Artículo de método

Aislamiento e identificación de cepas bacterianas de la piel de anfibios terrestres

DOI:

10.3791/67862

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17 de junio de 2025

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1Department of Life, Health, and Environmental Sciences (MeSVA), University of L'Aquila

En este artículo

Resumen

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Se trata de un método para muestrear y aislar bacterias cultivables de la microbiota cutánea de salamandras pletodóntidas europeas (género Speleomantes). Aquí, presentamos un protocolo para muestrear la piel de la salamandra con hisopos y procesarlos utilizando enfoques cultivables. Describimos el muestreo, el aislamiento y el establecimiento del cultivo axénico con caracterización de cepas bacterianas.

Resumen

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La microbiota es un elemento vital de los organismos superiores, y la microbiota cutánea contribuye significativamente a la defensa del organismo frente a los agentes externos. No existe un método estándar para muestrear las comunidades microbianas de la piel de Speleomantes (Amphibia: Plethodontidae) para el enfoque de cultivo microbiano. Para abordar esto, hemos desarrollado un protocolo práctico para aislar las bacterias de la piel de las personas y una mejor práctica para el manejo y almacenamiento de muestras. Los pasos son sencillos: los hisopos se almacenan en una solución salina fisiológica suplementada con glicerol tras la toma de muestra. Una vez transferidos al laboratorio, los hisopos pueden almacenarse a +4 °C durante un máximo de 10 días para garantizar la integridad de la comunidad microbiana. Este estudio ofrece información interesante sobre la investigación de la microbiota cutánea de especies de anfibios terrestres, como las pertenecientes al género Speleomantes. Este enfoque contribuye a la implementación, el seguimiento y la conservación de las especies amenazadas y podría mejorar el conocimiento de la función de la microbiota en la salud y la ecología de los anfibios. Este protocolo también puede tener una importancia más amplia para la investigación del microbioma en muchos escenarios de conservación de la vida silvestre.

Introducción

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Todos los organismos albergan una variedad de simbiontes microbianos en sus superficies epiteliales, tejidos y órganos. La piel es la interfaz principal entre el huésped y su entorno, proporcionando un hábitat para diversos microorganismos2. La piel es el órgano más grande de los vertebrados y actúa como barrera contra las agresiones mecánicas, químicas y microbianas3. Sin embargo, esta amplia exposición de la piel a las condiciones ambientales probablemente la convierte en la frontera ecológica más crítica que media la interacción del organismo con factores bióticos y abióticos externos4.

La microbiota cutánea de los anfibios ha sido estudiada intensamente en la última década, y la relación entre esta comunidad microbiana y su huésped ha sido profundamente explorada 5,6,7,8,9,10. La biodiversidad de la microbiota cutánea está determinada en gran medida por el tipo de huésped (es decir, la comunidad específica de la especie), pero otros factores ambientales pueden promover una mayor diversidad interespecífica11. La microbiota cutánea de los anfibios tiene una composición distintiva de la de otros animales. Se sabe que se ha demostrado que los anfibios tienen una relación mutualista con los microbios de su piel, siendo capaces de biosintetizar compuestos antimicrobianos o proteger a su huésped contra enfermedades infecciosas emergentes12.

El aislamiento de las bacterias de la piel generalmente se alcanza después de realizar diferentes pasos. El primer paso incluye la obtención de una muestra representativa mediante hisopado y evitar la contaminación externa. Las muestras microbianas se suspenden en solución salina estéril o tampón. La suplementación de los líquidos de suspensión con protectores (por ejemplo, glicerol) podría mejorar la integridad de la comunidad bacteriana durante la transferencia de laboratorio13,14. Una vez transferidas al laboratorio, las muestras se pueden procesar inmediatamente o después de un corto período de tiempo para mantener la integridad de la comunidad microbiana. El enfoque microbiano clásico implica el procesamiento de muestras por dilución en serie para reducir la densidad microbiana y garantizar una mejor separación de colonias en las placas de Petri. A continuación, las diluciones de muestras y series se colocan en medios no específicos y no selectivos, como el agar Luria-Bertani (LBA)15, la soja tríptica (TSA)16, el agar de extracto de levadura de triptona (TYEA)17,18,19 o el nutriente (NA)20, que favorecen el crecimiento de una amplia gama de bacterias. Se utilizan enriquecimientos no selectivos durante el muestreo y el procesamiento, ya que es necesario cultivar una amplia gama de microbios. Los métodos de rayas o placas extendidas distribuyen la suspensión microbiana de manera uniforme sobre la superficie del agar21. La distribución uniforme permite que las diferentes especies microbianas presentes en la muestra formen colonias distintas. Después de la incubación a 20-37 °C durante 2-7 días, las colonias microbianas se cuentan y distinguen en función de la morfología. La caracterización morfológica de la colonia bacteriana se realizó con base en pigmentación, forma, elevación, margen, opacidad y superficie. Las colonias bien aisladas en las diluciones más altas se subcultivan en placas de agar frescas para purificar los cultivos microbianos. La pureza de las colonias está asegurada en base a la uniformidad celular y la afinidad por la tinción de Gram. También se pueden realizar varias pruebas bioquímicas o moleculares para comprobar la pureza de las colonias22. Los cultivos puros de cepas aisladas pueden almacenarse en agar inclinados a 4 °C para su uso a corto plazo o conservarse a largo plazo a -80 °C en crioprotectores (por ejemplo, una proporción de glicerol a medio de 20:80 o 50:50)23.

En este protocolo, reportamos el enfoque de mejores prácticas para aislar bacterias de la microbiota de la piel de salamandras de cueva Speleomantes , anfibios estrictamente terrestres que pueden vivir tanto en ambientes superficiales como subterráneos24. Dada la falta de protocolos de aplicación universal en la literatura, este estudio tuvo como objetivo desarrollar una mejor práctica para el muestreo y la preservación de muestras de microbiota cutánea de estos anfibios terrestres. Para probar este protocolo, utilizamos como modelo la salamandra de cueva italiana (Speleomantes italicus), muestreando 12 individuos de una población de cuevas localizada en Abruzzo (Italia). Los individuos fueron recolectados a mano y tomados con muestras repetidas (al menos 5 veces) en sus lados dorsal, ventral y flancos. Los hisopos usados se empaparon en agua destilada estéril. A continuación, los hisopos se sumergieron en una solución salina fisiológica al 0,9% con y sin suplementación con glicerol. Tras el traslado al laboratorio, la conservación de la muestra se probó en diversas condiciones: temperatura ambiente no controlada, 4 °C y -20 °C durante 10 días. Las comunidades microbianas cultivables se compararon utilizando métodos basados en cultivos en medios genéricos y semiselectivos (LBA, TSYEA, TSA, NA).

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Protocolo

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Este protocolo presenta las mejores prácticas para la obtención y manipulación de muestras de piel de Speleomantes para un enfoque microbiológico cultivable para aislar cepas bacterianas. El material útil en los siguientes pasos se enumera en la Tabla de materiales. El protocolo sigue las directrices de cuidado animal del artículo 11 del DPR 357/97 con la autorización del Ministerio de Medio Ambiente italiano (PNM 74554 del 22/04/2024).

1. Preparación de los medios

  1. Calcule y pese la cantidad de ingredientes en polvo (consulte las instrucciones del fabricante para conocer la cantidad de polvo utilizada para LBA, TSYEA, TSA, NA u otros medios).
  2. Siga las instrucciones del fabricante para disolver los ingredientes en agua destilada. Dependiendo del medio y del producto comprado, es posible que se requieran pasos de ebullición.
  3. Lleve el medio al volumen final cuando los ingredientes se disuelvan por completo y controle el pH. Si el valor es mayor o menor de lo esperado, ajústelo utilizando las soluciones sugeridas en las instrucciones del fabricante. Las soluciones de HCl y NaOH se usan comúnmente para disminuir y aumentar el pH, respectivamente.
  4. Añadir agar (2% p/v), calentar hasta 95 °C y hervir durante aproximadamente 1 minuto para disolver el agar antes de la esterilización en autoclave.
  5. Esterilice el medio esterilizándolo en autoclave, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los procesos comunes de autoclave incluyen 121-134 °C para un tratamiento de 15-30 minutos.
  6. Después de la esterilización en autoclave, enfríe el medio de agar a unos 45-50 °C y viértalo en placas de Petri estériles bajo una campana de flujo laminar previamente esterilizada
  7. Después de la solidificación, etiquete las placas de acuerdo con el tipo de medio y la fecha de preparación.

2. Recogida de muestras

  1. Enjuague la piel de la salamandra (género Speleomantes) con agua destilada estéril para eliminar las comunidades microbianas transitorias.
  2. Recoja hisopos de piel de anfibios usando hisopos estériles con punta de algodón en un tubo de ensayo. Frote suavemente los hisopos sobre la superficie de la piel para recolectar muestras microbianas sin dañar al individuo.
    1. Pase un hisopo empapado en agua destilada estéril a cada lado de todo el cuerpo, incluidas todas las extremidades, cinco veces (cinco golpes de ida y vuelta) para tomar muestras de los individuos.
      NOTA: No se recomienda la suplementación con aditivos, ya que podría dañar a las personas.
    2. Colocar los hisopos en tubos que contengan solución salina fisiológica (0,9% NaCl) suplementada con glicerol (20%).
  3. Mezcle la muestra con la solución, empujando el hisopo hacia las paredes del tubo mientras aprieta el tubo y gira el hisopo a fondo (10 veces en el sentido de las agujas del reloj y 10 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj).
  4. Después de mezclar, cierre el hisopo dentro del tubo y transfiera las muestras microbiológicas al laboratorio, manteniendo la muestra a 4 °C hasta el análisis microbiano.
    NOTA: Todos los pasos se realizan utilizando material estéril nuevo y guantes para cada individuo para evitar la contaminación y la exposición del operador a contaminantes biológicos y químicos.

3. Inoculación e incubación

  1. Mezcle bien la muestra microbiológica antes de procesarla.
  2. Preparar diluciones seriadas de la muestra cutánea con solución salina (NaCl al 0,9%), que van de 10-1 a 10-6.
  3. Inocular 100 μL de muestras tal cual y diluciones en serie en las placas de agar preparadas. Usando un bucle estéril en forma de L, raye la muestra a través de la superficie del medio de agar, distribuyéndola uniformemente sin aplicar una presión excesiva para evitar dañar el agar.
  4. Invertir las placas inoculadas en una incubadora a 20-25 °C durante 3-5 días. Este rango de temperatura es favorable para el crecimiento de muchas bacterias mesófilas y psicotrópicas ambientales que habitan en la piel de los anfibios.
    NOTA: Todos los pasos se realizan utilizando material estéril bajo una campana laminar previamente esterilizada. Se preparan cinco réplicas independientes para cada unidad experimental. Dado que la densidad inicial es desconocida e impredecible, siempre es útil incluir una amplia gama de diluciones.

4. Purificación e identificación de cepas

  1. Seleccione colonias bacterianas con morfologías distintas para su posterior análisis después de la incubación.
    1. Primero, elija colonias bien aisladas para evitar la contaminación o la superposición y evite las áreas concurridas donde las colonias podrían fusionarse. Además, elija colonias con diferentes apariencias (por ejemplo, color, tamaño, forma, borde, superficie o textura) para garantizar el muestreo de especies o cepas potencialmente diferentes.
      NOTA: Este paso es crucial para seleccionar las diferentes cepas bacterianas cultivables de la microbiota cutánea.
  2. Subcultivo: las colonias seleccionadas.
    1. Transfiera una colonia bien aislada de la placa de agar original asépticamente a una placa de agar fresca utilizando un asa de inoculación. Raya la colonia para aislarla y luego incubarla adecuadamente.
    2. Repita este paso varias veces en placas de agar frescas para obtener cultivos puros de cada aislado bacteriano hasta que las colonias aisladas parezcan similares. Repetir el subcultivo utilizando medios selectivos y genéricos.
      NOTA: La combinación de manejo aséptico, examen visual y microscópico e identificación molecular garantiza una deformación libre de contaminación.
  3. Verificar la pureza de los cultivos microbianos mediante observaciones microscópicas (de 5x a 100x objetivos), afinidad de tinción de Gram (fijación de colonias, coloración y observación) y pruebas bioquímicas (p. ej., prueba de fermentación de catalasa, oxidasa, ureasa y azúcar)21,25.
    NOTA: Los cultivos puros deben mostrar una morfología de colonia uniforme, características microscópicas consistentes y rasgos bioquímicos.
  4. Realizar la identificación molecular.
    1. Extraiga ADN de colonias bacterianas purificadas y realice la secuenciación del gen ARNr 16S para identificar las especies bacterianas. Realice la amplificación por PCR del gen 16S rRNA utilizando cebadores universales bacterianos, seguida de secuenciación y comparación con secuencias conocidas en bases de datos como GenBank26.
  5. Establecer cultivos de biobancos.
    1. Analice la esterilidad de los cultivos axénicos (o puros) inocularlos en un medio no selectivo y compruebe la ausencia de crecimiento de contaminantes. Almacene los cultivos axénicos para su uso a medio y largo plazo.
      NOTA: Los métodos estándar incluyen la laminación de colonias en agar inclinadas del medio selectivo y el almacenamiento a temperatura ambiente, la suspensión del cultivo en soluciones madre preparadas con una mezcla del medio selectivo y glicerol (20:80 o 50:50), o la liofilización del cultivo en caldo (liofilización) y la congelación a -80 °C.

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Resultados

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El flujo de trabajo del enfoque experimental se ilustra en la Figura 1.

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Figura 1: Flujo de trabajo del muestreo, manipulación y procesamiento de las muestras de piel de anfibio. Haga clic aquí para ver ...

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Discusión

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Desarrollamos un protocolo de buenas prácticas para obtener una comunidad de bacterias cultivables a partir de la microbiota de la piel de los anfibios y lo demostramos en Speleomantes italicus. Como se demuestra en la aplicación anterior, se deben tomar varias medidas para garantizar un aislamiento microbiano exitoso de la piel de los anfibios. La recolección, utilizando una técnica de hisopo suave y materiales estériles, es muy importante para recolectar suficiente ma...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos el apoyo financiero de la Universidad de L'Aquila dentro de los proyectos "Progetti di Ateneo per la Ricerca di base 2024 UNIVAQ: Ecotoxicología de las salamandras de cueva europeas en peligro de extinción" y "Analisi delle divergenze inter- e intraspecifiche del microbiota dei pletodontidi europei - FFORIC24.35" de Biodiversa+, la Asociación Europea para la Biodiversidad, en el contexto del proyecto Sub-BioMon - Desarrollo y prueba de enfoques para monitorear la biodiversidad subterránea en el karst en el marco del proyecto Sub-BioMon - Desarrollo y prueba de enfoques para monitorear la biodiversidad subterránea en el karst Convocatoria conjunta BiodivMon 2022-2023, y el Plan Nacional de Recuperación y Resiliencia (PNRR), Misión 4, Componente 2, Inversión 1.1, Convocatoria de licitación n.º 1409 publicada el 14.9.2022 por el Ministerio de Universidad e Investigación italiano (MUR), financiada por la Unión Europea - NextGenerationEU- Código del proyecto: P2022CYF9L, Título del proyecto ¿Son las especies de cuevas facultativas conductoras de contaminantes metálicos en entornos subterráneos? (METALCAVE) - COPA E53D23015380001.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Agar Lauria-BertaniMerk MilliporeL3027
Agar tríptico de sojaMerk Millipore22091
Triptona Extracto de levadura de soja AgarMerk Millipore17221
Agar nutritivoMerk Millipore70148
Solución de glicerolMerk Millipore49781

Referencias

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