El flujo de trabajo optimizado para el blanqueo iterativo amplía la obtención de imágenes de multiplexidad de muestras clínicas altamente autofluorescentes

Summary

La implementación de una técnica de fotoirradiación versátil y de bajo coste con el método manual IBEX permite obtener una imagen óptima del tejido humano con una importante autofluorescencia nativa. Este protocolo detalla cómo obtener imágenes multiplexadas de portaobjetos completos a partir de muestras clínicas archivadas utilizando un microscopio invertido, reactivos ampliamente disponibles y software de código abierto para la alineación y el procesamiento de imágenes.

Abstract

La prevalencia de enfermedad pulmonar por micobacterias no tuberculosas (MNT) ha aumentado a nivel mundial. Aunque la enfermedad pulmonar inducida por MNT a menudo se presenta con bronquiectasias, nódulos pulmonares y enfermedad cavitaria, la respuesta del huésped asociada con estos patrones distintivos de lesión pulmonar no se ha caracterizado bien in situ. Buscamos evaluar los mecanismos de la patología inducida por NTM mediante la realización de un análisis fenotípico profundo de las poblaciones de células inmunitarias en el tejido pulmonar de individuos con enfermedad NTM en comparación con un estándar de oro de inflamación granulomatosa, la enfermedad pulmonar tuberculosa (TB).

Los bloques pulmonares fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE) de pacientes con MNT diseminada, MNT pulmonar o enfermedad de tuberculosis pulmonar se seccionaron y teñieron siguiendo una versión modificada del método de imágenes Iterative Bleaching Extends multi-pleXity (IBEX). En primer lugar, se requirió la optimización del método IBEX para abordar la fluorescencia endógena significativa de las secciones pulmonares debido a la alta densidad de colágeno, elastina y eritrocitos nativos del tejido pulmonar que empeora con la preservación de FFPE y la edad de los bloques de FFPE. En este protocolo, detallamos un protocolo de fotoirradiación y un método de recuperación de antígenos modificados que reduce la autofluorescencia de las muestras clínicamente archivadas.

Además, proporcionamos orientación sobre el diseño del panel de anticuerpos, incluidos los desafíos comunes como la reactividad cruzada, la pérdida de epítopos después de la fotoirradiación, la superposición espectral entre fluoróforos adyacentes y la baja relación señal-ruido para ciertos objetivos. Para facilitar la obtención de imágenes eficientes de secciones completas de tejido pulmonar, las imágenes de los portaobjetos se obtuvieron con un microscopio de campo amplio y se posprocesaron con software de código abierto para mejorar la calidad de la imagen. En conjunto, este flujo de trabajo aborda una necesidad crítica al documentar cómo obtener imágenes de portaobjetos completos altamente multiplexadas y de alta resolución a partir de muestras desafiantes utilizando instrumentación y reactivos ampliamente disponibles. Más allá de las imágenes cuantitativas de muestras clínicas, estas técnicas se pueden aplicar a diversos tipos de muestras para superar las fuentes endógenas y exógenas de fluorescencia.

Introduction

La tuberculosis (TB) es una de las principales causas de muerte, con aproximadamente 1,3 millones de personas que mueren cada año a causa de la infección por tuberculosis¹. Aunque no es tan letal como la tuberculosis, en los últimos años se ha producido un aumento significativo de las infecciones pulmonares y de las enfermedades posteriores causadas por micobacterias no tuberculosas (MNT)². A nivel tisular, la respuesta inmune del huésped a la infección pulmonar por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ha sido bien estudiada e incluye la formación de granulomas, agregados heterogéne....

Protocol

Las secciones de tejido pulmonar de autopsia y resección quirúrgica archivadas se recolectaron bajo el protocolo 09-H-0172 (NCT00943514), Historia Natural de la Bronquiectasia, en el Laboratorio de Patología del Centro Clínico de los Institutos Nacionales de Salud. Este protocolo fue aprobado por el IRB y los participantes dieron su consentimiento informado.

1. Recuperación automatizada de antígenos

NOTA: La desparafinación y la recuperación de antígenos se realizaron utilizando una plataforma automatizada de tinción de investigación (Figura 1). Tr....

Results

El diseño de un panel de imágenes multiplexado basado en anticuerpos requiere mucho tiempo, esfuerzo y recursos¹². Estos desafíos son especialmente pronunciados cuando se diseña un panel para muestras de FFPE archivadas de tejidos altamente autofluorescentes, como se describe aquí (Figura 1). Para superar estos desafíos, primero identificamos los fluoróforos más brillantes compatibles con nuestro protocolo de inactivación de colorantes (Tabla 1). Por .......

Discussion

La patología pulmonar clínica de la tuberculosis pulmonar se caracteriza por una inflamación granulomatosa necrotizante. La patología pulmonar por MNT ocurre principalmente en dos poblaciones distintas de pacientes con dos patrones patológicos separados: lesión pulmonar aislada caracterizada por inflamación granulomatosa con obliteración bronquiolar y formación de cavidades en individuos inmunocompetentes, o enfermedad nodular difusa que afecta a los pulmones y otros órganos en individuo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,3% Tritón-X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Solución para bloquear el búfer
1% BSA	Sigma-Aldrich	A4503	Solución para bloquear el búfer
1% Bloque BD Fc humano	BD Biociencias	564220	Bloque Fc necesario para bloquear el búfer
Lámpara LED de 150 W	Amazona	B07VH3CVSF	Fuente de luz LED para fotoirradiación tisular
1x PBS	Gibco	10010-023	Solución para bloquear los pasos de tampón y lavado
Contenedor de almacenamiento de 20 galones	Amazona	B001B1C4G0	Contenedor para proceso de fotoirradiación
Lámpara LED de inundación RGBW de 40 W	Amazona	B08QFPJSMD	Fuente de luz RGB para fotoirradiación tisular
Ag85B	Abcam	ab43019/NA	Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.
Actina de músculo liso alfa DyLight 755	Novus Biologicals	NBP2-345221R/NA	Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.
Kit de bloqueo de avidina/biotina	Abcam	AB64212	Solución de bloqueo de avidina y biotina
BD Cytofix/Cytoperm	BD Biociencias	554714	Solución de fijación
Solución desparafinada BOND	Leica Biosystems	NC0221076	Solución de desparafinación
Solución de recuperación de epítopos BOND 1	Leica Biosystems	NC0235529	Solución de recuperación de epítopos de pH 6 a base de citrato (ER1)
Solución de recuperación de epítopos BOND 2	Leica Biosystems	NC0235530	Solución de recuperación de epítopos de pH 9 basada en EDTA (ER2)
Sistema de detección de investigación BOND	Leica Biosystems	NC0396648	Reactivo de tinción de investigación automatizado
Tinción de investigación BOND RX	Leica Biosystems	NA	Plataforma automatizada de tinción de investigación
Solución de lavado BOND	Leica Biosystems	NC0221077	Tampón de lavado
CD15	BD Biociencias	347420/AB_400298	Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Scientific	50-0202-82/AB_11150959	Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.
CD4 Alexa Fluor 488	R& Sistemas D	FAB8165G/AB_2728839	Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.
CD45 Ficoeritrina (PE)	Novus Biologicals	NBP2-34528PE/NA	Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.
CD68 iFluor 594	Caprico Biotechnologies	1064135/AB_2892745	Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.
Burro anti-cabra IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Scientific	A32814/AB_2762838	Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.
IgG anti-ratón Donkey Alexa Fluor Plus AF647	Thermo Fisher Scientific	A32787/ AB_2762830	Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.
IgM anti-ratón Donkey Alexa Fluor 488	Inmunoinvestigación de Jackson	715-545-020/AB_2340844	Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.
Burro anti-conejo IgG Alexa Fluor Plus AF555	Thermo Fisher Scientific	A32794/AB_2762834	Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.
Sistema de tinción EasyDip	Suministro para recién llegados	5300KIT	Sistema de tinción de portaobjetos
Fluoromount-G	Thermo Fisher Scientific	00-4958-02	Medios de montaje
Hoechst	Biotio	40046	Tinción nuclear para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.
Convertidor de archivos Imaris x64 10.2.0	Instrumentos Imaris Oxford		Convertidor de archivos gratuito
Software ImarisViewer x64 10.2.0	Instrumentos Imaris Oxford		Software gratuito de procesamiento de imágenes
Lápiz ImmEdge	Laboratorios Vector	H-4000	Pluma de barrera hidrofóbica
Borohidruro de litio (1 gramo)	Productos químicos STREM	93-0397	Químico para la inactivación del tinte, compre pequeñas alícuotas de este químico (1 gramo)
Biotina Lumican	R& Sistemas D	BAF2846	Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.
Gafas Micro Cover	VWR	48393-241	Cubiertas de portaobjetos de vidrio
Pancitoqueratina Alexa Fluor 750	Novus Biologicals	NBP2-33200AF750/AB_2868569	Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.
Sistema de microondas PELCO BioWave Pro	Ted Pella Inc	36500-230	Microondas científico sin calentamiento
PELCO SteadyTemp Pro	Ted Pella Inc	50062	Control de temperatura totalmente automatizado para microondas científicas
SimpleITK	Software de código abierto		Software de registro y procesamiento de canales
Estreptavidina Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	S11227	Reactivo de marcado para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.
Microscopio de campo amplio	Leica Microsystems	NA	Generador de imágenes THUNDER de Leica Microsystems con fuente de luz LED8 y software LAS X (3.7.1.21655). Para las imágenes de fluorescencia, se utilizó un filtro de banda cuádruple personalizado con rueda de filtros externa (PN: 11536075) con dos filtros de banda única adicionales (PN: 8118215) para obtener imágenes de siete canales de colorante por pasada. Las líneas de excitación, dicroica y emisión del filtro son (1) cubo de banda cuádruple: dicroico a 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, sin filtros de excitación o emisión; (2) rueda de filtro externa posición 1: 434/32, posición 2: 520/40, posición 3: 585/20, posición 4: 720/60, posición 5: paso; (3) banda única de 1— 585/22 excitación, 594 dicroico, 625/30 emisión; (4) banda única de 2— 635/20 excitación, 647 dicroico, 667/30 emisión.
Limpiador de lentes ópticos Zeiss	Amazona	B00GPVQVCO	Limpiador de lentes de objetivo de microscopio
Anticuerpos
Ag85B	Abcam	ab43019	IgG policlonal de conejo, ciclo 1
Actina de músculo liso alfa DyLight 755	Novus Biologicals	NBP2-345221R	1A4/asm-1, ciclo 1
CD4 Alexa Fluor 488	R& Sistemas D	FAB8165G	IgG policlonal de cabra, ciclo 1
CD8 Alexa Fluor 647	BioLeyenda	372906	C8/144B, ciclo 1
CD68 iFluor 594	Caprico Biotechnologies	1064135	KP1, ciclo 1
Burro anti-cabra IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Scientific	Referencia A32814	Burro policlonal, ciclo 1
IgG anti-ratón Donkey Alexa Fluor Plus AF647	Thermo Fisher Scientific	Referencia A32787	Burro policlonal, ciclo 1
Burro anti-conejo IgG Alexa Fluor Plus AF555	Thermo Fisher Scientific	Referencia A32794	Burro policlonal, ciclo 1
Hoechst	Biotio	40046	Etiqueta nuclear, ciclo 1
CD15	BD Biociencias	347420	MMA, ciclo 2
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Scientific	50-0202-82	L26, ciclo 2
CD45 Ficoeritrina (PE)	Novus Biologicals	NBP2-34528PE	2B11 + PD7/26, ciclo 2
IgM anti-ratón Donkey Alexa Fluor 488	Inmunoinvestigación de Jackson	715-545-020	Burro policlonal, ciclo 2
Biotina Lumican	R& Sistemas D	BAF2846	IgG policlonal de cabra, ciclo 2
Pancitoqueratina Alexa Fluor 750	Novus Biologicals	NBP2-33200AF750	AE-1/AE-3, ciclo 2
Estreptavidina Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	S11227	N/A, ciclo 2
Hoechst	Biotio	40046	Ciclo 2
fuertes
Blocking Buffer (Ciclo 1)
Tritón-X-100	Sigma-Aldrich	T8787	0,3% en volumen
BSA	Sigma-Aldrich	A4503	1% en volumen
Bloque BD Fc humano	BD Biociencias	564220	1% en volumen
1x PBS	Gibco	10010-023	97,7% en volumen
Solución de tinción de anticuerpos primarios #1 (Ciclo 1)
Búfer de bloqueo (ciclo 1)	Ver arriba		Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos
Hoechst	Biotio	40046	1:5000
CD8 AF647	BioLeyenda	372906	1:10
Solución de tinción de anticuerpos primarios #2 (Ciclo 1)
Búfer de bloqueo (ciclo 1)	Ver arriba		Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos
CD4  AF488	R& Sistemas D	FAB8165G	1:10
Ag85B	Abcam	ab43019/NA	1:100
Solución de tinción de anticuerpos secundarios #1 (Ciclo 1)
Búfer de bloqueo (ciclo 1)	Ver arriba		Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos
Burro Anti-Cabra AF Plus 488	Thermo Fisher Scientific	A32814/AB_2762838	1:100
Burro anti-conejo AF Plus 555	Thermo Fisher Scientific	A32794/AB_2762834	1:100
Burro anti-ratón AF Plus 647	Thermo Fisher Scientific	A32787/AB_2762830	1:50
Solución de tinción de anticuerpos primarios #3 (Ciclo 1)
Búfer de bloqueo (ciclo 1)	Ver arriba		Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos
CD68 iF594	Caprico Biotechnologies	1064135	1:10
a-SMA DL755	Novus Biologicals	NBP2-345221R/NA	1:30
Búfer de bloqueo sin BSA (Ciclo 2)
Tritón-X-100	Sigma-Aldrich	T8787	0,3% en volumen
Bloque BD Fc humano	BD Biociencias	564220	1% en volumen
1x PBS	Gibco	10010-023	98,7% en volumen
Solución de tinción de anticuerpos primarios #4 (Ciclo 2)
Tampón de bloqueo sin BSA (ciclo 2)	Ver arriba		Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos
CD15	BD Biociencias	347420	1:30
Biotina Lumican	R& Sistemas D	BAF2846	1:100
CD45 PE	Novus Biologicals	NBP2-34528PE	1:20
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Scientific	50-0202-82	1:10
Pan-citoqueratina AF750	Novus Biologicals	NBP2-33200AF750	1:10
Solución de tinción de anticuerpos secundarios #2 (Ciclo 2)
Tampón de bloqueo sin BSA (ciclo 2)	Ver arriba		Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos
IgM anti-ratón burro AF488	Inmunoinvestigación de Jackson	715-545-020/AB_2340844	1:100
Estrepavidina AF594	Thermo Fisher Scientific	S11227	1:200