Estudio de la muerte celular programada inducida por nanopartículas de cobre en bacterias

Resumen

Las nanopartículas de cobre actúan como agentes antimicrobianos al generar especies reactivas de oxígeno. Aquí, se presentan procedimientos que demuestran que las nanopartículas de cobre son efectivas contra tres patógenos clínicamente relevantes y que ciertas vías de muerte celular programada están involucradas en este proceso bactericida.

Resumen

Recientemente, la preocupación por los patógenos multirresistentes y las infecciones incurables ha aumentado debido al uso excesivo y mal uso de los antibióticos. Los nanomateriales, como las nanopartículas metálicas y de óxido metálico, han ganado popularidad en el campo biomédico como posibles nuevas estrategias para combatir patógenos multirresistentes. Este estudio investigó el uso de nanopartículas de cobre (CuNPs) como bactericida contra tres patógenos oportunistas comunes adquiridos en el hospital: Escherichia coli (E. coli), Acinetobacter baumannii (A. baumannii) y Staphylococcus aureus (S. aureus), que están desarrollando cada vez más resistencia a los medicamentos. Se presentan protocolos detallados para sintetizar CuNPs de dos tamaños (20 nm y 60 nm) y evaluar su eficacia bactericida mediante ensayos de colonias. Se exploraron los mecanismos de acción antimicrobiana que subyacen a las CuNPs mediante la evaluación de los cambios en la producción de especies reactivas de oxígeno. Además, se aplicaron cuatro moduladores que inhiben las funciones de las proteínas humanas para estudiar la posible participación de las vías de muerte celular programada (PCD) en la muerte bacteriana. A través de este enfoque, se sugiere la posible aparición de cepas resistentes al cobre, basándose en la investigación sobre las proteínas de homeostasis del cobre, incluidos los reguladores transcripcionales dependientes del cobre. Estos hallazgos proporcionan una metodología completa para estudiar los efectos bactericidas de las CuNP y su papel potencial en el tratamiento de la resistencia a los antibióticos.

Introducción

Las bacterias resistentes a los medicamentos son una causa grave de preocupación en medicina. Su rápida aparición ha reducido la eficacia de los antibióticos convencionales, lo que ha dado lugar a más complicaciones clínicas. Representan una amenaza importante para la salud pública y crean una necesidad urgente de nuevos agentes antimicrobianos. Una vía de investigación son los nanomateriales. Los nanomateriales poseen propiedades fisicoquímicas únicas que les permiten interactuar con los microbios de formas que comprometen su viabilidad. Por ejemplo, las nanopartículas de plata (AgNP) inducen estrés oxidativo en las bacterias, lo que resulta en disfunción de proteínas, ruptura de membrana, daño en el ADN y, en última instancia, muerte celular^. Por otro lado, las nanopartículas de oro (AuNPs) son conocidas por sus propiedades antifúngicas y pueden mejorar el efecto bactericida de los antibióticos al servir como portadores².

Además, las nanopartículas de cobre (CuNP) también han atraído una atención considerable debido a su potente efecto antimicrobiano y su bajo costo de producción. Los estudios sugieren que las CuNPs exhiben actividad bactericida de amplio espectro por la interrupción de la actividad enzimática y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS)³. La carga positiva de las CuNPs facilita su penetración en las bacterias, potenciando su absorción celular⁴. Este mecanismo hace que los CuNPs sean una opción prometedora para el recubrimiento de superficies, como en implantes, para prevenir infecciones³. Un hallazgo interesante, sin embargo, es que el efecto bactericida de las CuNPs parece depender del tamaño. Algunos estudios han encontrado que las CuNPs más pequeñas exhiben una mayor actividad antibacteriana, probablemente debido a su superior relación superficie-volumen⁵.

La generación de ROS causa daños generalizados a las células y bacterias, incluyendo peroxidación lipídica, disfunción proteica, fragmentación del ADN e inhibición de la gluconeogénesis/glucogenólisis, y está involucrada en la necrosis o muerte celular programada (PCD)^6,7,8. Estudios recientes han revelado que existen sistemas de PCD en las bacterias, con modos de acción y efectores similares a los de los sistemas eucariotas⁹. Las comunidades bacterianas pueden inducir PCD en respuesta al estrés, incluido el estrés oxidativo, a través de un sistema toxina-antitoxina (TA)¹⁰. En términos simples, el sistema toxina-antitoxina consiste en toxinas que pueden interrumpir los procesos celulares esenciales y antitoxinas que pueden formar complejos estables con las toxinas para inhibir su toxicidad en condiciones normales de crecimiento. La mayoría de las bacterias y arqueas contienen loci TA en sus genomas, a menudo presentes en múltiples copias de ADN extracromosómico y cromosómico. Existen varios tipos de sistemas TA, siendo de particular interés el tipo II TA (conocido como módulo MazE/MazF). En condiciones de estrés, las antitoxinas se degradan, lo que permite que las toxinas inhiban sus objetivos celulares. En E. coli y S. aureus, la toxina MazF se activa en respuesta a condiciones de estrés como el estrés oxidativo, las altas temperaturas y la inanición de aminoácidos. En consecuencia, la expresión de la antitoxina MazE se reduce, liberando la toxina MazF¹⁰. Los estudios han encontrado que MazF permite la síntesis de proteínas que permiten que una pequeña subpoblación sobreviva en condiciones adversas, mientras que la mayor parte de la población sufre muerte celular mediada por mazEF. Esta muerte celular puede ser dependiente de ROS, donde ROS induce inhibición transcripcional o traduccional, o independiente de ROS, donde el daño en el ADN desencadena las vías de muerte¹¹.

Este estudio explora los mecanismos por los cuales las CuNPs inducen la muerte bacteriana. En lugar de centrarse únicamente en el sistema de TA, se emplearon cuatro moduladores de PCD, utilizados previamente en nuestra investigación ^7,12, para investigar las posibles vías de PCD en las bacterias.

Al examinar los efectos bactericidas de las CuNPs de dos tamaños diferentes (20 y 60 nm) a diferentes concentraciones, y utilizar métodos como los ensayos de colonias, la detección de ROS y los moduladores de PCD (SBI, Z-VAD, NSA y Wortmannin), esta investigación destaca que la PCD no es exclusiva de los organismos multicelulares, sino que también ocurre en comunidades bacterianas bajo estrés. Al proporcionar protocolos detallados, este trabajo tiene como objetivo permitir a los investigadores evaluar la eficacia de CuNP y los mecanismos bactericidas en sus propios sistemas. Además, estos hallazgos avanzan en la comprensión de la PCD bacteriana y respaldan el desarrollo de terapias basadas en CuNP para combatir las bacterias resistentes a los antibióticos.

Protocolo

Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de nanopartículas de cobre

1. Obtenga nanopolvos de cobre comerciales (25 nm y 60-80 nm) de una fuente comercial.
2. Utilice dodecil sulfato de sodio (SDS) de 1,0 mM como dispersante para dos tamaños de nanopartículas de 1 mg/mL.
3. Disperse las nanopartículas mediante un baño ultrasónico durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Las nanopartículas completamente dispersas están listas para su uso en experimentos posteriores.

2. Preparación de bacterias

1. Obtenga la cepa 25922 de E. coli (Migula) Castellani y Chalmers y la cepa A. baumannii Bouvet y Grimont de la Colección Americana de Cultivos Tipo. Obtener S. aureus del Centro de Investigación y Recolección de Recursos Biológicos.
2. Cultivar las bacterias en caldo Luria-Bertani (LB) en condiciones aeróbicas a 37 °C.
3. Diluir los cultivos bacterianos en medio LB hasta una densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) de aproximadamente 0,5.

3. Evaluación de la viabilidad celular

1. Ensayo de colonias
   1. Utilice soluciones madre de CuNP (1 mg/mL) para preparar varias concentraciones de dos tamaños de CuNPs, incluyendo 0 μg/mL, 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL y 100 μg/mL.
   2. Divida los cultivos bacterianos preparados en el paso 2.3 en tubos de microcentrífuga y centrifugue a 3300 × g durante 10 min a temperatura ambiente.
   3. Retenga los gránulos bacterianos y agregue diferentes concentraciones de dos tamaños de CuNP, respectivamente, con un pipeteo suave.
   4. Trate los gránulos bacterianos con PBS y alcohol al 70% como controles negativos y positivos, respectivamente.
   5. Incubar todas las bacterias tratadas agitando a 200 rpm a 37 °C durante 24 h.
   6. Después de la incubación, lave todas las bacterias tratadas con PBS y extiéndalas en placas de agar LB. Coloque las placas en una incubadora a 37 °C durante 24 h.
   7. Cuente el número de colonias en cada grupo de tratamiento al día siguiente y realice un análisis estadístico. Se recomienda realizar esto por triplicado para mayor precisión estadística.
2. Estudio del mecanismo bactericida
   1. Prepare las bacterias como se describe en el paso 3.1.2 y trátelas con 5 μM de SBI-0206965 (SBI) durante 2 h, 0,5 μM de necrosulfonamida (NSA) durante 1 h, 100 nM de wortmannina (mosto) durante 30 min, o 100 nM de Z-VAD-FMK (Z-VAD) durante 30 min.
   2. Tratar conjuntamente las bacterias con diferentes concentraciones de dos tamaños de soluciones de CuNP, como se describe en el paso 3.1.1, en presencia o ausencia de 5 μM de SBI, 0,5 μM de NSA, 100 nM de mosto y 100 nM de Z-VAD.
   3. Centrifugar las bacterias después de los tratamientos con moduladores (paso 3.2.1) y eliminar los sobrenadantes.
   4. Vuelva a suspender los gránulos bacterianos en soluciones preparadas en el paso 3.2.2 e incubelos agitándolos a 200 rpm a 37 °C durante 24 h.
   5. Tratar las bacterias con etanol al 70% y PBS como controles positivos y negativos, respectivamente. Utilice una solución sin CuNPs como control en blanco de CuNP (0 μg/mL; simulado) en las mismas condiciones de inhibidor para cada grupo. Incubar todas las muestras durante 24 h adicionales.
   6. Después de la incubación, agregue reactivo de viabilidad celular a los cultivos en una proporción de volumen de 1:10. Incubar los cultivos durante otras 2 h agitando a 37 °C.
   7. Centrifugar los cultivos (paso 3.1.2) después de las 2 h de incubación. Transfiera los sobrenadantes fluorescentes a placas de 96 pocillos. Mida la fluorescencia utilizando una longitud de onda de excitación de 560 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm con un lector de microplacas.
   8. Diluir el sobrenadante restante a ^10-5 y ^10-4 y extenderlo en placas de agar LB para su cultivo.
   9. Cuente las colonias individuales al día siguiente.

4. Detección de especies reactivas de oxígeno

1. Prepare los cultivos bacterianos como se describe en el paso 2.3 y divídalos en tubos de microcentrífuga.
2. Tratar las bacterias con diversas condiciones de estrés como grupos de control positivos inductores de ROS (datos no mostrados en los resultados). Los tratamientos se describen en los pasos 4.2.1-4.2.4.
   1. Exponga las bacterias a una luz ultravioleta de 405 nm durante 3 h. Incubar las bacterias a 45 °C durante 2 h.
   2. A continuación, incubar las bacterias a 4 °C durante 2 h.
   3. Tratar las bacterias con 3% H₂O₂ durante 30 min.
   4. Mantener las bacterias a 37 °C en caldo LB como control negativo.
3. Prepare varias concentraciones de CuNPs como se describe en el paso 3.1.1, y trate las bacterias con CuNPs de 20 nm o 60 nm a concentraciones de 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL y 100 μg/mL durante 24 h.
4. Lave las bacterias incubadas dos veces con PBS para eliminar las nanopartículas restantes.
5. Prepare el colorante de diacetato de 2′,7′-diclorodiclorofluoresceína (H₂DCFDA) en PBS a una concentración final de 5 μM.
6. Vuelva a suspender los gránulos bacterianos en 5 μM de_H2DCFDA y mida la intensidad de fluorescencia a una emisión de 520/30 nm utilizando un citómetro de flujo.
   NOTA: La intensidad de la fluorescencia verde FL1 se correlaciona con el nivel de ROS en el cultivo tratado. Se recomienda realizar esto por triplicado para mayor precisión estadística.

Resultados

Actividades antimicrobianas de CuNPs de dos tamaños en tres patógenos
Se utilizaron tres patógenos oportunistas (E. coli, S. aureus y A. baumannii) para probar las actividades bactericidas de los CuNPs. Las bacterias se trataron con 0 μg/mL, 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL y 100 μg/mL de CuNPs de 20 nm o 60 nm, y las actividades bactericidas se determinaron utilizando la concentración bactericida mínima (CMM) derivada de los recuentos de colonias. Nuestros resultados mo...

Discusión

Este estudio investigó los efectos y mecanismos antimicrobianos de las CuNPs en dos tamaños y diferentes concentraciones contra E. coli, S. aureus y A. baumannii. Utilizando los protocolos establecidos, se observó que los efectos bactericidas inducidos por CuNP involucran estrés oxidativo y potencial activación de PCD. Sin embargo, la interacción entre la homeostasis de los metales y las respuestas bacterianas al estrés sigue siendo en gran medida inexplorada. ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acinetobacter baumannii Variedad Bouvet y Grimont	Colección de cultivos tipo americano (ATCC), Manassas, VA, EE. UU.	17978	Bacterias para el experimento de toxocidad de CuNP
Bio-Rad iMark Lector de microplacas	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.	168-1130	Se utiliza para medir la absorbancia en ensayos de viabilidad bacteriana.
diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína permeable en células  (H2DCFDA)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE. UU.	D6883	Se utiliza para detectar especies reactivas de oxígeno (ROS) en células bacterianas tratadas.
Nanopartículas de cobre (CuNP) 25 nm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	774081	Se utiliza para preparar una solución madre de CuNP
Nanopartículas de cobre (CuNP) de 60-80 nm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	774103	Se utiliza para preparar una solución madre de CuNP
Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA	25922	Bacterias para el experimento de toxocidad de CuNP
Citómetro de flujo Gallios	Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU		. Se utiliza para el análisis de citometría de flujo en múltiples experimentos, incluida la detección de especies reactivas de oxígeno.
Agar LB	FocusBio, Miaoli, Taiwán	LBA500	Utilizado para el cultivo
de bacterias Caldo Luria-Bertani (LB)	Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA	244620	Utilizado para el cultivo de bacterias
Necrosulfonamida (NSA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	480073	Utilizado como modulador para el pretratamiento en estudios de vías de muerte bacteriana.
Reactivo de viabilidad celular PrestoBlue	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	P50200	Se utiliza para evaluar la viabilidad celular mediante fluorescencia.
SBI-0206965 (SBI)	BioVision, Milpitas, CA, USA	9580	Se utiliza como modulador para el pretratamiento en estudios de vías de muerte bacteriana.
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	L4509	Se utiliza como dispersante de nanopartículas de cobre para reducir la agregación.
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwán	13567	Bacterias para el experimento de toxocidad
CuNP Lector de microplacas multimodo Varioskan LUX	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	VLBLATGD2	Utilizado para medir la fluorescencia en ensayos de viabilidad celular
Wortmannin (Wort)	Abcam, MA, USA	ab120148	Se utiliza como modulador para el pretratamiento en estudios de vías de muerte bacteriana.
Z-VAD-FMK (Z-VAD)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	V116	Se utiliza como modulador para el pretratamiento en estudios de vías de muerte bacteriana.