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Artículo de método

Uso de bibliotecas de visión artificial para optimizar la cuantificación de núcleos

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DOI:

10.3791/67945

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6 de junio de 2025

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1Metabolic Health & Muscle Physiology Laboratory, Department of Kinesiology and Sport Management, Texas Tech University, 2Applied Exercise Physiology Laboratory, Department of Kinesiology and Sport Management, Texas Tech University

En este artículo

Resumen

Este artículo describe métodos paso a paso para automatizar la cuantificación de núcleos basada en imágenes utilizando un programa ejecutable de código abierto validado en una variedad de densidades celulares. Este programa proporciona una alternativa que aborda las barreras relacionadas con el costo, la accesibilidad para los usuarios con habilidades tecnológicas limitadas y la validación específica de la aplicación que puede limitar la utilidad de las tecnologías existentes.

Resumen

Los ensayos de células vivas y los análisis de células basadas en imágenes requieren la normalización de los datos para una interpretación precisa. Un método comúnmente utilizado es la tinción y cuantificación de núcleos, seguida de la normalización de datos para el recuento de núcleos. Este recuento de núcleos a menudo se expresa como recuento de células para células uninucleadas. Si bien la cuantificación manual puede ser laboriosa y llevar mucho tiempo, es posible que todos los usuarios no prefieran los métodos automatizados disponibles, que carezcan de validación para esta aplicación específica o que tengan un costo prohibitivo. Aquí, proporcionamos instrucciones paso a paso para capturar imágenes cuantificables de núcleos teñidos con tinciones de ADN fluorescente y, posteriormente, cuantificar los núcleos utilizando un programa de software de conteo de objetos automatizado desarrollado con bibliotecas de visión artificial de Python. También validamos este programa en un rango de densidades celulares. Aunque el tiempo exacto de ejecución del programa varía en función del número de imágenes y del hardware del ordenador, este programa consolida horas de trabajo contando los núcleos en segundos para que el programa se ejecute. Si bien este protocolo se desarrolló utilizando imágenes de células fijas y teñidas, las imágenes de núcleos teñidos en células vivas y las aplicaciones de inmunofluorescencia también se pueden cuantificar con este programa. En última instancia, este programa proporciona una opción que no requiere un alto grado de habilidad tecnológica y es una alternativa validada y de código abierto para ayudar a los biólogos celulares y moleculares a optimizar sus flujos de trabajo, automatizando la tediosa y lenta tarea de cuantificación de núcleos.

Introducción

Los experimentos funcionales y basados en imágenes son fundamentales para comprender los impactos de los tratamientos experimentales en la bioquímica y la fisiología de las células completas. La interpretación válida de los datos de los experimentos de biología celular depende de la precisión y reproducibilidad del protocolo experimental, incluida la normalización de los datos. Por ejemplo, los análisis del consumo de oxígeno y de las tasas de acidificación extracelular en células vivas al inicio y después del tratamiento con fármacos específicos permiten evaluar diversos aspectos del metabolismo energético 1,2. La medición de la actividad de enzimas como la lactato deshidrogenasa en el sobrenadante de los cultivos celulares puede ayudar a cuantificar la integridad de la membrana celular3. La tinción de las células cultivadas con anexina V y yoduro de propidio antes de la fijación permite la evaluación de las células apoptóticas y necróticas4. Sin embargo, las diferencias en la densidad celular entre los pocillos afectan los resultados de cada uno de estos ensayos. Confiar únicamente en la densidad de siembra podría proporcionar resultados engañosos debido a errores en el recuento de células para la siembra, variaciones en la densidad celular en el medio durante la siembra o diferentes tasas de crecimiento celular entre muestras o tratamientos a lo largo de los experimentos. Por lo tanto, se requiere la normalización de los resultados experimentales.

Los métodos actuales de normalización para datos celulares funcionales y basados en imágenes incluyen la concentración de proteínas5 o núcleos o recuento de células6. Para normalizar los datos a la concentración de proteínas, las células deben extraerse en volúmenes iguales de tampón de lisis con inhibidor de proteasa después de ejecutar el ensayo, y se debe realizar un ensayo adicional (por ejemplo, ensayo de ácido bicinconínico, ensayo de Bradford, etc.) para la cuantificación de proteínas. La precisión de este método se basa en la extracción completa de células; Dejar atrás cualquier proteína contribuye a errores en la cuantificación. El recuento de núcleos o células proporciona una alternativa en la que no es necesario extraer células de la superficie en la que se cultivan. En su lugar, las células vivas o fijas se tiñen o contratiñen mediante tinciones colorimétricas o fluorescentes, y el recuento se puede realizar basándose en imágenes de células enteras o solo de núcleos. Se prefiere la cuantificación de núcleos en lugar de células enteras para aplicaciones de microscopía de fluorescencia y para normalizar datos en células fusionadas (por ejemplo, miotubos) o tejidos. Para la cuantificación de núcleos mediante un enfoque de fluorescencia, se aplican colorantes fluorescentes de ADN (por ejemplo, dicloruro de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), Hoechst 33342, Hoechst 33358, DRAQ5, etc.) a células vivas o fijas y se obtienen imágenes mediante microscopía de fluorescencia. DAPI, Hoechst y DRAQ5 se unen preferentemente a las regiones ricas en adenina-timina del ADN 7,8,9, proporcionando un medio para detectar núcleos. La optimización de la concentración de colorante evita la unión fuera del objetivo (es decir, al ADN mitocondrial, lo que provoca fluorescencia citosólica punteada)10. El proceso de optimización puede simplificarse mediante el uso de medios de montaje disponibles en el mercado que contengan DAPI para celdas fijas (p. ej., VECTASHIELD Antifade Mounting Medium con DAPI) y concentraciones publicadas de tinciones para celdas vivas (p. ej., Hoechst)6,11,12. Una vez teñidos, los núcleos de las células vivas o fijas se visualizan utilizando el filtro de excitación adecuado (por ejemplo, ultravioleta [DAPI y Hoechst] o rojo lejano [DRAQ5]). Los máximos de excitación para DAPI, Hoechst y DRAQ5 se encuentran en ambos extremos del espectro para la microscopía de fluorescencia. Este atributo, además de la especificidad del ADN de estos colorantes y su uso en concentraciones óptimas, minimiza la fluorescencia fuera del objetivo. Las imágenes resultantes muestran núcleos brillantes sobre un fondo negro, y estos núcleos se cuantifican como una medida del número de células para células uninucleadas. Si bien existen otros métodos precisos de cuantificación de núcleos basados en tinciones que utilizan tinciones histológicas y microscopía de campo claro13, la automatización es más difícil, aunque posible, utilizando esos enfoques.

Si bien sigue siendo el estándar de oro, la cuantificación manual de núcleos es laboriosa, requiere mucho tiempo y es susceptible a posibles errores humanos con un conteo prolongado. Aunque existen programas de conteo automatizado de células, no son los preferidos por todos los usuarios, pueden tener un costo prohibitivo y la validación para aplicaciones específicas puede ser mínima. Python se ha convertido en un recurso valioso y accesible para los biólogos en los últimos años. Las bibliotecas de visión artificial de Python son particularmente útiles para el análisis de imágenes14. Aquí, proporcionamos instrucciones paso a paso para usar nuestro programa ejecutable desarrollado con código Python para cuantificar núcleos teñidos con tintes fluorescentes y fotografiados con microscopía de fluorescencia. No es necesario tener conocimientos de codificación para utilizar el programa descrito aquí. Este flujo de trabajo es específico de células o tejidos a los que se les han aplicado tintes fluorescentes de ADN. No está diseñado para su uso con imágenes de campo claro. En la sección 1 se describe cómo capturar y guardar las imágenes recogidas mediante microscopía de fluorescencia de forma compatible con este flujo de trabajo. La sección 2 proporciona instrucciones para ejecutar el programa de cuantificación de núcleos como un ejecutable y obtener salida. El programa ejecutable se puede ejecutar directamente desde el archivo de .exe proporcionado y no requiere modificaciones para cuantificar los núcleos en imágenes de calidad. Este ejecutable requiere una PC basada en Windows. La sección 3 proporciona instrucciones para ejecutar el programa como un script de Python en lugar de un ejecutable (necesario para sistemas basados en Mac o Linux, opcional para sistemas basados en Windows) y permite ajustar el código si se desea. En la sección 4 se describe cómo utilizar los resultados para la normalización. A estos protocolos les siguen resultados representativos, incluidos los datos de validación de nuestro laboratorio.

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Protocolo

NOTA: Los archivos complementarios se pueden encontrar en el siguiente enlace https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. Captura y almacenamiento de imágenes mediante microscopía de fluorescencia

  1. Prepare las muestras de células o tejidos para obtener imágenes, incluida la tinción con el tinte de ADN deseado. Para obtener las imágenes aquí utilizadas, los mioblastos C2C12 (CRL-1772, American Type Culture Collection) se cultivaron en placas de 6 pocillos durante 48-72 h en condiciones de cultivo estándar (5% CO2, 37 °C, humidificado), con o sin 50 mM de EtOH6, y se fijaron en metanol helado como se describió anteriormente13. Las células fijas se montaron utilizando un medio de montaje15 que contenía DAPI y se secaron en la oscuridad antes de la obtención de imágenes.
  2. Encienda todos los componentes del microscopio de fluorescencia y la computadora de acuerdo con los procedimientos operativos estándar establecidos. Abra el software asociado con el microscopio.
  3. Configure el microscopio para visualizar las muestras a través del ocular. Revisa el objetivo. Si es necesario, gire el revólver hacia el objetivo deseado. Asegúrese de que el programa de software tenga seleccionado el objetivo deseado para obtener una indicación precisa del área de la imagen. Aquí, las imágenes se capturaron con un objetivo 10x.
  4. Con las luces apagadas, coloque la muestra (portaobjetos, plato o plato) en el escenario. Activa las imágenes en directo con el filtro adecuado y ajusta el tiempo de exposición a una duración predeterminada o a la exposición automática. En este caso, se utilizó un filtro DAPI y un tiempo de exposición de 61-62 ms. Consulte la tabla de solución de problemas para obtener orientación sobre cómo configurar el tiempo de exposición, especialmente para imágenes con densidades de celdas altas.
  5. Con el ocular, ajuste lentamente el enfoque con la perilla de ajuste grueso hasta que los núcleos manchados sean visibles, luego use la perilla de ajuste fino para ajustar lentamente el enfoque hasta que los núcleos aparezcan claros y nítidos.
    NOTA: En la Figura 1 se muestran ejemplos de imágenes apropiadas.
    1. Si aparece una tinción de fondo excesiva o si los núcleos parecen muy tenues, ajuste el tiempo de exposición manualmente. En una sola imagen, puede haber diferencias visibles en la intensidad de la señal para algunos núcleos; Sin embargo, la forma redonda debe ser visible para todos los núcleos con una interferencia de señal mínima.
      NOTA: El programa utilizado en las aplicaciones posteriores es robusto a diferentes intensidades. Las imágenes en bruto utilizadas para el desarrollo y la validación del programa de cuantificación de núcleos incluyen imágenes con un rango de intensidades de señal y están disponibles a través del repositorio Open Science Framework (ver enlace mencionado anteriormente).

figure-protocol-1
Figura 1: Imágenes de ejemplo de núcleos teñidos con DAPI. Estas imágenes muestran núcleos con densidades celulares (A) bajas, (B) medias o (C) altas con un fondo mínimo. Obsérvese la variación de la intensidad de la señal de los núcleos a través de la imagen C; Esto no interfirió con la cuantificación. La barra de escala (C) indica 100 μm; Las barras de escala deben omitirse de las imágenes utilizadas para la cuantificación de núcleos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Una vez que los núcleos estén enfocados a través del ocular, cambie el modo de detección a la cámara. Ajuste el enfoque con la perilla de ajuste fino.
  2. Ajuste el tiempo de exposición si es necesario. Tenga en cuenta el tiempo de exposición final para su uso con muestras e imágenes posteriores.
    NOTA: Aunque lo ideal es utilizar el mismo tiempo de exposición en todas las imágenes, las variaciones en el tiempo de exposición son aceptables para esta aplicación porque la intensidad de la fluorescencia no se cuantifica ni se compara entre muestras.
  3. Capture la imagen utilizando el botón de captura de imagen apropiado en el software. Si las muestras tienen varias tinciones aplicadas, cambie el filtro (por ejemplo, a FITC, Tritc o Cy5) y obtenga una imagen de la misma área para fusionar.
  4. Aplique el obturador para minimizar la exposición de la muestra a la luz. Sin grabar en una barra de escala, guarde la imagen en un formato de archivo de figura universal (.tif, .png o .jpg) en una carpeta dedicada. Asegúrese de que cada nombre de archivo de imagen sea adecuadamente descriptivo o que cualquier codificación utilizada para los nombres de archivo tenga la documentación vinculada adecuada.
    NOTA: Este se convertirá en el directorio de imágenes para el programa de cuantificación. Si se utilizaron imágenes multicolor, copie solo las imágenes de los núcleos en una carpeta separada y dedicada. Esto también se puede hacer al final de la sesión de imágenes. Las imágenes exportadas con la configuración de exportación predeterminada en la mayoría de los programas de procesamiento de imágenes suelen tener una resolución suficiente para su uso con este programa, siempre que se hayan capturado imágenes de calidad. Sin embargo, las imágenes deben verificarse visualmente después de la exportación para asegurarse de que la morfología de los núcleos sea clara. Si las imágenes se guardan en .jpg formato, se debe tener cuidado de que las imágenes no se compriman excesivamente y se mantenga la calidad.
  5. Abra el obturador, vuelva a las imágenes en vivo y escanee la muestra a otra ubicación para obtener imágenes. Repita los pasos 1.8 y 1.9 según sea necesario. En el caso de imágenes de células sembradas en placas de 6 pocillos con un aumento de 10x, capture de 10 a 15 imágenes por pocillo (dependiendo de la consistencia de la densidad de células en el área de la muestra).
  6. Una vez adquiridas todas las imágenes de una sola muestra, realice una de las siguientes opciones.
    1. Pase a la siguiente muestra y repita los pasos 1.4-1.10.
    2. Pausa el protocolo y vuelve en otro momento. Las muestras deben permanecer protegidas de la luz. Esta opción no se recomienda si se trabaja con células vivas.
  7. Una vez completadas las imágenes, asegúrese de que todas las muestras estén protegidas contra la luz antes de encender las luces de la habitación. Si la carpeta que contiene las imágenes se guarda localmente, transfiera los archivos a una unidad de memoria USB, una ubicación de almacenamiento en la nube u otra unidad de red accesible para el equipo donde se ejecutará el programa de cuantificación. Guarde en una carpeta dedicada.
  8. Apague todas las partes del microscopio y la computadora de acuerdo con los procedimientos operativos estándar establecidos.
  9. Las imágenes ya están completas. Analice los archivos utilizando el programa de cuantificación automatizada como se describe en la Sección 2 o, alternativamente, ejecutando el programa como un script de Python como se describe en la Sección 3.

2. Ejecución del programa automatizado de cuantificación de núcleos como ejecutable

NOTA: Este método, que ejecuta el programa como un ejecutable, es compatible con PC basadas en Windows y es el método recomendado para los usuarios del sistema operativo Windows. Mac OS u otros usuarios que no sean de Windows deben ejecutar el programa como un script de Python (consulte la Sección 3).

  1. Asegúrese de que Python esté instalado en la computadora. Si es necesario, instale Python desde python.org/downloads (preferido) o mediante Anaconda o Miniconda. A la fecha de publicación, este programa ha sido probado con las versiones 3.10-3.12 de Python.
  2. Abra el navegador y navegue hasta https://github.com/rbudnar/nuclei_counter/releases. Descargue la última versión del archivo denominado count_nuclei.zip.
  3. En la carpeta Descargas, haga clic con el botón derecho en el archivo Zip y extraiga todos los archivos a la ubicación deseada en el equipo local (consulte la Figura 2A). Mantenga abierta esta ubicación de archivo; esta ruta de archivo se utilizará en el paso 2.5 (consulte la Figura 2B).
    NOTA: Count_nuclei debería aparecer ahora como un archivo de aplicación. Este es el archivo ejecutable.
  4. Abra un símbolo del sistema buscando CMD o Símbolo del sistema en la barra de búsqueda. Utilice el comando cd para cambiar el directorio a la ruta de acceso del archivo ejecutable (consulte la figura 2C) y pulse Intro. Ejemplo de línea de comandos: C:\Users\janedoe>cd [espacio después del cd, luego copiar/pegar la ruta del archivo]
  5. En la siguiente línea de comandos, escriba lo siguiente y presione Entrar.
    count_nuclei.exe --img_dir "ruta/a/imágenes" --output_dir "ruta/a/salida" --save_images --output_count_filename "results.csv"
    donde ruta/a/imágenes es la ruta del archivo a la carpeta que contiene las imágenes que se van a analizar (consulte el paso 1.14); path/to/output es la ruta del archivo a la carpeta donde se debe guardar el archivo .csv (el valor predeterminado es el directorio de trabajo actual cuando no se proporciona); y results.csv es el nombre de archivo en el que se guardarán los recuentos resultantes (si no se proporciona, el nombre del archivo de salida se establece de forma predeterminada en count_results.csv).
    NOTA: Las comillas son necesarias en la línea de comandos. Asegúrese de que no haya espacios después de las comillas antes de la ruta del archivo (consulte la figura 2C).
  6. Cuando aparece la siguiente línea de comandos, el procesamiento se ha completado. Los contornos y la hoja de cálculo de resultados ahora están disponibles en la ubicación especificada como directorio de salida en el paso 2.5 (es decir, ruta/hacia/salida; consulte la Figura 2C).
  7. Inspeccione visualmente los contornos para verificar la calidad del recuento. Los resultados ahora se pueden utilizar para normalizar los datos, como se describe en la Sección 4.
    NOTA: Si los contornos parecen tener núcleos perdidos (por ejemplo, los núcleos parecen demasiado débiles) o agrupan grupos de núcleos en un solo elemento (por ejemplo, imagen sobreexpuesta, demasiado fondo, artefactos), el usuario debe consultar la tabla de solución de problemas y es posible que deba volver a la Sección 1 para optimizar la adquisición de imágenes antes de pasar a la Sección 4.

figure-protocol-2
Figura 2: Ejemplos de partes clave del flujo de trabajo para la sección 2. (A) Extraiga los archivos de la carpeta Descargas, teniendo cuidado de hacer clic en la carpeta correcta como lo indica la flecha para permitir la extracción (B) al destino deseado en el paso 2.3. (C) Ejemplos de comandos para los pasos 2.4 y 2.5 y la siguiente línea de comandos que indica la finalización en el paso 2.6. Tenga en cuenta que la ruta del archivo en el paso 2.4 (C) coincide con la ubicación de extracción en el paso 2.3 (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Ejecución del programa automatizado de cuantificación de núcleos como script de Python

  1. Asegúrese de que Python esté instalado en la computadora. Si es necesario, instale Python desde python.org/downloads (preferido) o mediante Anaconda o Miniconda. A la fecha de publicación, este programa ha sido probado con las versiones 3.10-3.12 de Python.
  2. Abra el navegador y navegue hasta https://github.com/rbudnar/nuclei_counter. Haga clic en el botón Código verde y, a continuación, haga clic en Descargar ZIP para descargar el repositorio de código (consulte la Figura 3A).
  3. Utilice las siguientes instrucciones para el sistema operativo Windows. Consulte el paso 3.4 para equipos basados en Mac OS.
    1. En la carpeta Descargas, haga clic con el botón derecho en el archivo y seleccione Extraer todo para extraer los archivos a un equipo local (consulte la figura 3B-C).
    2. En la ubicación del archivo extraído, abra la carpeta denominada nuclei_counter-main. Este es el repositorio de código.
      NOTA: Esto solo necesita ser descargado la primera vez que se utiliza este programa; Simplemente mueva los archivos extraídos a una ubicación de red accesible y tome nota de esa ubicación.
    3. Abra un símbolo del sistema buscando CMD o Símbolo del sistema en la barra de búsqueda. Si Anaconda o Miniconda han instalado Python, abra el símbolo del sistema de Anaconda en lugar de un símbolo del sistema estándar. Esto se puede encontrar escribiendo Anaconda Prompt en la barra de búsqueda.
    4. Utilice el comando cd para cambiar el directorio al repositorio de código y pulse Intro. Consulte la línea de código a continuación, que distingue entre mayúsculas y minúsculas. Asegúrese de que la carpeta denominada nuclei_counter-main esté abierta al copiar la ruta del archivo; el archivo denominado pyproject o pyproject.toml debe estar visible (consulte la figura 3D). Ejemplo de línea de comandos: C:\Users\janedoe>cd [espacio después del cd, luego copiar/pegar la ruta del archivo]
    5. En la siguiente línea de comandos, escriba lo siguiente, incluidos el espacio y el punto (consulte la figura 3D:
      pip install -e .
      NOTA: Los pasos 3.3.5 y 3.3.6 solo deben completarse la primera vez que se ejecuta este programa en cualquier computadora. Si esto ya se ha completado, continúe con el paso 3.3.7. El proceso de instalación puede tardar unos minutos en inicializarse.
    6. Presione Entrar. Al ejecutar este comando, se instalan las bibliotecas necesarias para ejecutar este script e instala el repositorio en un modo editable en caso de que sea necesario realizar ajustes en el código (consulte la figura 3D).
    7. Escriba lo siguiente en la siguiente línea de comandos para cambiar el directorio al directorio de código fuente principal (consulte la figura 3E):
      CD "nuclei_counter"
    8. En la siguiente línea de comandos, escriba lo siguiente y presione Entrar (consulte la figura 3E):
      python count_nuclei.py --img_dir "ruta/a/imágenes" --output_dir "ruta/a/salida" --save_images --output_count_filename "results.csv"
      Donde ruta/a/imágenes es la ruta del archivo a la carpeta que contiene las imágenes que se van a analizar (paso 1.14); path/to/output es la ruta del archivo a la carpeta donde se debe guardar el archivo .csv (el valor predeterminado es el directorio de trabajo actual cuando no se proporciona); y results.csv es el nombre de archivo en el que se guardarán los recuentos resultantes (si no se proporciona, el nombre del archivo de salida se establece de forma predeterminada en count_results.csv).
      NOTA: Las comillas son necesarias en la línea de comandos. Asegúrese de que no haya espacios después de las comillas antes de la ruta del archivo. El script de python leerá los archivos en la ruta de archivo proporcionada y ejecutará el programa de conteo de núcleos para todas las imágenes en el directorio (consulte la Figura 3E). Los recuentos resultantes se guardarán en el archivo de .csv de resultados en la ubicación especificada.
    9. Cuando aparece la siguiente línea de comandos, el procesamiento se ha completado (consulte la figura 3E). Los contornos y la hoja de cálculo de resultados ahora están disponibles en la ubicación especificada como directorio de salida en el paso 3.3.8 (es decir, ruta/hacia/salida).

figure-protocol-3
Figura 3: Ejemplos de partes clave del flujo de trabajo para la sección 3 con el sistema operativo Windows. Para acceder al código, haga clic en el botón verde con la etiqueta Código y (A) descargue el archivo Zip (indicado por flechas). (B) Extraiga haciendo clic con el botón derecho en el archivo Zip (que se muestra en azul) y (C) configurando el destino deseado. (D) Después de abrir el símbolo del sistema, ejemplos de comandos para los pasos 3.3.4 y 3.3.5. Tenga en cuenta que el comando para el paso 3.3.5 está todo en una línea; el texto que comienza con "Obteniendo archivo" en la siguiente línea aparece después de presionar enter (paso 3.3.6; es decir, ejecutar el comando). (E) Ejemplos de comandos para los pasos 3.3.7 y 3.3.8, una barra de progreso después de la ejecución del paso 3.3.8 y la línea de comandos que muestra la finalización en el paso 3.3.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Utilice las siguientes instrucciones para Mac OS.
    1. En la carpeta Descargas, haga clic en el menú Archivo y seleccione Abrir para extraer los archivos en el equipo local (consulte la Figura 4A).
    2. En la ubicación del archivo extraído, abra la carpeta denominada nuclei_counter-main. Este es el repositorio de código.
      NOTA: Esto solo necesita ser descargado la primera vez que se utiliza este programa; Simplemente mueva los archivos extraídos a una ubicación de red accesible y tome nota de esa ubicación.
    3. Abra un terminal presionando comando + barra espaciadora que abre el foco; A continuación, busca "terminal".
    4. Utilice el comando cd para cambiar el directorio al repositorio de código y pulse Intro. Consulte la línea de código a continuación, que distingue entre mayúsculas y minúsculas. Escriba la ruta del archivo en un documento de texto y cópielo en el terminal. Asegúrese de que la ruta del archivo comience con el texto inmediatamente anterior al cd (por ejemplo, /Users/userid en la Figura 4B). Ejemplo de línea de comandos: /Users/janedoe›cd /Users/janedoe/Desktop/nuclei_counter-main
    5. En la siguiente línea de comandos, aparecerá un signo de dólar después del ID de usuario (consulte la figura 4B). Asegúrese de que haya un espacio después del signo de dólar y escriba lo siguiente, incluidos el espacio y el punto al final del comando. Incluya la versión apropiada de Python inmediatamente después de pip sin un espacio: pip3 install -e .
      NOTA: Los pasos 3.4.5 y 3.4.6 solo deben completarse la primera vez que se ejecuta este programa en cualquier computadora. Si esto ya se ha completado, continúe con el paso 3.4.7. El proceso de instalación puede tardar unos minutos en inicializarse.
    6. Presione Entrar. Al ejecutar este comando, se instalan las bibliotecas necesarias para ejecutar este script e instala el repositorio en modo editable en caso de que sea necesario realizar ajustes en el código.
    7. En la siguiente línea de comandos, asegúrese de que haya un espacio después del signo de dólar y, a continuación, escriba lo siguiente para cambiar el directorio al directorio principal del código fuente (consulte la figura 4C):
      CD "nuclei_counter"
    8. En la siguiente línea de comandos, escriba la línea de comandos a continuación. Reemplace el número después de Python por el número de versión correcto si usa una versión que no sea 3. A continuación, pulse Intro (véase la figura 4C):
      python3 count_nuclei.py --img_dir "ruta/a/imágenes" --output_dir "ruta/a/salida" --save_images --output_count_filename "results.csv"
      donde ruta/a/imágenes es la ruta del archivo a la carpeta que contiene las imágenes que se van a analizar (paso 1.14); path/to/output es la ruta del archivo a la carpeta donde se debe guardar el archivo .csv (el valor predeterminado es el directorio de trabajo actual cuando no se proporciona); y results.csv es el nombre de archivo en el que se guardarán los recuentos resultantes (si no se proporciona, el nombre del archivo de salida se establece de forma predeterminada en count_results.csv).
      NOTA: Las comillas son necesarias en la línea de comandos. Asegúrese de que no haya espacios después de las comillas antes de la ruta del archivo. El script de Python leerá los archivos en la ruta de archivo proporcionada y ejecutará el programa de conteo de núcleos para todas las imágenes en el directorio (consulte la Figura 4C). Los recuentos resultantes se guardarán en el archivo de .csv de resultados en la ubicación especificada.
    9. Cuando aparece la siguiente línea de comandos, el procesamiento se ha completado (consulte la figura 4C). Los contornos y la hoja de cálculo de resultados ahora están disponibles en la ubicación especificada como directorio de salida en el paso 3.4.8 (es decir, ruta/hacia/salida).
  2. Inspeccione visualmente los contornos para verificar la calidad del recuento. Los resultados ahora se pueden utilizar para normalizar los datos, como se describe en la Sección 4.
    NOTA: Si los contornos parecen tener núcleos perdidos (por ejemplo, los núcleos parecen demasiado débiles) o agrupan grupos de núcleos en un solo elemento (por ejemplo, imagen sobreexpuesta, demasiado fondo, artefactos), el usuario debe consultar la Tabla 1 y es posible que deba volver a la Sección 1 para optimizar la adquisición de imágenes antes de pasar a la Sección 4.

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Figura 4: Ejemplos de partes clave del flujo de trabajo para la sección 3 utilizando Mac OS. Después de descargar el código (consulte la Figura 3A), (A) extraiga haciendo clic en el archivo Zip (que se muestra en azul) y establezca el destino deseado. (B) Después de abrir el terminal, ejemplos de comandos para los pasos 3.4.4 (cambiar el directorio al repositorio de código) y 3.4.5 (instalar pip). (C) Ejemplos de comandos para los pasos 3.4.7 y 3.4.8, una barra de progreso después de la ejecución del paso 3.4.8 y la línea de comandos que muestra la finalización en el paso 3.4.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Uso de recuentos para normalizar datos experimentales

  1. Abra el archivo results.csv que vincula cada imagen con la cuantificación de núcleos determinada mediante el programa automatizado.
  2. Decida el método de normalización: 1) imagen por imagen (p. ej., si se trata de microscopía de fluorescencia multicolor), 2) normalice los datos como una relación entre el recuento medio de núcleos por muestra frente a una muestra (o condición) de referencia, 3) normalice el recuento de núcleos por muestra (p. ej., extrapole el recuento total de núcleos al área de la muestra). Las recomendaciones para el método de normalización se encuentran en la sección Discusión.
    1. Si la normalización se va a realizar imagen por imagen, simplemente divida los datos experimentales de cada imagen por el número de núcleos de esa imagen.
    2. Para normalizar los datos como una proporción, siga los pasos que se describen a continuación.
      1. Para cualquier muestra en la que se hayan recogido varias imágenes para una sola réplica (por ejemplo, de 10 a 15 imágenes capturadas de un solo pocillo en una placa de 6 pocillos), calcule el número medio de núcleos por imagen. Estos recuentos de núcleos se consideran como el recuento de células, suponiendo células uninucleadas o un número de células fusionadas en células multinucleadas (como con miotubos).
      2. Seleccione una muestra de referencia o una condición de referencia (por ejemplo, el recuento promedio de todas las muestras de la condición de control) y anote el recuento.
      3. Divida el recuento de todas las muestras por ese recuento de referencia, lo que da como resultado un valor de normalización. Si se utilizó una muestra de referencia, utilice el valor de normalización de la muestra de referencia como 1.
        NOTA: Si se utilizara una condición de referencia, el valor medio de normalización en toda la condición sería ahora 1. Las muestras con menos núcleos que la referencia (es decir, menos densas) tendrán valores de normalización inferiores a 1, y las muestras con más núcleos que la referencia (es decir, más densas) tendrán valores de normalización superiores a 1.
      4. Divida los datos experimentales de cada pozo por el valor de normalización calculado correspondiente.
    3. Para normalizar los datos en el recuento de núcleos por muestra, siga los pasos que se describen a continuación.
      1. Para cualquier muestra en la que se hayan recogido varias imágenes para una sola réplica (por ejemplo, de 10 a 15 imágenes capturadas de un solo pocillo en una placa de 6 pocillos), calcule el número medio de núcleos por imagen. Estos recuentos de núcleos se consideran como el recuento de células suponiendo células uninucleadas, o el número de células fusionadas en células multinucleadas (como con miotubos).
      2. Determine el área de superficie del portaobjetos (cubreobjetos), pozo o plato del que se derivaron los datos. Esta información se puede encontrar en la sección de especificaciones en los sitios web de los productos.
      3. Determine el área de cada imagen capturada. Esta información suele estar disponible como metadatos en el software de imágenes o análisis.
      4. Asegúrese de que el área de la superficie de la muestra y el área de la imagen se expresen en las mismas unidades (por ejemplo, mm2). Si no es así, conviértalo a la unidad deseada.
      5. Calcule el recuento total de cada muestra utilizando la siguiente ecuación:
        TC = AC • (SA/IA)
        donde TC es el recuento total, AC es el recuento promedio, SA es el área de superficie, IA es el área de la imagen.
      6. Divida los datos experimentales por el TC correspondiente a la muestra.
  3. Normalizar los datos experimentales y utilizarlos para análisis estadísticos, según corresponda.

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Resultados

Cada ejecución de imagen por lotes produce: 1) un conjunto de archivos de imagen con contornos aplicados que muestran los contornos de los núcleos identificados (Figura 5) y 2) un archivo de .csv (hoja de cálculo) que vincula los nombres de los archivos de imagen y los recuentos asociados. La visualización de los contornos permitirá al usuario evaluar visualmente la calidad del recuento. Específicamente, las imágenes obtenidas de acuerdo con la sección 1 debe...

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Discusión

Nuestro programa de cuantificación de núcleos tiene varias ventajas sobre las opciones existentes: requiere solo habilidades tecnológicas mínimas, está validado para la tarea específica de cuantificación de núcleos y es de código abierto; Este último supera las barreras relacionadas con los costos. En última instancia, este programa proporciona a los biólogos celulares y moleculares una opción adicional para cuantificar núcleos de forma rápida y precisa en imágenes capturadas con microsc...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los fondos para este trabajo fueron proporcionados por los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (R01AG084597; DEL y HYL) y por fondos de puesta en marcha de la Universidad Tecnológica de Texas (DEL). Los autores desean agradecer a los programas de Becarios de Investigación de Pregrado y Becarios TrUE de la Universidad Tecnológica de Texas por brindar apoyo financiero a los investigadores de pregrado que contribuyeron a este trabajo (REH, MRD, CJM, AKW). También agradecemos a los Dres. Lauren S. Gollahon y Michael P. Massett por compartir gentilmente su espacio y equipo de laboratorio.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Computadora con acceso al archivo de resultados del método 2 o 3:consulte el paso 2.6 (para el Método 2) o el paso 3.3.9 o 3.4.9 (para el Método 3)
Computadora con acceso a Internet, navegador moderno,por ejemplo, Google Chrome
Computadora con acceso a Internet, navegador moderno y sistema operativo WindowsVaría VaríaPara Mac, Linux u otro sistema operativo, use el método 3
Computadora con software para la captura de imágenesZeissAxioVisionSe acepta otro software; debe ser compatible con el microscopio de fluorescencia
Ubicación del archivo para la salida (hoja de cálculo de resultados y contornos de imagen)--Puede ser una carpeta nueva y vacía
Microscopio de fluorescenciaZeissAxiovert 200MSe aceptan otros microscopios de fluorescencia; debe estar equipado con cubos de filtro apropiados, objetivo deseado y cámara 
Carpeta que contiene todas las imágenes que se van a cuantificar--Consulte el paso 1.12
Python versión 3.10 o superiorPython-Disponiblepara descarga e instalación gratuitas en https://www.python.org/downloads/ 
Muestras para obtener imágenes:fijas o vivas, teñidas o contrateñidas con tintes de ADN fluorescentes
Software de hoja de cálculoMicrosoftExcelTambién se acepta un software de hoja de cálculo similar

Referencias

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