Uso de bibliotecas de visión artificial para optimizar la cuantificación de núcleos

Summary

Este artículo describe métodos paso a paso para automatizar la cuantificación de núcleos basada en imágenes utilizando un programa ejecutable de código abierto validado en una variedad de densidades celulares. Este programa proporciona una alternativa que aborda las barreras relacionadas con el costo, la accesibilidad para los usuarios con habilidades tecnológicas limitadas y la validación específica de la aplicación que puede limitar la utilidad de las tecnologías existentes.

Abstract

Los ensayos de células vivas y los análisis de células basadas en imágenes requieren la normalización de los datos para una interpretación precisa. Un método comúnmente utilizado es la tinción y cuantificación de núcleos, seguida de la normalización de datos para el recuento de núcleos. Este recuento de núcleos a menudo se expresa como recuento de células para células uninucleadas. Si bien la cuantificación manual puede ser laboriosa y llevar mucho tiempo, es posible que todos los usuarios no prefieran los métodos automatizados disponibles, que carezcan de validación para esta aplicación específica o que tengan un costo prohibitivo. Aquí, proporcionamos instrucciones paso a paso para capturar imágenes cuantificables de núcleos teñidos con tinciones de ADN fluorescente y, posteriormente, cuantificar los núcleos utilizando un programa de software de conteo de objetos automatizado desarrollado con bibliotecas de visión artificial de Python. También validamos este programa en un rango de densidades celulares. Aunque el tiempo exacto de ejecución del programa varía en función del número de imágenes y del hardware del ordenador, este programa consolida horas de trabajo contando los núcleos en segundos para que el programa se ejecute. Si bien este protocolo se desarrolló utilizando imágenes de células fijas y teñidas, las imágenes de núcleos teñidos en células vivas y las aplicaciones de inmunofluorescencia también se pueden cuantificar con este programa. En última instancia, este programa proporciona una opción que no requiere un alto grado de habilidad tecnológica y es una alternativa validada y de código abierto para ayudar a los biólogos celulares y moleculares a optimizar sus flujos de trabajo, automatizando la tediosa y lenta tarea de cuantificación de núcleos.

Introduction

Los experimentos funcionales y basados en imágenes son fundamentales para comprender los impactos de los tratamientos experimentales en la bioquímica y la fisiología de las células completas. La interpretación válida de los datos de los experimentos de biología celular depende de la precisión y reproducibilidad del protocolo experimental, incluida la normalización de los datos. Por ejemplo, los análisis del consumo de oxígeno y de las tasas de acidificación extracelular en células vivas al inicio y después del tratamiento con fármacos específicos permiten evaluar diversos aspectos del metabolismo energético

Protocol

NOTA: Los archivos complementarios se pueden encontrar en el siguiente enlace https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. Captura y almacenamiento de imágenes mediante microscopía de fluorescencia

1. Prepare las muestras de células o tejidos para obtener imágenes, incluida la tinción con el tinte de ADN deseado. Para obtener las imágenes aquí utilizadas, los mioblastos C2C12 (CRL-1772, American Type Culture Collection) se cultivaron en placas de 6 pocillos durante 48-72 h en condiciones de cultivo estándar (5% CO₂, 37 °C, humidificado), con o sin 50 mM de EtOH⁶, y se fi....

Results

Cada ejecución de imagen por lotes produce: 1) un conjunto de archivos de imagen con contornos aplicados que muestran los contornos de los núcleos identificados (Figura 5) y 2) un archivo de .csv (hoja de cálculo) que vincula los nombres de los archivos de imagen y los recuentos asociados. La visualización de los contornos permitirá al usuario evaluar visualmente la calidad del recuento. Específicamente, las imágenes obtenidas de acuerdo con la sección 1 debe.......

Discussion

Nuestro programa de cuantificación de núcleos tiene varias ventajas sobre las opciones existentes: requiere solo habilidades tecnológicas mínimas, está validado para la tarea específica de cuantificación de núcleos y es de código abierto; Este último supera las barreras relacionadas con los costos. En última instancia, este programa proporciona a los biólogos celulares y moleculares una opción adicional para cuantificar núcleos de forma rápida y precisa en imágenes capturadas con microsc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computadora con acceso al archivo de resultados del método 2 o 3	:		consulte el paso 2.6 (para el Método 2) o el paso 3.3.9 o 3.4.9 (para el Método 3)
Computadora con acceso a Internet, navegador moderno	,		por ejemplo, Google Chrome
Computadora con acceso a Internet, navegador moderno y sistema operativo Windows		Varía Varía	Para Mac, Linux u otro sistema operativo, use el método 3
Computadora con software para la captura de imágenes	Zeiss	AxioVision	Se acepta otro software; debe ser compatible con el microscopio de fluorescencia
Ubicación del archivo para la salida (hoja de cálculo de resultados y contornos de imagen)	-	-	Puede ser una carpeta nueva y vacía
Microscopio de fluorescencia	Zeiss	Axiovert 200M	Se aceptan otros microscopios de fluorescencia; debe estar equipado con cubos de filtro apropiados, objetivo deseado y cámara
Carpeta que contiene todas las imágenes que se van a cuantificar	-	-	Consulte el paso 1.12
Python versión 3.10 o superior		Python-Disponible	para descarga e instalación gratuitas en https://www.python.org/downloads/
Muestras para obtener imágenes	:		fijas o vivas, teñidas o contrateñidas con tintes de ADN fluorescentes
Software de hoja de cálculo	Microsoft	Excel	También se acepta un software de hoja de cálculo similar