Artículo de método

Detección basada en fluorescencia de la actividad de la nucleasa FEN1 y cribado de inhibidores de moléculas pequeñas

DOI:

10.3791/67968

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27 de junio de 2025

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1School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe un ensayo bioquímico de cambio de gel para medir la actividad de FEN1 (endonucleasa 1 de colgajo) y el desarrollo de inhibidores.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FEN1 (Flap Endonucleasa 1) es una nucleasa de ADN clave involucrada en la replicación del ADN y la reparación de daños, desempeñando un papel crucial en el mantenimiento de la estabilidad genómica. Los niveles elevados de actividad de FEN1 están estrechamente asociados con el desarrollo de varios cánceres, lo que convierte a FEN1 en un biomarcador reconocido y un objetivo farmacológico para los cánceres de pulmón, mama y próstata. Los métodos convencionales de marcaje con radioisótopos para detectar la actividad de la nucleasa FEN1 presentan desafíos en términos de conveniencia y seguridad. En este estudio, se sintetizó in vitro un sustrato de fragmento de ADN con una estructura de colgajo. Este sustrato está marcado con un fluoróforo en el extremo 5' de la solapa, lo que permite que la nucleasa FEN1 reconozca y escinda específicamente el sitio designado. A continuación, se determinó la actividad de FEN1 mediante la detección de la señal de fluoróforo después de la electroforesis en gel. Este método permite una evaluación rápida y eficaz de la actividad de la nucleasa FEN1 y el cribado de sus inhibidores. Proporciona un enfoque sensible y específico para analizar la actividad de FEN1 y evaluar la eficacia de los inhibidores de moléculas pequeñas. Además, contribuye significativamente a la investigación sobre la reparación del daño en el ADN y el desarrollo del cáncer, ofreciendo una estrategia novedosa para la investigación clínica sobre los mecanismos de la enfermedad y la detección de sustancias genotóxicas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La replicación del ADN no siempre es perfecta y puede verse interrumpida tanto por factores internos como externos. En consecuencia, los mecanismos de replicación del ADN y reparación de daños son vitales para la supervivencia celular y la estabilidad del genoma. En este proceso, la endonucleasa específica de la estructura ramificada humana FEN1 (Flap Endonucleasa 1), una nucleasa central del ADN, desempeña un papel crucial 1,2,3.

FEN1 está implicado principalmente en la replicación del ADN y es indispensable para la maduración de los fragmentos de Okazaki en la hebrarezagada 4,5. Esto asegura la progresión eficiente de la replicación del ADN y la reparación precisa del ADN dañado. Sin embargo, los aumentos anormales en los niveles de FEN1 se han relacionado estrechamente con el desarrollo de varios cánceres 6,7, como el cáncer de pulmón y de mama7. Por lo tanto, FEN1 no solo es esencial para la replicación y reparación del ADN, sino que también ha atraído una atención significativa como biomarcador para el diagnóstico de cáncer y un potencial objetivo terapéutico 8,9. La detección de la actividad de FEN1 es esencial para el diagnóstico precoz de los cánceres y para avanzar en la investigación de terapias dirigidas.

Dada la importancia de FEN1 y la necesidad de estudiar su actividad para el diagnóstico precoz del cáncer y el desarrollo de terapias dirigidas, el objetivo principal del método desarrollado en este experimento fue medir de manera precisa y eficiente la actividad de la nucleasa de FEN1. Este método tiene como objetivo proporcionar una plataforma fiable para el cribado de inhibidores de moléculas pequeñas dirigidos a FEN1. Con la consecución de estos objetivos, el estudio pretende contribuir a una mejor comprensión del papel de FEN1 en el cáncer y facilitar el descubrimiento de nuevas estrategias terapéuticas.

Existen numerosas técnicas para detectar la actividad de la nucleasa FEN1, cada una con características, principios, ventajas, limitaciones y escenarios aplicables distintos. Por ejemplo, la electroforesis en gel y los métodos de separación de sustratos basados en HPLC proporcionan resultados intuitivos, pero implican procedimientos engorrosos y un bajo rendimiento10,11. Los ensayos de polarización de fluorescencia (FP) enfrentan desafíos en la evaluación de la actividad de FEN1 debido a la interferencia de la autofluorescencia compuesta o la dispersión de la luz, que afecta las señales de FP. Aunque las estrategias de contracribado pueden excluir parcialmente los falsos positivos, aproximadamente el 15% de los compuestos activos primarios siguen siendo identificados erróneamente debido a la interferencia técnica12. El uso combinado de pares donante/extintor de fluorescencia (por ejemplo, TAMRA/BHQ-2) y la quimioluminiscencia AlphaScreen presenta inconvenientes, como el alto costo de síntesis de sustratos fluorescentes complejos de triple solapa, lo que limita particularmente su utilidad en el cribado a gran escala. Además, la estructura de doble colgajo de los sustratos puede impedir una unión óptima con FEN1, lo que reduce la eficiencia de la escisión enzimática y compromete la sensibilidad de detección. Además, este enfoque depende en gran medida de instrumentos especializados (por ejemplo, ViewLux, EnVision), lo que restringe su adopción en laboratorios de recursos limitados 13,14,15. Los métodos de detección fluorescente basados en nanosondas de ADN en forma de mancuerna de doble solapa funcionalizadas con nanoclústeres de plata (ADN-AgNC) sufren de variabilidad de lote a lote debido a su dependencia de pasos precisos de recocido y nucleación in situ, lo que dificulta la reproducibilidad y la escalabilidad. Los elevados costos y la lentitud de los procedimientos limitan aún más su aplicación práctica16.

En este artículo, se desarrolla un ensayo basado en el marcaje de fluorescencia para abordar las limitaciones técnicas actuales y satisfacer la creciente demanda de métodos más seguros y accesibles para el usuario para estudiar la actividad de FEN1. Esta técnica aprovecha la especificidad y la alta sensibilidad de la detección de fluorescencia, así como la capacidad de diseñar sustratos de ADN con estructuras definidas que pueden ser reconocidas y escindidas por FEN1 (Figura 1). Este método agiliza los procedimientos experimentales al tiempo que mantiene una alta precisión en la evaluación de la actividad de la nucleasa FEN1. En comparación con la electroforesis en gel tradicional y las técnicas basadas en HPLC, ofrece un funcionamiento simplificado y una respuesta más rápida. A diferencia de los ensayos de polarización de fluorescencia, este enfoque permite un rápido cribado cualitativo de compuestos, estableciendo una estrategia eficiente para la evaluación enzimática preliminar.

Este método es adecuado para estudiar la actividad de la nucleasa FEN1 en entornos de laboratorio donde el acceso a materiales radiactivos es limitado. También es adecuado para el cribado de un gran número de inhibidores de moléculas pequeñas en un tiempo relativamente corto, especialmente cuando se requiere una alta sensibilidad y especificidad. Sin embargo, no es ideal para estudios que requieren una cuantificación absoluta con una precisión muy alta o para laboratorios que carecen de equipos básicos de detección de fluorescencia y experiencia en el análisis de señales de fluorescencia. Para los estudios centrados en aplicaciones in vivo , en las que el comportamiento de FEN1 puede estar influenciado por factores biológicos complejos que no se replican en los diseños actuales de ensayos in vitro , puede ser necesario un mayor refinamiento o métodos alternativos.

Este ensayo de fluorescencia es altamente sensible y específico, lo que proporciona una herramienta segura, conveniente y eficaz para estudiar la actividad de FEN1 y desarrollar sus inhibidores.

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Protocolo

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Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Purificación de la expresión de la proteína FEN1

  1. Purificación de proteínas
    1. Retire el stock bacteriano que contiene el plásmido objetivo (consulte la tabla de materiales) a -80 °C. Descongele a temperatura ambiente e inocule 200 μL de los tubos de microcentrífuga congelados de 1,5 mL en un medio de 20 mL LB que contenga 50 μg/mL de kanamicina utilizando una punta de pipeta de 200 μL.
      NOTA: La cepa es E. coli BL21(DE3)-FEN1.
    2. Incubar a 37 °C con agitación a 160 rpm durante 12 h.
    3. Transfiera la suspensión bacteriana a un matraz Erlenmeyer de 200 mL que contenga medio LB suplementado con 50 μg/mL de kanamicina. Continuar la incubación a 37 °C con agitación a 160 rpm durante 2-3 h.
    4. Cuando el OD600 del cultivo alcance aproximadamente 0,6, añadir 2 mL de IPTG (concentración final: 1 mM). Continuar la incubación a 25 °C, 160 rpm durante 10 h.
    5. Transfiera el cultivo inducido a un tubo de centrífuga de 50 mL previamente pesado. Centrifugar a 4 °C y 2500 × g durante 15 min. Deseche el sobrenadante. Pese el tubo que contiene gránulos y reste el peso del tubo vacío para calcular la masa de gránulos.
    6. Agregue 7 mL de tampón de lisis por gramo de pellet de celda húmeda. Utilice una pipeta para volver a suspender el pellet a fondo pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
      NOTA: El tampón de lisis (10 mL en total) contiene 20 mM de Tris-HCl, 250 mM de NaCl, 2% de Triton X-100 y ddH2O. Realice este paso en una campana extractora para garantizar un manejo seguro de los reactivos químicos.
    7. Transfiera la suspensión bacteriana en tampón de lisis a un congelador de -80 °C y congele durante la noche. Al día siguiente, descongele la suspensión en un agitador de 4 °C durante 1 h para mejorar la eficiencia de la lisis.
    8. Lisar las células mediante ultrasonidos al 75% de potencia durante 45 min. Centrifugar el lisado a 12.000 × g durante 20 min a 4 °C para separar el sobrenadante del pellet.
      NOTA: Si el lisado permanece turbio, aumente el volumen del tampón de lisis o repita los ciclos de congelación y descongelación. También se puede agregar un inhibidor de la nucleasa para preservar la integridad de la proteína y prevenir la degradación.
    9. Aplique el sobrenadante clarificado a lo largo de la pared de un tubo que contenga resina de purificación de proteínas preparada. Lavar con 10 mL de tampón de elución para eliminar las proteínas no unidas específicamente.
      NOTA: El tampón de elución contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 250 mM de NaCl, 2% de Triton X-100, 200 mM de imidazol y agua destilada.
    10. Eluir la proteína FEN1 añadiendo 5 mL de tampón de elución a lo largo de la pared interna del tubo.
  2. Identificación de proteínas diana mediante tinción rápida de azul brillante de Coomassie
    1. Prepare los geles SDS-PAGE con un 12% de gel separador y un 5% de gel apilable de acuerdo con el tamaño esperado de FEN1.
    2. Mezcle la muestra de proteína objetivo y el estándar BSA con un tampón de muestra de 5× en una proporción de 1:4. Calentar la mezcla a 95 °C durante 5 min para desnaturalizar completamente las proteínas.
    3. Cargue 20 μL de cada una de las muestras de proteínas estándar y desnaturalizadas de BSA en pocillos separados del gel SDS-PAGE.
    4. Conecte el aparato de electroforesis. Ajuste el voltaje a 90 V y funcione durante 1 h y 40 min.
    5. Después de la electroforesis, transfiera el gel a un recipiente para teñir. Enjuague con agua desionizada, luego agregue 30 ml de solución de tinción de proteínas y tiña durante 25 minutos. Recupere la solución de tinción, enjuague el gel con 20 ml de agua desionizada y decolore durante la noche en un agitador horizontal.
    6. Después de la decoloración, coloque el gel en un plato de plástico transparente y observe las bandas de proteínas bajo luz blanca.
      NOTA: Si las bandas son tenues o la concentración de proteínas es baja, concentre la muestra utilizando tubos de ultrafiltración. Este paso elimina el exceso de disolvente y moléculas pequeñas, mejorando la concentración de proteínas y asegurando un análisis preciso en experimentos posteriores.

2. Preparación de sustrato de ADN marcado con FEN1 TAMRA

  1. Preparación de sustratos de ADN marcados con TAMRA
    1. Diseñar hebras de oligonucleótidos de ADN en función de la actividad de escisión específica de FEN1, haciendo referencia a los métodos publicados17 (ver Tabla 1). El extremo 5' de la secuencia D1 se modifica con una etiqueta TAMRA fluorescente.
    2. Añadir oligonucleótidos de ADN monocatenario mezclados a 10 μL de tampón de recocido en los siguientes volúmenes: 5 μL de D1 (10 pmol/μL), 10 μL de T1 (10 pmol/μL) y 7,5 μL de U2 (10 pmol/μL). Agregue agua desionizada para llevar el volumen total a 50 μL.
      NOTA: El tampón de recocido contiene 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5) y 10 mM de MgCl2.
    3. Calentar la mezcla de reacción en un baño de metal a 100 °C durante 1 min, luego transferirla inmediatamente a 72 °C durante 10 min18.
      NOTA: El sustrato final del ADN tiene 80 nucleótidos de longitud. La alta temperatura inicial (100 °C) garantiza la desnaturalización, mientras que la temperatura de recocido (72 °C) promueve un emparejamiento preciso de las hebras.
    4. Apague la fuente de calor y deje que la solución se enfríe gradualmente a temperatura ambiente, formando el sustrato completo de ADN de doble cadena.
  2. Ensayo de sustrato de ADN marcado con TAMRA
    1. Prepare un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 12% mezclando 4,8 mL de acrilamida al 30% (29:1), 4,32 mL de urea 6 M, 2,4 mL de 5× TBE, 50 μL de APS al 10%, 5 μL de TEMED y 0,48 mL de agua desionizada. Mezclar bien para preparar el gel.
    2. Coloque el gel en un horno a 37 °C durante 30 min para que se solidifique.
    3. Para la detección, pipetee 2 μL del sustrato de ADN sintetizado en 18 μL de agua destilada y agregue 7,7 μL de tampón Stop.
    4. Como referencia, pipetee 2 μL de D1 marcado con TAMRA en 18 μL de agua destilada y agregue 7,7 μL de tampón de parada.
    5. Cargue 20 μL de cada muestra preparada en el gel y realice la electroforesis SDS-PAGE para analizar la formación de sustrato de ADN.

3. Ensayo de actividad de la nucleasa FEN1

  1. Ensayo de actividad de la enzima FEN1
    1. Prepare 20 μL de mezcla de reacción combinando 2 μL de sustrato de ADN con nucleasa FEN1 en el tampón de reacción.
      NOTA: El tampón de reacción consta de 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM de MgCl2, 2 mM de DTT, 0,2 mg/mL de BSA y agua desionizada.
    2. Incubar la mezcla de reacción a 37 °C en un baño de metal durante 15 min.
    3. Termine la reacción añadiendo 20 μL de tampón de terminación 2×.
    4. Cargue 20 μL de la muestra reaccionada sobre un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 12% preparado previamente y realice la electroforesis a 100 V durante 60 min.
    5. Después de la electroforesis, visualice los resultados utilizando un sistema de imágenes de fluorescencia (vía 600).

4. Cribado de inhibidores de moléculas pequeñas de la nucleasa FEN1

  1. Cribado de inhibidores de moléculas pequeñas
    1. Utilice una pipeta para transferir 2 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    2. Agregue 2 μL de nucleasa FEN1 y 10 μL de tampón de reacción 2× al tubo.
    3. Mezclar bien e incubar la mezcla en hielo durante 10 min.
    4. Agregue 2 μL de sustrato de ADN y 4 μL de agua desionizada, mezcle bien para llevar el volumen total de reacción a 20 μL.
    5. Prepare una dilución de trabajo del inhibidor de la nucleasa FEN1, FEN1-IN-4, realizando una dilución en serie doble de una solución madre de 1 M en DMSO.
    6. Pipetear 2 μL de nucleasa FEN1 (0,03 μg/μL) y 2 μL del inhibidor de FEN1-IN-4 diluido en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Añadir 10 μL de tampón de reacción 2× y 4 μL de agua desionizada. Mezclar suavemente e incubar en hielo durante 10 minutos para asegurar una interacción suficiente entre el inhibidor y la enzima.
    7. Agregue 2 μL de sustrato de ADN al tubo para formar una mezcla de reacción final de 20 μL.
    8. Incubar la reacción a 37 °C en un baño metálico durante 15 min.
    9. Termine la reacción añadiendo 20 μL de tampón de terminación 2×.

5. Evaluación de la potencia inhibitoria del inhibidor de molécula pequeña FEN1--IN-4

  1. Utilice una micropipeta para tomar 10 μL de tampón de reacción de 2× y añadirlo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  2. Añadir 2 μL de nucleasa FEN1 a una concentración de 0,03 μg/μL, así como 2 μL de inhibidor de FEN1 FEN1-IN-4 a diferentes concentraciones.
    NOTA: Se deben establecer múltiples gradientes de concentración de acuerdo con los requisitos experimentales.
  3. Añadir 4 μL de agua desionizada y mezclar bien la solución. Coloque el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en hielo e incube durante 10 minutos.
  4. Agregue 2 μL de sustrato de ADN bicatenario al tubo para formar un sistema de reacción de 20 μL.
  5. Coloque el tubo EP en un baño metálico a 37 °C durante 15 min.
  6. Una vez completada la reacción, añada 20 μL de tampón de parada de 2× a la mezcla de reacción para finalizar la reacción.
  7. Observe los resultados utilizando un dispositivo de imágenes de fluorescencia y trace la curva IC50 19.
    NOTA: La cuantificación de la intensidad de fluorescencia se realizó utilizando Fiji/ImageJ20, seguido de análisis estadístico y visualización con software de gráficos y análisis21.

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Resultados

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Como se muestra en la Figura 2A, el reactivo de tinción se une a la proteína, lo que hace que la proteína aparezca como una banda azul en el gel. El primer carril contiene la proteína marcada utilizada como referencia de peso molecular, en la que la banda de proteína estándar BSA corresponde a un peso molecular de 70 kDa, y la banda de proteína de ácido nucleico FEN1 corresponde a un peso molecular de 45 kDa. Los resultados experimentales mostraron que la nucleasa FEN1 apareció como una band...

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Discusión

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El ensayo de actividad de la nucleasa FEN1 y el cribado de inhibidores de moléculas pequeñas son fundamentales para la investigación sobre la reparación del daño en el ADN y el desarrollo del cáncer. En comparación con las técnicas tradicionales de radiomarcaje, el método actual ofrece una alternativa rentable, eficiente, fácil de operar y más segura. Además, a diferencia de los ensayos FEN1 basados en ráfagas de fluorescencia, este enfoque proporciona una visualización más intuitiva de ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo contó con el apoyo del Equipo de Investigación Innovadora de Ciencia y Tecnología de la Institución de Educación Superior de Jiangsu (2021), el Programa del Centro de Investigación de Tecnología de Ingeniería del Colegio Vocacional de Jiangsu (2023), el Programa de Tecnología Clave de los Proyectos Tecnológicos de Sustento del Pueblo de Suzhou (SYWD2024099), el Proyecto del Laboratorio Estatal Clave de Medicina Radiológica y Protección, la Universidad de Soochow (GZK12023013), los Programas del Colegio de Salud Vocacional de Suzhou (SZWZYTD202201, SZWZYTD202205), y el Proyecto Qing-Lan de la provincia de Jiangsu en China (2021, 2022).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 M Tris-HCLTiempo de beyo.ST774
30% Acr-Bis (29:1)Tiempo de beyo.ST003-500ml
5M NaclTiempo de beyo.ST347
BeyoBlue PlusTiempo de beyo.P0003S
BL21(DE3)-FEN1VazymeC504-F1
BSATiempo de beyo.P0007
Agitador decoloranteKylin-BellTS-100
DL-DitiotreitolTiempo de beyo.ST041
Incubadora de baño secoRUICHENG200 dirhams
Aparato de electroforesisBei jing Liuyi BiotechnologyDDY-6D
FEN1 EN 4ObjetivoMOLT8545
IPTGTakaba9030
Lodo de kanamicinaBiosharpBS152
Centrífuga de laboratorioTermoSL 16R
LB CaldoSolarbioL8291
Ni-NTA Su Bind Resina7se biotecnologíaPANF001-001C
Odisea FCODISEALI-COR
SDS-PÁGINATiempo de beyo.P0015L
Trición-x-100ShyuanyeS15022

Referencias

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