En este trabajo describimos los protocolos para la obtención de cultivos primarios de células epiteliales tubulares renales humanas (HRTEC) a partir de la corteza renal para desarrollar monocapas y cultivos tridimensionales en una matriz extracelular (3D-HRTEC).
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Desarrollo de cultivos primarios de células epiteliales tubulares renales humanas en monocapas y condiciones tridimensionales
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Resumen
Resumen
Se aíslan cultivos primarios de células epiteliales tubulares renales humanas (HRTEC) de riñones extraídos de pacientes pediátricos sometidos a nefrectomías indicadas por la Unidad de Nefrología Pediátrica del Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde, Buenos Aires, Argentina. Macroscópicamente, la corteza renal normal se diseca de la médula renal y se corta en fragmentos. A continuación, los fragmentos corticales se digieren en la solución de Hank suplementada con colagenasa tipo 1 al 0,1% y se filtran a través de una malla de 70 μm de tamaño de poro para separar los túbulos renales de los glomérulos. Los túbulos renales se someten a una segunda digestión con colagenasa para aislar las células epiteliales. Finalmente, se detiene la digestión enzimática y las células epiteliales se cultivan en frascos que contienen RPMI 1640 con suplementos por debajo del 5% de CO2a 37 °C hasta la confluencia. Las células HRTEC se pueden cultivar como monocapas en placas de 96 pocillos, cubreobjetos de vidrio en placas de 24 pocillos o soportes de cultivo celular recubiertos con colágeno. Además, se obtienen cultivos tridimensionales de células epiteliales tubulares renales humanas (3D-HRTEC) a partir de células HRTEC sembradas en una matriz de membrana basal (BM). Se monitorea la agregación celular y la formación de estructuras de forma tubular. Hemos utilizado cultivos primarios HRTEC durante muchos años para estudiar la acción citotóxica causada por la toxina Shiga en el riñón pediátrico, que conduce a alteraciones fisiopatológicas que dan lugar al síndrome urémico hemolítico (SUH). Tanto los cultivos HRTEC como los 3D-HRTEC se pueden utilizar para evaluar los efectos de diferentes toxinas, fármacos sintéticos, factores biológicos, hormonas, etc., específicamente en el epitelio del túbulo proximal renal humano.
Introducción
En nuestro grupo, se utilizaron cultivos primarios de células epiteliales tubulares renales humanas (HRTEC) desarrolladas en monocapas y en condiciones tridimensionales (3D-HRTEC) para estudiar en el riñón pediátrico la acción citotóxica de la toxina Shiga tipo 2 (Stx2) causada tras una infección gastrointestinal por Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC).
Stx1 y Stx2 (Stxs) son los principales factores de virulencia del STEC capaces de causar el síndrome urémico hemolítico postdiarreico (SUH)1. El síndrome urémico hemolítico es una complicación sistémica que afecta a alrededor del 5-10% de los niños infectados por STEC y consiste en anemia hemolítica, trombocitopenia y lesión renal aguda (LRA) pediátrica, que requiere tratamiento de soporte2. En Argentina, el SUH-STEC es una enfermedad endémica con una incidencia anual de 6,52 casos por cada 100.000 niños menores de 5 años (la más alta a nivel mundial), representando una de las principales causas de insuficiencia renal aguda3. A pesar de que la mortalidad es inferior al 4%3, aproximadamente el 50% de los pacientes desarrollan secuelas renales, constituyendo la segunda causa más frecuente de trasplante renal en nuestro país 4,5.
Antes de internalizarse y ejercer su acción citotóxica, Stx2 se une específicamente al receptor glicolípido de globotriaosilceramida (Gb3) expresado en la superficie celular de los órganos diana6. El riñón es el principal órgano dañado por las Stxs debido a la presencia de células sensibles a las Stx, que expresan altas cantidades de receptores Gb3 biológicamente activos en las células epiteliales y endoteliales renales 7,8.
Trabajos previos realizados en HRTEC cultivados como monocapas mostraron que Stx2 inhibió la síntesis de proteínas, disminuyó la viabilidad celular y la proliferación celular, e indujo apoptosis y necrosis 9,10,11,12. Además, la exposición de 3D-HRTEC a Stx2 inhibió la migración celular y el desarrollo de estructuras tubulares con características de los túbulos proximales renales12,13.
Los cultivos primarios de HRTEC y 3D-HRTEC también se utilizaron para evaluar el efecto del estradiol sobre la proliferación celular midiendo la incorporación de 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) en el ADN de las células en la fase S del ciclo celular14.
Para aislar las células epiteliales, partimos de fragmentos renales obtenidos de nefrectomías pediátricas indicadas para la corrección de afecciones urológicas.
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Protocolo
El Comité de Ética del Hospital General de Niños Pedro de Elizalde aprobó el uso de tejidos renales humanos para el desarrollo de cultivos celulares primarios con fines de investigación. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los parientes o tutores más cercanos en nombre de los niños para el uso de muestras de riñón para la investigación.
NOTA: Los cultivos primarios de células epiteliales tubulares renales humanas (HRTEC) se derivan de pacientes pediátricos sometidos a nefrectomías, indicadas para la corrección de afecciones urológicas o resecciones tumorales, en el Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde en Buenos Aires, Argentina.
1. Desarrollo de cultivos primarios de células epiteliales tubulares renales humanas (HRTEC)
NOTA: Los fragmentos renales corticales se diseccionan de riñones extraídos de pacientes pediátricos sometidos a nefrectomías en el hospital. El cultivo primario del HRTEC se realiza de acuerdo con el método descrito anteriormente11.
El protocolo se describe en los siguientes pasos:
- Mantenga el fragmento de riñón refrigerado en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) o en una solución de sal equilibrada de Hanks (Hanks) hasta que se procese en el laboratorio.
- Diseccionar la cápsula renal con fórceps. Separa la corteza renal de la médula y córtala en pequeños fragmentos de alrededor de 1 mm.
- Para realizar la digestión, colocar los fragmentos de riñón en una solución estéril de Hanks sin Ca2+ y Mg2+, suplementada con colagenasa tipo I al 0,1%.
- Incubar los fragmentos renales durante 30 min a 37 °C con agitación.
- Para detener la digestión, añadir un volumen de PBS que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) y lavar la muestra tres veces por centrifugación a 160 × g durante 10 min cada una, en una centrífuga refrigerada a 4 °C. En cada centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en la misma solución.
- Pasar el producto de la digestión a través de una malla de poros de 70 μm para filtrar los túbulos y desechar los glomérulos que quedan retenidos en el filtro.
- Centrifugar los túbulos filtrados a 160 × g durante 10 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en solución Hanks estéril, sin Ca2+ y Mg2+, suplementado con colagenasa tipo I al 0,2%.
- Incubar la muestra durante 30 min a 37 °C con agitación.
- Para detener la digestión, agregue un volumen de PBS que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS).
- Lavar la muestra tres veces centrifugando a 160 × g, 10 min cada una, en una centrífuga refrigerada a 4 °C. En cada centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en la misma solución.
- Después de la última centrifugación, vuelva a suspender el pellet celular en 5 mL de medio de cultivo completo (RPMI 1640 suplementado con FBS al 5%, L-glutamina [2 mmol/L], penicilina [100 U/mL], estreptomicina [100 μg/mL] y suplemento de crecimiento de células endoteliales [ECGS, 1%]).
- Siembre la suspensión celular en un matraz de cultivo de 25cm2 con tapa ventilada.
- Incubar las células a 37 °C en un ambiente húmedo y 5% de CO2.
- Al día siguiente, lavar el cultivo celular 3 veces, desechando el líquido del matraz, añadiendo 5 mL de PBS cada uno y añadiendo 5 mL de medio de cultivo completo al matraz. Estos lavados eliminan los glóbulos rojos y los fragmentos tubulares que no se han digerido completamente y no se han adherido al matraz de cultivo.
- Incubar las células epiteliales en la incubadora de cultivos celulares a 37 °C, permitiéndoles crecer en monocapa hasta la confluencia.
- Cambie el medio por un medio de cultivo completo fresco cada 3 días y observe el cultivo celular diariamente bajo un microscopio invertido.
2. Desarrollo de cultivos tridimensionales HRTEC (3D-HRTEC)
NOTA: En esta sección se proporcionan los pasos para desarrollar cultivos tridimensionales (3D-HRTEC). Los cultivos 3D-HRTEC se realizan de acuerdo con el método descrito anteriormente12.
- Use una matriz de BM de Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma . Esta matriz BM se entrega congelada y, en este estado, permanece sólida. Descongele la solución de matriz BM durante la noche en un baño de hielo en el refrigerador a 4 °C, según las indicaciones del fabricante.
- Enfríe las puntas en el congelador antes de colocar la matriz BM y deje la placa de pocillos múltiples en hielo para evitar la solidificación de la matriz durante el proceso.
- Tome una alícuota de matriz BM líquida (150 mL/cm2) y colóquela en cada pocillo de la placa para cubrir el fondo del pocillo. Incubar la placa en la incubadora de células a 37 °C durante 1 h para convertir la matriz BM en un estado de gel.
- Mientras tanto, para separar los cultivos primarios HRTEC confluentes, deseche el medio de cultivo del matraz y agregue 1 mL de solución de tripsina al 0,25% y EDTA al 0,02%.
- Extienda el líquido por toda la superficie del matraz e incube durante 5 min a 37 °C en la incubadora de cultivos celulares.
- Observe bajo un microscopio invertido si todas las células se han desprendido.
- Vuelva a suspender las células en 10 mL de medio de cultivo o PBS, páselas a un tubo de 15 mL y centrifugue a 160 × g durante 10 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en un medio de cultivo completo que contenga los mismos suplementos utilizados para los cultivos primarios de HRTEC.
- Cuente el número de celdas en una cámara de Neubauer.
- Siembra 4 × 104 células/150 μL por pocillo en la matriz BM. Incubar el cultivo celular durante varios días en una incubadora de cultivo celular a 37 °C, en un ambiente húmedo y 5% de CO2.
- Cambie el medio cada 2 días con medio fresco.
- Monitoree la agregación celular y la formación de estructuras de forma tubular bajo un microscopio óptico invertido.
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Resultados
Los cultivos primarios HRTEC confluentes mostraron una morfología similar a la observada bajo microscopía óptica (Figura 1). Las células se caracterizaron por inmunofluorescencia, tal y como se ha descrito en nuestras publicaciones previas, utilizando anticuerpos contra acuaporina 1 (AQP1) y PECAM CD31 9,12,13. Los estudios de inmunofluorescencia mostraron que más del 90% de los HRTEC fueron positiv...
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Discusión
Los cultivos primarios deben realizarse el mismo día de la nefrectomía. Los cultivos primarios HRTEC se pueden utilizar entre 1 y 5 pasos para garantizar la estabilidad morfogenética de las células. Después del quinto paso, las células comienzan a cambiar su morfología, mostrando una apariencia similar a un fibroblasto o un aumento en las vacuolas, y pueden volverse inactivas.
Si se utiliza un fragmento de riñón más grande, el ADN liberado por la lisis celular...
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos al equipo de Urología Pediátrica de la Sección de Cirugía Pediátrica del Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde, Buenos Aires, Argentina, por el suministro de muestras renales. Este trabajo fue apoyado por becas a C. Silberstein de la Universidad de Buenos Aires (UBACYT20020190100072BA) y a C Ibarra y C Silberstein del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET: PUE 0041). Este trabajo fue parcialmente apoyado por el Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) (a través de la Red STEC/SUH Nº 224RT0152).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Colagenasa tipo I | Sigma Merck, San Luis, MO, EE. UU. | 637958 | |
| Suplemento para el crecimiento de las células endoteliales | Sigma Merck, San Luis, MO, EE. UU. | E2759 | |
| Matriz de membrana basal Matrigel | BD Biosciences, Estados Unidos; Sigma Merck, San Luis, MO, EE. UU. | 356234 | |
| 70 μ Filtro de malla de poros M | BD Bioscience, MA, EE. UU. | CSS010070 | |
| Medio RPMI 1640 con L-glutamina | Sigma Merck, San Luis, MO, EE. UU. | R8758-500ml | |
| Hanks' Solución salina equilibrada Libre de Ca2+ y Mg2+ | Gibco Invitrogen, Nueva York, Estados Unidos | 14175046 | |
| Solución de tripsina-EDTA | Sigma Merck, San Luis, MO, EE. UU. | T4049 |
Referencias
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