun20,34
El callo embriogénico proliferado estaba dispuesto en el centro de la placa de Petri que contenía CIM. Después de 3 días, los calli fueron bombardeados con un vector binario expresable por plantas recubierto de oro, pGA482, que contenía rd29A: DREB1A, utilizando un cañón biolístico PDS-1000 / He como se describe en detalle34. Después del bombardeo, se cultivaron pequeñas porciones de callos en CIM durante 3 días y se colocaron en la oscuridad a 26 ± 2 oC. Luego, los callos se cultivaron en un medio de selección de callos (CSM) que contenía 60 mg/L de geneticina, se subcultivaron en CSM cada 10 días y se colocaron en la oscuridad a 26 ± 2 oC.
Después de 30 días, se cultivaron callos sanos en un medio de selección de regeneración (RSM) que contenía 60 mg/L de antibiótico para obtener brotes. Las placas se colocaron en una sala de crecimiento durante 4 semanas a temperatura controlada (26 ± 2 °C), fotoperíodo claro/oscuro de 16 h/8 h, intensidad de luz de 500 μmol m-2 s-1 y humedad controlada35. Los brotes sanos regenerados se cultivaron en medio de selección de enraizamiento (RtSM) que contenía 60 mg/L de antibiótico en frascos de vidrio y se colocaron en la sala de crecimiento en las condiciones antes mencionadas. Después de 4-6 semanas, los transformadores putativos se transfirieron a pequeñas macetas de plástico que contenían tierra arenosa esterilizada y se colocaron en la sala de crecimiento en las condiciones mencionadas anteriormente. No se requiere más subcultivo en el medio de selección de callos (CSM) más allá de los 10 días.
Confirmación molecular de plantas transgénicas de caña de azúcar
Como se describió anteriormente, el ADN genómico se aisló de las hojas jóvenes de plántulas de caña de azúcar transgénicas putativas utilizando el método de extracción CTAB36. La calidad y la concentración del ADN se evaluaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop y electroforesis en gel de agarosa. La amplificación por PCR del gen marcador seleccionable nptII (750 pb) y el transgén DREB1A (651 pb) se realizó utilizando cebadores específicos del gen enumerados en la Tabla 1. Cada reacción de PCR de 25 μL contenía 1x tampón de PCR, 2,5 mM de MgCl₂, 0,2 mM de dNTP cada uno, 0,4 μM de cada cebador, 1 U de ADN polimerasa Taq, ~100 ng de ADN genómico y agua desionizada por volumen. Las reacciones se realizaron en un termociclador en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min; 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 58 °C durante 30 s, 72 °C durante 45 s; seguido de una extensión final a 72 °C durante 5 min. Los productos de PCR se resolvieron en un gel de agarosa al 1% y se visualizaron bajo luz ultravioleta para confirmar la amplificación. Las plántulas transgénicas positivas para PCR (T0) se transfirieron a grandes macetas de barro y se endurecieron en un ambiente de invernadero controlado hasta la madurez. Tras la maduración, se plantaron segmentos de caña de cinco eventos de T₁ confirmados por PCR seleccionados al azar y se propagaron en microparcelas durante 12 meses para generar suficientes conjuntos clonales para el experimento de estrés por sequía. NOTA: Una vez que se confirmaron los genes nptII y DREB1A , no se realizaron amplificaciones de PCR adicionales.
Estudio de expresión de DREB1A
La expresión relativa de DREB1A en hojas estresadas de plantas de caña de azúcar transgénicas y no transgénicas se cuantificó mediante PCR en tiempo real (qPCR). El ARN total se aisló de ~ 100 mg de tejido foliar utilizando el reactivo de extracción de acuerdo con el protocolo del fabricante. La calidad del ARN se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se cuantificó utilizando un espectrofotómetro. Para cada muestra, se transcribieron de forma inversa 2 μg de ARN utilizando el kit de síntesis de ADNc siguiendo las instrucciones del proveedor, con cebadores oligo(dT).
El ADNc resultante se utilizó como plantilla para amplificar un DREB1A de 188 pb utilizando cebadores específicos de genes: 5'-ACAGAGGAGTTCGTCGGAGA-3' hacia adelante y 5'-GAGTCTCCAAGCCGAGTCAGTCAG-3' inverso. Cada reacción de qPCR de 25 μL contenía 12,5 μL de 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0,4 μM de cada cebador, 2 μL de ADNc diluido (~100 ng de molde) y agua libre de nucleasas para llevar el volumen a 25 μL. Las reacciones se realizaron por triplicado en un termociclador utilizando el siguiente programa: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 30 s, 56 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s, con una extensión final a 72 °C durante 10 min.
Para confirmar la eficiencia y linealidad de las reacciones de qPCR, inicialmente se generó una curva estándar utilizando diluciones en serie de 10 veces de ADN plasmídico que contenía el fragmento DREB1A clonado. Sin embargo, para el análisis de expresión, la cuantificación relativa se realizó utilizando el método 2−ΔΔCt 37. El gen Actina sirvió como referencia endógena, y el nivel de expresión de DREB1A en cada línea transgénica se normalizó al del control de tipo salvaje. Todos los valores de Ct se recopilaron utilizando la configuración automática de la línea de base y el umbral recomendados por el software del instrumento. Solo se aceptaron curvas de fusión con picos únicos y agudos, lo que confirma la especificidad. El ARN de alta calidad y no degradado fue esencial para una cuantificación precisa. Se excluyeron muestras de ARN impuras o degradadas para evitar comprometer la confiabilidad de la síntesis de ADNc y el análisis de expresión génica posterior.
Estudio de los cambios mediados por DREB1A en la caña de azúcar: experimento de estrés hídrico20,34
Después de 1 año, se sembraron tres réplicas de cinco segmentos de caña (dos nudos/segmento) de plantas transgénicas y no transgénicas (de tipo silvestre) a 5 cm de profundidad en macetas de barro que contenían 18 kg de tierra (ECe 1.34; 2,72 SAR; pH 7,8). Se aplicaron tres regímenes de estrés hídrico: 100, 80 y 60% FC (Tabla 2). La actividad fotosintética de la caña de azúcar (PN, E y gs) y las relaciones entre el agua de las plantas (Ψw, Ψ s y RWC) se estudiaron después de 12 meses. No cambie los regímenes hídricos establecidos, ya que afectará la consistencia de los tratamientos.
Determinación de la actividad fotosintética
Después de 180 días de estrés hídrico, los parámetros de intercambio de gases (tasa fotosintética (PN), tasa de transpiración (E) y conductancia estomática (gs) se midieron en plantas de caña de azúcar transgénicas y de tipo silvestre utilizando un sistema portátil de fotosíntesis portátil. Las mediciones se tomaron entre las 09:00 y las 11:00 a.m. utilizando la tercera hoja completamente expandida de la parte superior de cada planta. La hoja seleccionada se insertó suavemente en la cámara de la hoja transparente incorporada (área de abrazadera de 3 cm2 ), asegurando un contacto completo sin arrugas ni obstrucciones. El sistema registró las condiciones ambientales en tiempo real, mientras que la intensidad de la luz se mantuvo en aproximadamente 1.000 μmol m-2 s-1 bajo la luz solar natural. Se permitió que el dispositivo se equilibrara durante 30-60 s hasta que se obtuvieron lecturas en estado estacionario para la asimilación deCO2 y el intercambio de vapor de agua. Los sensores internos del instrumento registraron automáticamente la temperatura de la hoja, la humedad relativa y la concentración ambiental deCO2 . Para cada genotipo y tratamiento, las mediciones se replicaron en al menos tres plantas biológicamente independientes, y los datos se almacenaron internamente y luego se exportaron para su análisis. Se tuvo cuidado de mantener condiciones ambientales consistentes en todas las réplicas para garantizar la confiabilidad de los datos.
Determinación del potencial hídrico foliar y del potencial osmótico
El potencial hídrico (Ψw) de la tercera hoja completamente expandida desde la parte superior de las plantas se determinó utilizando la cámara de presión tipo Scholander. Luego, las hojas se congelaron a -20 oC en tubos de 1,5 ml, y la savia celular obtenida de las hojas congeladas se utilizó para analizar el potencial osmótico (Ψs) utilizando el osmómetro.
Determinación del contenido relativo de agua foliar
Se examinó en detalle el contenido de agua de las hojas de plantas transgénicas y de tipo silvestre. Se midieron los pesos frescos de las hojas y las hojas se sumergieron en agua destilada durante la noche. Posteriormente, se registró el peso de turgencia de las hojas, mientras que el peso seco se determinó incubando las hojas a 70 °C durante 72 h. El RWC de la hoja se calculó utilizando la siguiente fórmula:
NOTA: Para analizar con precisión el potencial osmótico con un osmómetro, las hojas deben congelarse a -20 °C una vez que se haya determinado el potencial hídrico.
Atributos de rendimiento
En la etapa de cosecha se midieron los rasgos de rendimiento de la caña de azúcar, como la altura de la caña (cm), el diámetro, el número de cañas molibles, los brix (%) y la biomasa de brotes y raíces.
Análisis estadísticos
Los experimentos de campo (controlados mediante una cerca) se realizaron utilizando un diseño de diseño de bloques completos al azar con tres repeticiones por tratamiento (cinco plantas por repetición; n = 15). Se realizó un análisis de varianza bidireccional para analizar los cambios en diferentes rasgos agronómicos y fisiológicos a un nivel de significancia de P ≤ 0.05.
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Resultados
Caracterización molecular de líneas transgénicas de caña de azúcar
El casete de expresión rd29A: DREB1A se construyó y clonó en el vector binario expresable por plantas pGA482 (Figura 1), que luego se transformó en el genoma de la caña de azúcar utilizando la técnica de transformación mediada por biolística y desarrolló con éxito plántulas transgénicas de caña de azúcar como se describe (Figura 2). La presencia de transgenes en línea...
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Discusión
Desarrollar tolerancia al estrés hídrico en las plantas es crucial debido a la expansión continua de las regiones propensas a la sequía en todo el mundo. Como un enfoque biotecnológico potencialmente factible, estudiamos el papel de DREB1A en la tolerancia al estrés hídrico en líneas de caña de azúcar transgénicas. Estudios previos han informado del papel del factor de transcripción DREB1A en la inducción de la expresión de múltiples genes que confieren tolerancia al es...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Número de Proyecto de Apoyo a los Investigadores de la Universidad Princesa Nourah bint Abdulrahman (PNURSP2025R39), Universidad Princesa Nourah bint Abdulrahman, Riad, Arabia Saudita.
DISPONIBILIDAD DE DATOS:
Todos los datos se proporcionan en este documento.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Vector de clonación, pTZ57R/T | Fermentas, Vilnius, Lituania | ||
| analizador de intercambio de gases por infrarrojos | Bio-Rad, California, EE. UU. | ||
| Osmómetro | Bio-Rad, California, EE. UU. | ||
| Máquina de PCR | Bio-Rad, California, EE. UU. | ||
| Pistola biolítica PDS-1000/He | ThermoFisher Sceintific Inc, Estados Unidos | ||
| PCR en tiempo real | ThermoFisher Sceintific Inc, Estados Unidos | ||
| Kit de síntesis de ADNc RevertAid | CI-340, CID Bio-Science, Inc., EE. UU. | ||
| Cámara de presión tipo Scholander | Instrumentos Skye, Llandrindod Wells, Birmingham, Reino Unido | ||
| Reactivo TRIzol | Wescor-5500, Logan, Utah, EE. UU. |
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