Artículo de método

Plataforma de imagen óptica multimodal para el estudio del metabolismo celular

DOI:

10.3791/67906

⸱

6 de junio de 2025

 ,  ,  , 
1Shu Chien-Gene Lay Department of Bioengineering, University of California San Diego, 2Aiiso Yufeng Li Family Department of Chemical and Nano Engineering, University of California San Diego, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of California San Diego, 4Institute of Engineering in Medicine, University of California San Diego, 5Synthetic Biology Institute, University of California San Diego

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Utilizando una plataforma multimodal que combina modalidades de imágenes ópticas sin etiquetas, hemos desarrollado un protocolo para visualizar y cuantificar la dinámica y el metabolismo celular. A través de imágenes a través de fluorescencia multifotónica, generación de segundos armónicos y microscopía de dispersión Raman estimulada, podemos generar una visión holística del entorno celular y molecular.

Resumen

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Las tecnologías de imagen óptica son críticas en los estudios biomédicos por su capacidad para obtener información morfológica y funcional de especímenes biológicos a alta resolución espacial. Estos procesos ópticos explotan diversas interacciones luz-molécula, como la dispersión, la absorción, la emisión y la generación de armónicos, entre los fotones y las moléculas dentro de las células, tejidos u órganos. Si bien las imágenes biomédicas convencionales se han centrado históricamente en la aplicación de una sola modalidad, investigaciones recientes han demostrado que estas diversas técnicas proporcionan conocimientos complementarios, y sus resultados combinados ofrecen una comprensión más completa de los cambios moleculares en los procesos de envejecimiento y el desarrollo de enfermedades, así como los fundamentos de la biología celular.

En las últimas décadas, los métodos de imágenes ópticas sin etiquetas han avanzado, lo que permite una exploración detallada de los entornos celulares y subcelulares. Por ejemplo, la fluorescencia multifotónica (MPF) no solo facilita la obtención de imágenes de proteínas específicas, sino que también cuantifica la actividad metabólica a través de coenzimas autofluorescentes, logrando una alta profundidad de penetración y resolución espacial. La segunda generación de armónicos (SHG) se utiliza para obtener imágenes de estructuras como el colágeno en la matriz extracelular, mientras que la dispersión Raman estimulada (SRS) mapea los enlaces químicos y la composición molecular in situ con resolución subcelular.

Hemos desarrollado una plataforma de imágenes multimodal que combina las modalidades MPF, SHG y SRS. La integración de estas modalidades en una sola plataforma permite la adquisición de información multifacética de la misma localización dentro de células, tejidos, órganos o incluso cuerpos, lo que facilita una exploración más detallada de las intrincadas relaciones entre el metabolismo celular, la estructura de la matriz extracelular y la composición molecular. Este sistema multimodal ofrece resolución subcelular, penetración profunda en tejidos, imágenes in situ de células vivas/tejidos, así como detección sin etiquetas y corregistro instantáneo sin necesidad de ajustes de posición, cambio de dispositivo o alineación posterior al análisis. Aquí, presentamos un protocolo para imágenes sin marcadores con esta plataforma multimodal y demostramos su aplicación en la caracterización del metabolismo celular y la heterogeneidad molecular en células y tejidos para el estudio del envejecimiento y las enfermedades.

Introducción

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Las imágenes biomédicas ópticas han sido fundamentales para avanzar en nuestra comprensión de la estructura y función biológicas. Las imágenes se generan modulando la luz de excitación y detectando señales de las interacciones luz-tejido. El primer microscopio compuesto, desarrollado por Hans y Zacharias Janssen alrededor de 1590, utilizaba dos lentes convexas en un tubo, proporcionando un aumento de hasta 30x1. Los microscopios ópticos modernos, después de siglos de avances, ahora pueden alcanzar resoluciones tan finas como 1-3 nm 2,3. Además de ofrecer alta resolución, los sistemas de imágenes avanzados ahora proporcionan una penetración más profunda en el tejido, una mayor eficiencia y un daño mínimo en la muestra, lo que los hace especialmente adecuados para la obtención de imágenes de células y tejidos vivos. Las imágenes sin etiquetas son particularmente ventajosas, ya que capturan información sin interrumpir los procesos intracelulares ni comprometer la integridad de la muestra.

La microscopía de fluorescencia multifotónica (MPF), en particular la microscopía de fluorescencia de dos fotones, se ha utilizado ampliamente para la obtención de imágenes sin marcadores. A diferencia de la microscopía de fluorescencia convencional, que se basa en la absorción y emisión lineal de un solo fotón, la excitación MPF implica la absorción simultánea de múltiples fotones, cuya energía combinada excita una sola molécula de fluoróforo 4,5. Estos fotones, normalmente en el espectro infrarrojo, poseen la mitad o menos de la energía necesaria para la excitación de un solo fotón. Las longitudes de onda más largas y la excitación localizada en el punto focal de este proceso no lineal dan como resultado una menor dispersión, una penetración más profunda en el tejido y una menor fototoxicidad.

La información metabólica celular se puede capturar mediante microscopía MPF sin marcadores a través de la detección de señales de autofluorescencia de sustratos metabólicos endógenos, como el dinucleótido de nicotinamida adenina (NADH) reducido y el dinucleótido de flavina adenina (FAD). Estas coenzimas exhiben distintos espectros de excitación y emisión, y su relación de intensidad de fluorescencia, conocida como relación redox (NADH/FAD), refleja el estado oxidativo de la célula. Desde que Britton Chance introdujo por primera vez el concepto de la relación redox en 1979, sehan propuesto relaciones adicionales, incluyendo NAD(P)H/FAD, NAD(P)H/(FAD + NAD(P)H) y FAD/(FAD + NAD(P)H), 6,7,8,9. La cuantificación de estas proporciones redox ópticas a través de imágenes MPF proporciona información valiosa sobre la dinámica metabólica. Por ejemplo, las imágenes MPF pueden distinguir las células cancerosas de las células normales en función de su metabolismo alterado, lo que demuestra su potencial para el diagnóstico del cáncer 10,11,12. Sin embargo, la detección de autofluorescencia basada en MPF tiene limitaciones. Otros fluoróforos intrínsecos, como la queratina, pueden contribuir a la intensidad de la fluorescencia, lo que conduce a una diafonía espectral y a una interpretación inexacta de la señal13. Además, la relación redox solo refleja los cambios generales de oxidación-reducción celular y no distingue entre NADH de diferentes fuentes (por ejemplo, citoplasmáticas o mitocondriales) o entre NADH y NAD(P)H, ya que ambos exhiben picos espectrales similares a 450 nm, lo que da como resultado señales de intensidad mezcladas14.

La Segunda Generación de Armónicos (SHG), un proceso óptico no lineal demostrado por primera vez en el campo biomédico en la década de 1980, ha sido ampliamente utilizado para la obtención de imágenes sin etiquetas de estructuras celulares15,16. Al igual que el MPF, el SHG implica la absorción simultánea de dos fotones de la misma energía de un láser pulsado ultrarrápido. Estos fotones se recombinan para emitir un nuevo fotón dos veces la frecuencia de la luz incidente, lo que resulta en la detección de la señal del segundo armónico. Esta interacción óptica no lineal ocurre exclusivamente en materiales no centrosimétricos que exhiben una susceptibilidad de segundo orden distinta de cero para inducir una polarización para generar la señal del segundo armónico17,18. Esto hace que SHG sea particularmente eficaz para obtener imágenes de las proteínas filamentosas y las estructuras fibrilares, como el colágeno, la miosina y la tubulina, sin necesidad de colorantes de fluorescencia exógenos 15,17,19,20. La anormalidad en la abundancia, rigidez, alineación y estructura de la fibrosis y el colágeno son prevalentes en muchas afecciones como la inflamación y el cáncer, lo que convierte a la SHG en una herramienta prometedora para la detección eficiente y no invasiva de ciertas condiciones patológicas 21,22,23. La aplicación generalizada de las imágenes SHG en la investigación oncológica, incluidos los estudios sobre los cánceres de mama, ovario y piel, ha puesto de manifiesto su papel crucial tanto en la investigación fundamental como en las posibles aplicaciones clínicas 24,25,26,27.

Diferentes moléculas exhiben distintos niveles de energía vibratoria, que inducen diversos grados de dispersión inelástica cuando son excitadas por la luz incidente, un fenómeno caracterizado por primera vez por C. V. Raman en 192828. Desde entonces, el efecto Raman se ha utilizado ampliamente en microscopía óptica para la detección de composiciones moleculares y de tejidos sin marcaje exógeno. Tanto la dispersión Raman estimulada (SRS) como la dispersión Raman coherente anti-Stokes (CARS) excitan las vibraciones moleculares de manera coherente y aprovechan la interacción no lineal de la luz para producir una señal más fuerte en comparación con la espectroscopia Raman espontánea convencional. El fenómeno SRS se reportó por primera vez en 196229. En 2008, este mecanismo se integró en la obtención de imágenes multifotónicas tridimensionales, lo que permitió la detección selectiva de productos químicos a partir de los cambios de intensidad en los haces de Pump y Stokes debidos a las transiciones vibratorias moleculares30. Este método minimiza la interferencia de fondo no resonante, generando una señal de intensidad limpia que supera a la de CARS. Las imágenes SRS se destacan por proporcionar imágenes multiplexadas e hiperespectrales, lo que permite la detección simultánea de múltiples enlaces químicos y permite la visualización de alta resolución de la composición molecular en muestras con una profundidad de penetración considerable. Aunque es una técnica relativamente nueva, la SRS ha demostrado ser eficaz tanto en el diagnóstico clínico como en la investigación metabólica, in vivo e in vitro30,31,32,33,34,35,36. Por ejemplo, la SRS puede diferenciar los tejidos infiltrados por tumores cerebrales de la corteza y la sustancia blanca mediante la cuantificación de la relación lípido-proteína, lo que permite la delineación de los márgenes tumorales de forma no invasiva y sin etiquetas37,38. Además, las alteraciones metabólicas, a menudo consideradas características distintivas de las enfermedades relacionadas con el envejecimiento y asociadas al cáncer, pueden evaluarse cuantitativamente utilizando SRS logrado mediante la detección de enlaces carbono-deuterio en muestras tratadas con agua pesada (D2O), lo que permite la medición cuantitativa de la síntesis de proteínas, la lipogénesis y otros procesos metabólicos macromoleculares 31,33,34,35,36. La capacidad de rastrear metabolitos con alta resolución temporal y espacial posiciona a SRS como una herramienta prometedora para la investigación y el diagnóstico de enfermedades, con potencial para aplicaciones clínicas más amplias.

Las imágenes multimodales se han convertido en un enfoque poderoso en la investigación biomédica, ya que integran dos o más modalidades de imágenes para obtener una comprensión más completa de los sistemas biológicos complejos dentro de la misma muestra. En 2018, se introdujo una técnica de microscopía de microscopía multiarmónica de autofluorescencia sin marcadores (SLAM), que integra fluorescencia de dos fotones (2PF), fluorescencia de tres fotones (3PF), SHG y tercera generación de armónicos (THG)39. Este enfoque facilita la visualización simultánea de las interacciones celulares, los procesos dinámicos y los componentes individuales dentro del microambiente tumoral. La microscopía SLAM ofrece una perturbación mínima y requisitos de potencia láser reducidos para la muestra, lo que permite la creación de perfiles de tejidos profundos y proporciona un método más seguro para el monitoreo intravital40. Otra modalidad multimodal, que combina espectroscopia de fluorescencia intrínseca, espectroscopia de reflectancia difusa y espectroscopia Raman, ha sido desarrollada para la detección de cáncer in situ durante procedimientos quirúrgicos41. Además, un sistema de endoscopia no lineal multimodal recientemente diseñado, que integra CARS, SHG y fluorescencia de dos fotones (TPF), ha demostrado la capacidad de obtener imágenes de muestras biológicas con una resolución espacial submicrónica y subcelular42. La microscopía combinada de 2PF y SRS se ha utilizado de manera similar para obtener imágenes in vivo de alta resolución de tejidos, células y orgánulos 42,43,44,45. Estas técnicas emergentes de adquisición de imágenes multimodales aprovechan las fortalezas de las modalidades individuales, lo que mejora la resolución, la profundidad de penetración y la eficiencia de adquisición de imágenes, lo que muestra un potencial considerable para aplicaciones clínicas y quirúrgicas.

Este enfoque multimodal se ve cada vez más favorecido sobre las imágenes de monomodalidad porque proporciona una gama más amplia de mediciones al tiempo que mitiga las limitaciones asociadas con las técnicas individuales. Como se ha comentado anteriormente, el MPF mide la fluorescencia endógena para reflejar los cambios metabólicos, el SHG puede obtener imágenes de estructuras no centrosimétricas, como el colágeno, en muestras biológicas, y el SRS detecta predominantemente proteínas y lípidos debido a la alta densidad de enlaces químicos que generan señales Raman distintivas basadas en sus modos vibratorios. Dadas sus propiedades coherentes y el principio compartido de propiedades ópticas no lineales, estas modalidades de imagen pueden integrarse en una sola configuración de microscopio utilizando láseres pulsados ultracortos, lo que permite la adquisición de varios biomarcadores en regiones localizadas para proporcionar una visión más completa de los procesos biológicos44,45. Este artículo describe un protocolo para implementar una plataforma de imágenes multimodal que integra MPF, SHG y SRS para aplicaciones de investigación biomédica.

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Protocolo

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1. Experimentos de imagen multimodal sin etiquetas

NOTA: Este protocolo se centra en el procedimiento de configuración y adquisición de imágenes multimodales sin etiquetas.

  1. Configuración del microscopio multimodal (Figura 1A) y calibración del sistema
    1. Caliente el láser y espere aproximadamente 15-20 min.
    2. Encienda las unidades de control y los monitores en la siguiente secuencia: Caja de control | Controlador de panel táctil | Adaptador de CA para control remoto láser principal Adaptador de CA para control remoto subláser.
    3. Encienda el detector de fotodiodos de Si y el amplificador de bloqueo.
    4. Configure los rayos láser de la bomba y el haz de Stokes. Configure el sistema láser con un haz de bomba ajustable de 780 nm a 990 nm, un ancho de pulso de 5 a 6 ps y una tasa de repetición de 80 MHz. El rayo láser de Stokes tiene una longitud de onda fija de 1.031 nm con un pulso de 6 ps y una tasa de repetición de 80 MHz . Asegúrese de que tanto la bomba como las vigas Stokes estén a baja potencia (al menos 20 mW) para que sean visibles en la placa de alineación.
    5. Coloque una placa de alineación en la trayectoria óptica (justo después de la caja láser) para verificar la superposición espacial de las bombas y los haces de Stokes y ajuste el espejo hasta que ambos puntos se superpongan en el centro de la placa de alineación.
      NOTA: Aunque las bombas y los haces de Stokes están aproximadamente superpuestos, el ajuste fino de la superposición espacial de dos rayos láser puede lograr la señal SRS óptima.
    6. Después de la superposición espacial, ajuste con el PSD (detector sensible a la posición) haciendo clic primero en el software de control OPO . Utilice la tecla hexadecimal para ajustar cuidadosamente el espejo óptico 1 (OM1) y observe la pantalla PSD para ver el cambio de posición X-Y para apuntar a la desviación mínima del centro. A continuación, para realizar ajustes más precisos, utilice la tecla hexadecimal del espejo óptico 2 (OM2) hasta que el indicador de posición se centre en la pantalla PSD.
      NOTA: OM1 y OM2 son dos espejos en el cabezal OPO para ajustar la alineación del láser.
    7. Finalmente, centre el condensador girando los dos tornillos de centrado del condensador para mover la imagen del diafragma del iris al centro del campo de visión.
      NOTA: El diafragma de iris de campo puede restringir el diámetro del haz de luz que ingresa al objetivo y, por lo tanto, excluir la luz extraña, mejorando el contraste de la imagen.
  2. Pasos de adquisición de imágenes multimodales sin etiquetas
    1. Aplique aceite al condensador de aceite de apertura numérica alta (1,4 NA) y monte el portaobjetos del microscopio en el condensador aceitado. Finalmente, coloque una gota de agua grande en el portaobjetos del microscopio para el objetivo de agua 25x. Asegúrese de que el microscopio esté montado de forma segura e inamovible y, a continuación, ajuste la etapa z para ajustar el enfoque hasta que la imagen de campo claro de la muestra biológica se pueda ver bajo el objetivo de agua de 25x.
    2. Comience el proceso de obtención de imágenes en la secuencia correcta: MPF, SHG y SRS para evitar el fotoblanqueo, que afectará a la calidad de la imagen y al análisis preciso del MPF. Para cambiar rápidamente entre MPF y SHG, cambie de la viga de la bomba a la viga fija de Stokes.
      NOTA: El ajuste del láser de la bomba de 800 nm (autofluorescencia NADH y FAD) a 791,3 nm (cambio Raman CH3 ) puede llevar de 1 a 2 minutos.
    3. Seleccione la resolución de la imagen (512 x 512 píxeles) y el tiempo de permanencia adecuado para cada modalidad. Utilice 8 μs/píxel para el MPF y el SHG con un fotograma medio superior a 3. Utilice 40 μs/píxel con un fotograma medio de 2 para la modalidad SRS.
      NOTA: El fotograma promedio significa el número de imágenes que se deben promediar antes de guardar.
    4. Para adquirir autofluorescencia con MPF, apague el rayo láser de Stokes y ajuste el láser de la bomba a 800 nm para excitar NADH y flavina. Instale el cubo de filtro FVOPT en la ruta de luz con 460 ± 10 nm y 515 ± 10 nm para el NADH y la flavina, respectivamente. Por lo tanto, la potencia de la muestra es de aproximadamente 15 mW.
    5. Adquiere la señal de la fibra de colágeno usando SHG. Apague el rayo láser de la bomba, use solo avivar el rayo láser y configure la potencia para que sea de 500 mW. Solo adquiera el canal relacionado con el filtro de 515 nm.
    6. Obtener la distribución espacial de proteínas y lípidos mediante SRS. Mantenga ambos rayos láser encendidos y ajuste la frecuencia del rayo láser para que coincida con el modo vibratorio específico para cada molécula.
      NOTA: Por lo general, 791,3 nm se usa para CH3, 797 nm se usa para CH2, 787 nm es para lípidos insaturados y 794,6 es para lípidos saturados. Por lo tanto, la potencia de la muestra es de aproximadamente 40 mW.
    7. Para adquirir los conjuntos de datos de imágenes hiperespectrales SRS, abra el software de control OPO para seleccionar barrido, establezca el rango de longitud de onda de 780 nm a 806,5 nm y elija un número de pila de al menos 60. A continuación, capture la pila de imágenes hiperespectrales.
      NOTA: El conjunto de datos resultante contiene 60 imágenes, cada una de las cuales representa la distribución espacial en un desplazamiento Raman específico (de 2.700 cm-1 a 3.150 cm-1). El tiempo de adquisición hiperespectral depende del campo de visión (FOV) de la imagen y del tiempo de exploración, pero será aproximadamente entre 5 min y 8 min para una imagen de 512 x 512. Para imágenes más grandes, se debe tener cuidado de minimizar la duración bajo el láser para evitar cualquier daño térmico, que puede ocurrir después de 2 h (dependiendo del grosor de la muestra y el tamaño del campo de visión).
    8. Guarde todas las imágenes de las mismas regiones de interés (ROI) en la misma carpeta. El formato de la imagen es un archivo .oir de Olympus.

2. Análisis de imágenes

  1. Utilice el software de procesamiento de imágenes para abrir todas las imágenes RAW guardadas para asignar el color y agregar la barra de escala para la visualización de la imagen. Utilícelo también para generar la máscara binaria de imágenes de NADH y ácidos grasos de saturación (SFA, 2.880 cm-1) para el análisis óptico de relación redox y unsaturación de lípidos.
    NOTA: Asegúrese de que la intensidad de la mascarilla solo tenga 0 y 1.
  2. Utilice el script de python casero para realizar cualquier análisis posterior (el código está disponible en https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis).
    NOTA: Este script está diseñado para procesar múltiples regiones de interés (ROI) de muestras de control y de cáncer. La función principal del script requiere solo dos entradas: las rutas de archivo para las carpetas de imágenes de control y cáncer.
    1. Itere a través de las carpetas, haciendo coincidir las imágenes con el mismo nombre base (por ejemplo, "roi_1_flavin.tif", "roi_1_nadh.tif", "roi1_mask.tif").
    2. Para cada conjunto de imágenes coincidentes, deje que el script realice un análisis ratiométrico y genere nuevas imágenes ratiométricas basadas en estos cálculos.
      La relación redox óptica se calcula como flavina / (NADH + flavina).
      La insaturación de lípidos se calcula como: USFAs / (SFAs + USFAs) donde los USFAs representan ácidos grasos insaturados.
    3. Todos los valores radiométricos de las imágenes se almacenan en un DataFrame de pandas para facilitar su manipulación. Realice ANOVA de un factor y use matplotlib con styple "ggplot" o seaborn para hacer el diagrama de barras o diagrama de caja para la cuantificación.
    4. Utilice las imágenes de 2.930 cm-1 (CH3) y 2.850 cm-1 (CH2) para generar una imagen sustraída (CH3 - CH2). A continuación, mezcle la imagen CH2 CH3 - CH2 en el espacio de color RGB con una LUT personalizada que imite la tinción H&E para generar la imagen de histología digital46.
  3. Después de la adquisición de imágenes hiperespectrales SRS, emplee el script de python casero para realizar la agrupación de k-medias para segmentar las imágenes en función de las similitudes espectrales (el código está disponible en https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis).
    1. Cargue las pilas de imágenes .tiff con el paquete tifffile. Cambie la forma de la pila de imágenes hiperespectrales SRS (x, y, espectros) en una matriz 2D (píxeles, espectros).
    2. Utilice el paquete scikit-learn para implementar el algoritmo k-means en esta matriz 2D, con el número definido de clústeres.
    3. Vuelva a dar forma a las etiquetas de clúster resultantes a las dimensiones de la imagen original, creando un mapa de segmentación.
    4. Asigne colores únicos a cada grupo, generando una imagen en falso color que representa diferentes composiciones bioquímicas dentro del tejido.
    5. Utilice matplotlib para trazar los espectros de cada clúster con el valor medio (línea continua) y la desviación estándar (área de sombra)
    6. Siga el protocolo del protocolo SRS de coincidencia de referencias penalizadas (PRM-SRS) con MATLAB para crear la detección de subtipos de lípidos sin etiquetas espaciales con conjuntos de datos de imágenes hiperespectrales SRS47.
    7. Organice las imágenes y guárdelas en un formato de .tif de 300 ppp.

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Resultados

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Las imágenes de la Figura 2 son representativas de los resultados obtenidos siguiendo el protocolo de adquisición de autofluorescencia de FAD y NADH, así como los cuatro canales SRS para proteínas, lípidos totales, lípidos insaturados y lípidos saturados. Aquí también generamos una imagen pseudohistológica como se describe en el protocolo a través de la mezcla de colores RGB. La adquisición de los canales MPF y SRS proporciona los archivos de imagen que se utilizarán posteriormente en el aná...

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Discusión

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Este sistema multimodal es una potente plataforma de imágenes para capturar una visualización holística del entorno molecular de las muestras en una amplia gama de orígenes biológicos y condiciones patológicas. La ventaja de aprovechar las diferentes modalidades sin marcadores radica en la capacidad de adquirir información complementaria y dirigirse a analitos específicos que, de otro modo, podrían ser difíciles o imposibles en una sola técnica de imagen sin marcadores. Específicamente, ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

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Agradecemos a la Dra. Gloria Pryhuber y a los miembros de su equipo de HuBMAP por proporcionar cortes de tejido pulmonar humano. Agradecemos al Dr. Kun Zhang por proporcionar tejidos cerebrales humanos. También agradecemos al Dr. Gen-Sheng Feng por proporcionar muestras de hígado de ratón. Agradecemos el apoyo de NIHU54DK134301, NIH R01GM149976, NIH U01AI167892, NIH R01HL170107, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIH U54CA132378, UCSD Startup funds, Sloan Research Fellow Award y CZI DAF2023-328667 Award.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cubo de filtro de 460 nmOlympusOCT-ET 460/50M32
Filtro de paso de bandaKR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 Ohm TerminatorMini Circuitos Fuentede alimentación STRM-50
DCTopWard6302D
Montura dicroicaThorlabsKM100CL
FIJI ImageJ ImageJ
Condensador de aceite de alta NAOlympus6-U130
Filtro de paso corto de alto diámetro exteriorThorlabsMicroscopio
barrido láser invertidoOlympus FV1200MPE
Amplificador de bloqueoZurich Instruments
picoEmerald Laser SystemFísica aplicada & Electrónica, Inc.  Haz de bomba pulsada sincronizada (sintonizable 720– 990 y delgados; Longitud de onda de nm, 5 y ndash; 6  Ancho de pulso PS, y 80  Tasa de repetición de MHz) y Stokes (longitud de onda a 1032  nm, 6 y delgado; Ancho de pulso PS, y 80  Tasa de repetición de MHz)
Detector de fotodiodo SIconstruido
Olympus
VF-300 Compresstome Precisión
de de 950 nm Controlador de panel táctil en casa

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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