La implementación de una técnica de fotoirradiación versátil y de bajo coste con el método manual IBEX permite obtener una imagen óptima del tejido humano con una importante autofluorescencia nativa. Este protocolo detalla cómo obtener imágenes multiplexadas de portaobjetos completos a partir de muestras clínicas archivadas utilizando un microscopio invertido, reactivos ampliamente disponibles y software de código abierto para la alineación y el procesamiento de imágenes.
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Artículo de método
El flujo de trabajo optimizado para el blanqueo iterativo amplía la obtención de imágenes de multiplexidad de muestras clínicas altamente autofluorescentes
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Resumen
Resumen
La prevalencia de enfermedad pulmonar por micobacterias no tuberculosas (MNT) ha aumentado a nivel mundial. Aunque la enfermedad pulmonar inducida por MNT a menudo se presenta con bronquiectasias, nódulos pulmonares y enfermedad cavitaria, la respuesta del huésped asociada con estos patrones distintivos de lesión pulmonar no se ha caracterizado bien in situ. Buscamos evaluar los mecanismos de la patología inducida por NTM mediante la realización de un análisis fenotípico profundo de las poblaciones de células inmunitarias en el tejido pulmonar de individuos con enfermedad NTM en comparación con un estándar de oro de inflamación granulomatosa, la enfermedad pulmonar tuberculosa (TB).
Los bloques pulmonares fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE) de pacientes con MNT diseminada, MNT pulmonar o enfermedad de tuberculosis pulmonar se seccionaron y teñieron siguiendo una versión modificada del método de imágenes Iterative Bleaching Extends multi-pleXity (IBEX). En primer lugar, se requirió la optimización del método IBEX para abordar la fluorescencia endógena significativa de las secciones pulmonares debido a la alta densidad de colágeno, elastina y eritrocitos nativos del tejido pulmonar que empeora con la preservación de FFPE y la edad de los bloques de FFPE. En este protocolo, detallamos un protocolo de fotoirradiación y un método de recuperación de antígenos modificados que reduce la autofluorescencia de las muestras clínicamente archivadas.
Además, proporcionamos orientación sobre el diseño del panel de anticuerpos, incluidos los desafíos comunes como la reactividad cruzada, la pérdida de epítopos después de la fotoirradiación, la superposición espectral entre fluoróforos adyacentes y la baja relación señal-ruido para ciertos objetivos. Para facilitar la obtención de imágenes eficientes de secciones completas de tejido pulmonar, las imágenes de los portaobjetos se obtuvieron con un microscopio de campo amplio y se posprocesaron con software de código abierto para mejorar la calidad de la imagen. En conjunto, este flujo de trabajo aborda una necesidad crítica al documentar cómo obtener imágenes de portaobjetos completos altamente multiplexadas y de alta resolución a partir de muestras desafiantes utilizando instrumentación y reactivos ampliamente disponibles. Más allá de las imágenes cuantitativas de muestras clínicas, estas técnicas se pueden aplicar a diversos tipos de muestras para superar las fuentes endógenas y exógenas de fluorescencia.
Introducción
La tuberculosis (TB) es una de las principales causas de muerte, con aproximadamente 1,3 millones de personas que mueren cada año a causa de la infección por tuberculosis1. Aunque no es tan letal como la tuberculosis, en los últimos años se ha producido un aumento significativo de las infecciones pulmonares y de las enfermedades posteriores causadas por micobacterias no tuberculosas (MNT)2. A nivel tisular, la respuesta inmune del huésped a la infección pulmonar por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ha sido bien estudiada e incluye la formación de granulomas, agregados heterogéneos de linfocitos, células dendríticas, macrófagos y neutrófilos3. Si bien la inflamación granulomatosa también es una característica fundamental de la inmunidad del huésped a la infección por MNT, las poblaciones de células inmunitarias y las características espaciales de esta respuesta siguen siendo poco estudiadas. Obtener una comprensión detallada de los componentes tisulares de la inmunopatología en comparación con la cicatrización de heridas es fundamental para el desarrollo de tratamientos (p. ej., terapias dirigidas al huésped) y estrategias terapéuticas preventivas (es decir, vacunas).
En este estudio, nuestro equipo tuvo acceso a muestras clínicas raras y archivadas adquiridas durante resecciones pulmonares o autopsias de pacientes con infección por Mtb o NTM. La mayoría de estas muestras tenían más de 10 años de antigüedad y se conservaron como muestras fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE), lo que restringió su uso a ensayos histológicos. Para superar las limitaciones de los marcadores de las imágenes tradicionales de inmunohistoquímica (IHQ) e inmunofluorescencia (IF), utilizamos el método Iterative Bleaching Extends multi-pleXity (IBEX), un método de imagen de código abierto y altamente multiplexado 4,5. La extensión del método IBEX a muestras de FFPE de pulmón humano requirió una optimización significativa debido a los altos niveles de fluorescencia endógena, un obstáculo bien descrito para la obtención de imágenes multiplexadas basadas en anticuerpos6.
Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para reducir la autofluorescencia utilizando un método de fotoirradiación optimizado para secciones de tejido FFPE pulmonar 7,8. Es importante destacar que el método descrito aquí utiliza una caja de luz económica y ampliamente disponible que se puede extender a otras preparaciones de muestras con alta autofluorescencia. Además de reducir la autofluorescencia antes de la adquisición de imágenes, proporcionamos orientación sobre el diseño de paneles de anticuerpos, como el emparejamiento de marcadores de baja abundancia con marcadores de fluoróforos brillantes, la evaluación del impacto de la fotoirradiación en el marcaje de anticuerpos y la amplificación con anticuerpos secundarios en canales con alta fluorescencia endógena. En promedio, procesamos cinco portaobjetos correspondientes a una sección de tejido, cada uno con un rango de 37 a 114mm2. Por último, demostramos cómo adquirir imágenes de diapositivas completas utilizando un instrumento de campo amplio. En resumen, este protocolo describe la adopción de IBEX para muestras clínicas archivadas y, además, ofrece orientación sobre cómo solucionar los problemas que se encuentran comúnmente con la obtención de imágenes de muestras altamente autofluorescentes.
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Protocolo
Las secciones de tejido pulmonar de autopsia y resección quirúrgica archivadas se recolectaron bajo el protocolo 09-H-0172 (NCT00943514), Historia Natural de la Bronquiectasia, en el Laboratorio de Patología del Centro Clínico de los Institutos Nacionales de Salud. Este protocolo fue aprobado por el IRB y los participantes dieron su consentimiento informado.
1. Recuperación automatizada de antígenos
NOTA: La desparafinación y la recuperación de antígenos se realizaron utilizando una plataforma automatizada de tinción de investigación (Figura 1). Trabajos anteriores determinaron que un enfoque de recuperación de antígeno dual que consistía en 30 min con una solución de recuperación de epítopos de pH 6 (ER1) a base de citrato y luego 30 min con una solución de recuperación de epítopos de pH 9 (ER2) basada en EDTA produjo los mejores resultados de inmunomarcaje para tejidos FFPE9. Se pueden obtener resultados comparables utilizando el desparafinado manual y la recuperación de antígeno dual utilizando otros métodos descritos y el apoyo proporcionado por la Comunidad de Imágenes IBEX10,11.
- Reúna portaobjetos y suministros automatizados de recuperación de antígenos (cubiertas de portaobjetos, sistema de detección de investigación, solución de recuperación de epítopos de pH 6 a base de citrato (ER1), solución de recuperación de epítopos de pH 9 a base de EDTA (ER2), etc.).
- Encienda el instrumento, deje que se inicialice durante 20 minutos, coloque el brazo de detección de investigación en el instrumento e inserte los recipientes de reactivos en la parte inferior de la máquina.
- Abra el software, haga clic en Configuración de diapositivas y seleccione agregar estudio, y cree un nuevo nombre para el estudio.
- Seleccione agregar diapositiva y etiquete las diapositivas como desee.
- Para seguir este protocolo, realice un protocolo de horneado y desparafinado con un protocolo HIER que consta de 30 min de ER1 y 30 min de ER2.
- Imprime etiquetas y colócalas encima de las diapositivas. Retire el soporte de diapositivas negro del instrumento y coloque las diapositivas de interés en el estante. Coloque cubiertas de portaobjetos transparentes en cada portaobjetos, devuelva el soporte de portaobjetos al instrumento y presione el botón debajo del estante para solicitar al instrumento que escanee el código de barras de los portaobjetos.
- Seleccione reproducir | ok y deje que comience la recuperación automática de antígenos con una duración aproximada de 3 h.
2. Marcaje de anticuerpos antes de la fotoirradiación
- Una vez completada la recuperación del antígeno, sumerja los portaobjetos en PBS.
NOTA: Ciertos epítopos son sensibles a la fotoirradiación y se degradan después de la exposición nocturna al LED. Los epítopos sensibles deben determinarse empíricamente y, cuando se descubran, el inmunomarcaje de estos epítopos debe ocurrir en este paso. Asegúrese de que el portaobjetos permanezca húmedo en todo momento después de la extracción del antígeno. - Retire un portaobjetos del PBS y seque todo el exceso de PBS en el portaobjetos con una toallita sin pelusa; Tenga cuidado de no tocar el tejido. Dibuja un borde alrededor del pañuelo con un bolígrafo hidrofóbico. Repita el proceso para todas las diapositivas restantes. Deje que la barrera hidrofóbica se seque durante 10 minutos.
- Prepare una cámara de humedad de deslizamiento colocando una pequeña cantidad de agua en el fondo de cada pozo. Coloque los portaobjetos en la cámara de humedad del portaobjetos. Absorba el PBS del tejido sin tocar directamente la muestra de tejido.
- Agregue 200 μL de tampón de bloqueo (Tabla de materiales) a cada portaobjetos. Coloque la cámara de humedad del portaobjetos en un microondas científico que no se caliente con un mecanismo para mantener una temperatura constante.
- Bloquee el marcaje de anticuerpos inespecíficos ejecutando el siguiente programa establecido anteriormente4: Programa 2-1-2-1-2-1-2-1-2-1-2, donde "2" denota 2 min a 100 W y "1" denota 1 min a 0 W. Ejecute el programa anterior una vez para bloquear. Si no se dispone de este instrumento, bloquee las secciones de tejido (5-10 μm) durante 1 h a 37 °C como se ha descrito anteriormente5.
- Cree la Solución de Tinción de Anticuerpo Primario #1 (Ciclo 1) (Tabla de Materiales) durante la incubación del tampón de bloqueo. Prepare las mezclas de anticuerpos de acuerdo con la Tabla de Materiales. Mezcle suavemente el cóctel de anticuerpos y gire la mezcla de anticuerpos con una mini centrífuga a 2.680 × g durante 30 s.
NOTA: Esta solución de tinción contiene una dilución de Hoechst 1:5000 que debería ser suficiente para la duración del experimento de dos ciclos. Es posible que los usuarios necesiten ajustar la dosis de Hoechst y otros anticuerpos para obtener resultados óptimos para sus tejidos y la configuración de las imágenes. - Retire la cámara de humedad del portaobjetos del microondas cuando el ciclo se haya completado y absorba la solución tampón de bloqueo de cada pañuelo. Agregue 200 μL de Solución de Tinción de Anticuerpo Primario #1 (Ciclo 1) (Tabla de Materiales) a cada portaobjetos. Vuelva a colocar la cámara con portaobjetos en el microondas y ejecute el programa de anticuerpos primarios durante aproximadamente 30 minutos: ejecute el programa 2-1-2-1-2-1-2-2-2 dos veces para el etiquetado de anticuerpos primarios.
NOTA: En este caso, 200 μL de solución de anticuerpo primario es una estimación. Utilice un volumen adecuado de solución para cubrir toda la superficie de la sección de tejido. - Una vez completado el paso de etiquetado de anticuerpos primarios, lave cada portaobjetos con 1.000 μL de PBS inclinando el portaobjetos verticalmente, pipeteando el PBS en el tejido y dejando que el PBS se escurra. Repita este paso de 3 a 5 veces.
- Absorba el exceso de PBS y fije los portaobjetos con paraformaldehído (PFA) al 1% durante 10 minutos a temperatura ambiente en la cámara de humedad.
NOTA: La fijación de PFA puede enmascarar los epítopos, evitando que los anticuerpos se unan a sus objetivos previstos. Al establecer un panel de anticuerpos por primera vez, recomendamos evaluar el impacto de una fijación suave (PFA al 1% durante 10 min) comparando el patrón de marcaje de las secciones de tejido tratadas con o sin fijador antes del inmunomarcaje. Si un anticuerpo es sensible a la fijación de PFA al 1%, mueva este anticuerpo antes de la etapa de posfijación. - Lave bien los portaobjetos con 1.000 μL de PBS 3-5x. Deje el PBS en el tejido hasta la etapa de fotoirradiación.
3. Fotoirradiación tisular
- Para preparar la caja de fotoirradiación (Figura 2), obtenga una lámpara LED de 150 W, una lámpara LED de inundación RGBW de 40 W, un recipiente de plástico grande (20 galones [75,71 L] de volumen o más), 1x PBS nuevo y una placa de Petri.
- Coloque la placa de Petri en el centro de la lámpara de 150 W y llénela con 1x PBS. Utilice suficiente volumen para sumergir las diapositivas en PBS. Realice el proceso de fotoirradiación en la cámara frigorífica para minimizar la generación de calor de las lámparas.
- Retire los portaobjetos de la cámara de humedad del portaobjetos y colóquelos en una placa de Petri, asegurándose de que todos los portaobjetos estén sumergidos en PBS.
- Coloque la lámpara de 40 W directamente encima de la placa de Petri con la fuente de luz hacia los portaobjetos. Asegúrese de que la lámpara de 40 W esté configurada en luz roja antes de colocarla.
- Encienda las lámparas de 150 W y 40 W. Cubra la configuración de fotoirradiación con la tapa del recipiente de plástico. Mantenga la lámpara de 40 W en la configuración de luz roja durante 2 h, luego cambie a la configuración de luz verde a través del control remoto incluido durante las 16 h restantes.
NOTA: Es imperativo realizar la fotoirradiación a aproximadamente 4 °C para evitar la distorsión térmica no deseada del tejido del portaobjetos. Punto de pausa: la fotoirradiación se puede realizar durante toda la noche y el protocolo se puede reanudar a la mañana siguiente.
4. Marcaje de anticuerpos después de la fotoirradiación
- Retire los portaobjetos de la placa de Petri y sumérjalos en 1x PBS en un frasco Coplin, un tubo cónico de 50 ml o un cubo del sistema de tinción de portaobjetos. Prepare la Solución Tintorante de Anticuerpos Primarios #2 (Ciclo 1) (Tabla de Materiales) a las diluciones recomendadas (Tabla 1). Utilice 200 μL de la solución para cada portaobjetos.
- Absorba el exceso de PBS de cada portaobjetos individual con una toallita sin pelusa, asegurándose de secar el área alrededor del pañuelo sin tocar el pañuelo en sí. Coloque los portaobjetos en la cámara de humedad del portaobjetos.
- Solución de tinción de anticuerpos primarios #2 (Ciclo 1) y agregue 200 μL a cada portaobjetos, asegurándose de que todo el tejido esté cubierto.
- Vuelva a colocar la cámara de humedad del portaobjetos con los portaobjetos en el microondas y ejecute el programa de anticuerpos primarios durante aproximadamente 30 minutos como se detalla en el paso 2.7
- Durante el marcaje de anticuerpos primarios, prepare la solución de tinción de anticuerpos secundarios # 1 (Ciclo 1) (Tabla de materiales).
- Una vez que se haya completado el programa de microondas, retire la cámara de humedad del portaobjetos y lave cada portaobjetos de 3 a 5 veces con 1,000 μL de 1x PBS.
- Absorba el exceso de PBS de cada portaobjetos individual con una toallita sin pelusa, vórtice la solución de tinción de anticuerpos secundaria y agregue 200 μL a cada portaobjetos.
- Coloque la cámara de humedad del portaobjetos en el microondas y ejecute el programa de anticuerpos secundarios: Un programa 2-1-2-1-2-1-2-2-1-2, donde " 2" denota 2 minutos a 100 W y " 1" denota 1 minuto a 0 W. Ejecute el programa anterior una vez para el etiquetado de anticuerpos secundarios.
- Lave los portaobjetos abundantemente de 3 a 5 veces con 1 ml de 1x PBS y absorba el exceso de PBS de cada portaobjetos.
- Agregue la Solución de Tinción de Anticuerpos Primarios #3 (Ciclo 1) que contiene anticuerpos directamente conjugados a cada portaobjetos. Realice la tinción de anticuerpos con microondas o alternativa (1 h a 37 °C) como se indica en el paso 2.7.
- Lave los portaobjetos nuevamente 3-5 veces con 1 mL de 1x PBS y absorba cuidadosamente el exceso de PBS de cada portaobjetos.
- Agregue 30 μL de medio de montaje directamente a cada sección de tejido y coloque un cubreobjetos que cubra la totalidad de la sección de tejido. Inspeccione el portaobjetos en busca de burbujas de aire y empuje las burbujas de aire hacia el perímetro del portaobjetos con una presión suave. Repite el proceso para las diapositivas restantes.
- Elimine el exceso de medio de montaje con una toallita sin pelusa y use un limpiador óptico de lentes para limpiar cualquier residuo que quede en la superficie del cubreobjetos. Deje que todos los portaobjetos se asienten durante 10-15 minutos a temperatura ambiente antes de realizar la adquisición de imágenes en un microscopio.
5. Configuración de microscopía y adquisición de imágenes
- Encienda el microscopio de campo amplio y la fuente de luz LED8; Inicie el software. Seleccione el objetivo (en este caso, un objetivo seco de 20x/0,8). Coloque la cámara en modo de 16 bits en la pestaña de configuración . Seleccione los canales requeridos en función de los fluoróforos presentes en los paneles de anticuerpos (consulte la Tabla 1 para obtener más orientación).
NOTA: Se especifican los siguientes pasos para el microscopio al que se hace referencia. Se podría utilizar un microscopio de campo amplio equivalente con una fuente de luz y cubos de filtro comparables para la excitación y emisión de varios fluoróforos y una etapa de precisión. - Limpie el cubreobjetos con limpiador de lentes y papel para lentes inmediatamente antes de tomar imágenes. Inspeccione visualmente el cubreobjetos y elimine el polvo o las pelusas de la superficie antes de tomar imágenes. Coloque el portaobjetos firmemente en la esquina superior izquierda (o equivalente) del inserto de la platina, de modo que el tejido se coloque de forma coherente en el plano XY (fundamental para la alineación de imágenes cíclicas).
- Configure los ajustes de adquisición creando un canal correspondiente a cada fluoróforo incluido en el panel de anticuerpos. Seleccione el cubo de filtro y el LED correspondientes para cada fluoróforo. Ajusta la intensidad de cada LED y los tiempos de exposición para cada canal. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista de los ajustes de imagen utilizados aquí.
- Antes de adquirir la imagen, seleccione el canal de Hoechst y active el sombreado vinculado. Utilice el asistente Sombreado vinculado para establecer esto para el objetivo seleccionado.
NOTA: Este protocolo detalla cómo realizar imágenes de diapositivas completas a través de la adquisición de escaneos de mosaicos grandes. El sombreado vinculado o la corrección de sombreado son necesarios para superar la iluminación desigual en las imágenes en mosaico. - En el software, haga clic en el botón En vivo para visualizar el canal de Hoechst. Utilice la perilla de enfoque grueso para enfocar la sección de tejido.
- Seleccione cada canal fluorescente y evalúe la sección de tejido para determinar el patrón de tinción esperado para todos los anticuerpos marcados con fluorescencia en el ciclo.
- Seleccione Navegador en el software. Utilizando el canal de Hoechst y la función de espiral en Navigator, mapee toda la sección de tejido o la región de interés que se va a obtener de la imagen. Si se van a obtener imágenes de varias secciones de tejido por portaobjetos, repita este paso para crear un mapa del tejido con Navigator.
- Identifique el ROI que se va a visualizar utilizando el polígono, la varita mágica u otras herramientas de selección de ROI de Navigator. Dibuje cuidadosamente el contorno del tejido para capturar la menor cantidad de mosaicos necesarios para cubrir el ROI deseado. Elimine las fichas adicionales para reducir el tiempo total de adquisición.
- Una vez creados los ROI, revise y ajuste la configuración del canal para minimizar los píxeles saturados y optimizar la relación señal-ruido. Seleccione la tabla de búsqueda del mapa de calor en la ventana de visualización de la imagen. Los colores indican el nivel de relleno de los píxeles, mientras que los rojos, naranjas, amarillos y blancos indican variaciones de intensidad más fáciles de ver; Los píxeles azules indican píxeles saturados. Para evitar perder información y comprometer la calidad de la imagen, reduzca el tiempo de exposición para minimizar el número de píxeles saturados (azules).
- En Navigator, utilice la herramienta Mapa de enfoque para crear un mapa topográfico del tejido. Establezca un punto de mapa de enfoque cada 3 o 4 puntos de vista para mosaicos grandes o muestras irregulares.
NOTA: Este paso es fundamental para los escaneos de mosaicos grandes necesarios para la obtención de imágenes de portaobjetos completos. En general, la calidad de la imagen se escala con el número de puntos del mapa de enfoque seleccionados; Sin embargo, este proceso puede llevar bastante tiempo, especialmente para escaneos de mosaicos grandes.- Cree puntos de mapa de enfoque en el orden en que serán escaneados por el microscopio. Para que coincida con el orden de escaneo de mosaicos del microscopio al que se hace referencia, seleccione Puntos de mapa de enfoque a lo largo de una ruta serpenteante que coincida con la ruta utilizada por el microscopio.
- Establezca el primer punto del mapa de enfoque mediante el enfoque manual. Utilice el enfoque automático para los puntos restantes del mapa de enfoque. Siéntese y observe para asegurarse de que se selecciona el enfoque óptimo para cada punto del mapa de enfoque. Ajuste manualmente los puntos del mapa de enfoque según sea necesario. Aumente el rango utilizado para encontrar cada punto del mapa de enfoque para tejidos irregulares o grandes.
- Configure el procesamiento utilizando los siguientes parámetros: Limpieza computacional de pequeño volumen (SVCC) con un índice de refracción (RI) establecido para que coincida con el medio de montaje (aquí, 1.4); La resistencia se establece en 98% y el tamaño de la característica se establece en 2.000 nm para marcadores de membrana o 3.000 nm para marcadores nucleares. Ejecute el protocolo de borrado computacional durante la adquisición de imágenes.
- Inicie el escaneo de mosaicos. Anote el número de mosaico y mantenga el ROI constante a lo largo de todos los ciclos.
- Después de la adquisición de la imagen, combine las imágenes borradas computacionalmente con la combinación de mosaico que se encuentra en la pestaña Proceso , con la opción Suavizar seleccionada. Inspeccione visualmente cada imagen en busca de errores de unión y repita la combinación de mosaico con nuevos parámetros si hay errores de mosaico.
NOTA: Las imágenes mal alineadas impedirán el registro de imágenes adquiridas de forma iterativa. - Si es necesario, utilice el módulo de separación de colorantes para compensar el desbordamiento espectral entre canales como se describió anteriormente5.
6. Ciclos de inactivación de colorantes, marcaje de anticuerpos y adquisición de imágenes
- Una vez completada la adquisición de la imagen, sumerja los portaobjetos en un tubo cónico de 50 ml de PBS estéril 1x hasta que se caigan los cubreobjetos. Si el cubreobjetos no se cae, pase el PBS directamente sobre el portaobjetos o use pinzas para quitar suavemente el cubreobjetos.
- Prepare la solución de borohidruro de litio (LiBH4) midiendo 3-5 mg de polvo en un bote de pesaje de plástico. Añadir diH2O en una proporción de 1:1 directamente al polvo (por ejemplo, 3,2 mg de LiBH4 y 3,2 mL de diH2O) y homogeneizar la solución con una pipeta. Utilice una jeringa para hacer pasar la solución a través de un filtro de 0,2 μm en un tubo cónico de 50 ml y registre la concentración y el momento exacto en que se creó la solución. Deje que la solución se incube a temperatura ambiente durante 3-5 minutos hasta que se vean burbujas grandes en toda la solución.
NOTA: Recomendamos utilizar la solución de inactivación del tinte dentro de las 4 horas posteriores a la preparación. PRECAUCIÓN: Realice los siguientes pasos en una campana de gases químicos y use el equipo de protección personal (EPP) adecuado. Esta reacción puede producir gas hidrógeno, que es altamente inflamable. Es importante trabajar con pequeñas cantidades de LiBH4 (<10 mg) en todo momento. Para obtener más orientación, vea los vídeos tutoriales sobre cómo preparar LiBH4 de forma segura en la Base de conocimientos de IBEX10,11.
Reemplace el vial de LiBH4 después de 4 semanas de uso debido a la disminución de la efectividad del blanqueo después de la exposición repetida al aire. Recomendamos comprar pequeñas alícuotas de LiBH4 (1 gramo). - Retire cada portaobjetos del remojo 1x PBS, absorba el exceso de PBS con una toallita sin pelusa y colóquelo en la cámara de humedad del portaobjetos.
- Trate cada portaobjetos sin recubrimiento con LiBH4 durante 30 minutos pipeteando la solución directamente sobre el portaobjetos con suficiente volumen para cubrir el tejido. Retire la solución vieja de LiBH4 de cada portaobjetos y refresque con una nueva alícuota de LiBH4 a los 10 min y a los 20 min de la misma solución madre de LiBH4 .
- Lave los portaobjetos abundantemente de 3 a 5 veces con 1x PBS. Utilice cambios rápidos de PBS, remojando los portaobjetos durante 1 minuto por lavado.
- Para adquirir una imagen para la sustracción de fondo, coloque un nuevo cubreobjetos en cada portaobjetos como se describe en los pasos 4.12-4.13 y adquiera imágenes del tejido después de la inactivación del tinte. Cree un nuevo proyecto para la imagen de sustracción de fondo y repita los pasos 5.2-5.14 para adquirir la imagen. Imagen que utiliza el mismo número de mosaicos, canales, configuraciones de canal y campos de visión establecidos para la imagen del ciclo 1. Mantenga los puntos del mapa de enfoque en los mismos puntos de vista, pero use el enfoque automático para ajustar cada punto del mapa de enfoque para esta nueva imagen.
NOTA: Utilice el canal que contiene el marcador de referencia repetido (Hoechst) para identificar estructuras únicas (formas nucleares) que están presentes en la imagen "en vivo" (imagen de sustracción de fondo, por ejemplo) y en la imagen anterior (ciclo 1). - Para minimizar las señales fluorescentes inespecíficas de los anticuerpos biotinilados en el segundo ciclo de anticuerpos, realice el bloqueo de avidina y biotina.
- Absorba el exceso de PBS y aplique la solución bloqueadora de avidina a cada portaobjetos a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Lave los portaobjetos de 3 a 5 veces con 1x PBS y absorba el exceso de PBS cuando se completen los lavados.
- Aplique la solución bloqueadora de biotina a cada portaobjetos a temperatura ambiente durante 15 minutos y lave los portaobjetos de 3 a 5 veces con 1x PBS como en el paso 6.7.2.
- Prepare un nuevo tampón de bloqueo libre de BSA (ciclo 2) (tabla de materiales) para
Solución de tinción de anticuerpos primarios #4 (ciclo 2) y solución de tinción de anticuerpos secundarios #2 (ciclo 2).
NOTA: Estas soluciones no requerirán albúmina sérica bovina porque BSA puede comprometer el paso de bloqueo de avidina/biotina. - Diluya los anticuerpos primarios a las concentraciones recomendadas por el fabricante en la solución de tinción de anticuerpos primarios #4 (ciclo 2). Agite suavemente esta solución y agréguela a cada portaobjetos dentro de la cámara de humedad, asegurándose de que el tejido esté completamente cubierto con la solución de anticuerpos primarios. Coloque la cámara de humedad del portaobjetos con los portaobjetos en el microondas y ejecute el programa de anticuerpos primarios durante aproximadamente 30 minutos como se detalla en el paso 2.7-2.8.
- Realice el marcaje de anticuerpos secundarios con la solución de tinción de anticuerpos secundarios #2 (ciclo 2) como se detalla en los pasos 4.6-4.9. Una vez que se haya completado la tinción, coloque un nuevo cubreobjetos en cada portaobjetos como se describió anteriormente en los pasos 4.12-4.13. Vuelva a colocar el portaobjetos en la platina del microscopio y vuelva a colocarlo en el mismo plano XY de las imágenes anteriores.
NOTA: Utilice el canal que contiene el marcador de referencia repetido (Hoechst) para identificar estructuras únicas (formas nucleares) que están presentes en la imagen "en vivo" (ciclo 2, por ejemplo) y en la imagen anterior (ciclo 1). - Cree un nuevo proyecto para la imagen del ciclo 2 y repita los pasos 5.2 a 5.14 para adquirir la imagen del ciclo 2. Imagen que utiliza el mismo número de mosaicos, canales, configuraciones de canal y campos de visión establecidos para la imagen del ciclo 1. Mantenga los puntos del mapa de enfoque en los mismos puntos de vista, pero use el enfoque automático para ajustar cada punto del mapa de enfoque para esta nueva imagen. Una vez adquirida la imagen del ciclo 2, proceda a la alineación de la imagen o repita los pasos de la sección 6 para ciclos adicionales con anticuerpos directamente conjugados. NOTA: Utilice el canal que contiene el marcador de referencia repetido (Hoechst) para identificar estructuras únicas (formas nucleares) que están presentes en la imagen "viva" (imagen del ciclo 2, por ejemplo) y en la imagen anterior (ciclo 1). Los ciclos adicionales requieren anticuerpos directamente conjugados porque el IBEX no elimina los anticuerpos.
7. Alineación de la imagen
- Convierta imágenes en bruto de los archivos .lif de salida del microscopio en archivos .ims con el Convertidor de archivos gratuito y el procesamiento de imágenes con el software de código abierto como se ha descrito anteriormente5 y se detalla en los vídeos de la Base de Conocimientos IBEX10,11.
- Para cada ciclo de imagen, edite el archivo y aplique los pasos de procesamiento deseados (por ejemplo, nomenclatura de canales, pseudocoloración de canales).
- Realice la sustracción de fondo y el umbral de canal utilizando las funciones aritméticas de canal creadas para SimpleITK para disminuir la señal de autofluorescencia (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html).
NOTA: Realizamos estos pasos en cada imagen (por ejemplo, Ciclo 1, Ciclo 2) antes de alinearlas en una imagen compuesta. Esto se debe a que es más fácil trabajar en las imágenes individuales más pequeñas que en la imagen combinada más grande.
- Realice la sustracción de fondo y el umbral de canal utilizando las funciones aritméticas de canal creadas para SimpleITK para disminuir la señal de autofluorescencia (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html).
- Diseñe una estrategia de nomenclatura coherente para utilizar el software de registro. Asigne un nombre a los canales con un carácter separador de prefijo-postfijo (por ejemplo, 'Cycle1 CD8_AF647') con un espacio como carácter separador para denotar el canal en el que se utilizó el anticuerpo anti-CD8 AF647 en el primer ciclo.
NOTA: Consulte la extensión del archivo de ayuda para obtener más detalles: https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTRegisterSameChannel.html. - Una vez que todos los canales hayan sido nombrados correctamente, inicie el software de registro, haga clic en Extensiones de Imaris | SimpleITK | Afín.
- Cargue el archivo .ims para cada ciclo mediante el botón Examinar junto a Nombres de archivo. Introduzca el carácter separador de prefijo de nombre de canal. Si sigue el ejemplo anterior, escriba un solo espacio y, a continuación, haga clic en Siguiente.
- Seleccione el canal de registro utilizado como marcador fiducial común entre ciclos (por ejemplo, Hoechst).
- Seleccione la imagen fija, la imagen en la que se registrarán otras imágenes.
NOTA: Recomendamos registrarse en el Ciclo 2 de imágenes iterativas. - Seleccione el directorio deseado para el 'Archivo de salida'. La opción Iniciar registro en la resolución se establecerá en la resolución máxima de forma predeterminada para permitir el mejor registro posible. Si la potencia de cálculo es limitada, reduzca este parámetro.
NOTA: Para los datos descritos aquí (12-15 GB por imagen) utilizamos una resolución máxima de 5. - Haga clic en Registrarse para comenzar. Una vez que se haya completado el registro, espere a que aparezca el botón Remuestrear y guardar imagen combinada , haga clic en él y espere a que la barra de progreso finalice.
- Abra el archivo de salida completado en el software de procesamiento. La imagen registrada con toda la información de ciclos y canales estará disponible y lista para su análisis o publicación.
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Resultados
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Discusión
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Divulgaciones
A.J.R. es empleado de Leica Microsystems, Inc. Los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del DIR/NIAID, NCI y NHLBI. La Figura 1 se creó utilizando BioRender en virtud de un acuerdo de licencia institucional con los NIH.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,3% Tritón-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Solución para bloquear el búfer |
| 1% BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | Solución para bloquear el búfer |
| 1% Bloque BD Fc humano | BD Biociencias | 564220 | Bloque Fc necesario para bloquear el búfer |
| Lámpara LED de 150 W | Amazona | B07VH3CVSF | Fuente de luz LED para fotoirradiación tisular |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | Solución para bloquear los pasos de tampón y lavado |
| Contenedor de almacenamiento de 20 galones | Amazona | B001B1C4G0 | Contenedor para proceso de fotoirradiación |
| Lámpara LED de inundación RGBW de 40 W | Amazona | B08QFPJSMD | Fuente de luz RGB para fotoirradiación tisular |
| Ag85B | Abcam | ab43019/NA | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Actina de músculo liso alfa DyLight 755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R/NA | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Kit de bloqueo de avidina/biotina | Abcam | AB64212 | Solución de bloqueo de avidina y biotina |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD Biociencias | 554714 | Solución de fijación |
| Solución desparafinada BOND | Leica Biosystems | NC0221076 | Solución de desparafinación |
| Solución de recuperación de epítopos BOND 1 | Leica Biosystems | NC0235529 | Solución de recuperación de epítopos de pH 6 a base de citrato (ER1) |
| Solución de recuperación de epítopos BOND 2 | Leica Biosystems | NC0235530 | Solución de recuperación de epítopos de pH 9 basada en EDTA (ER2) |
| Sistema de detección de investigación BOND | Leica Biosystems | NC0396648 | Reactivo de tinción de investigación automatizado |
| Tinción de investigación BOND RX | Leica Biosystems | NA | Plataforma automatizada de tinción de investigación |
| Solución de lavado BOND | Leica Biosystems | NC0221077 | Tampón de lavado |
| CD15 | BD Biociencias | 347420/AB_400298 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82/AB_11150959 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| CD4 Alexa Fluor 488 | R& Sistemas D | FAB8165G/AB_2728839 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| CD45 Ficoeritrina (PE) | Novus Biologicals | NBP2-34528PE/NA | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| CD68 iFluor 594 | Caprico Biotechnologies | 1064135/AB_2892745 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Burro anti-cabra IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814/AB_2762838 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| IgG anti-ratón Donkey Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Scientific | A32787/ AB_2762830 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| IgM anti-ratón Donkey Alexa Fluor 488 | Inmunoinvestigación de Jackson | 715-545-020/AB_2340844 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Burro anti-conejo IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Scientific | A32794/AB_2762834 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Sistema de tinción EasyDip | Suministro para recién llegados | 5300KIT | Sistema de tinción de portaobjetos |
| Fluoromount-G | Thermo Fisher Scientific | 00-4958-02 | Medios de montaje |
| Hoechst | Biotio | 40046 | Tinción nuclear para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Convertidor de archivos Imaris x64 10.2.0 | Instrumentos Imaris Oxford | Convertidor de archivos gratuito | |
| Software ImarisViewer x64 10.2.0 | Instrumentos Imaris Oxford | Software gratuito de procesamiento de imágenes | |
| Lápiz ImmEdge | Laboratorios Vector | H-4000 | Pluma de barrera hidrofóbica |
| Borohidruro de litio (1 gramo) | Productos químicos STREM | 93-0397 | Químico para la inactivación del tinte, compre pequeñas alícuotas de este químico (1 gramo) |
| Biotina Lumican | R& Sistemas D | BAF2846 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Gafas Micro Cover | VWR | 48393-241 | Cubiertas de portaobjetos de vidrio |
| Pancitoqueratina Alexa Fluor 750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750/AB_2868569 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Sistema de microondas PELCO BioWave Pro | Ted Pella Inc | 36500-230 | Microondas científico sin calentamiento |
| PELCO SteadyTemp Pro | Ted Pella Inc | 50062 | Control de temperatura totalmente automatizado para microondas científicas |
| SimpleITK | Software de código abierto | Software de registro y procesamiento de canales | |
| Estreptavidina Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | Reactivo de marcado para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Microscopio de campo amplio | Leica Microsystems | NA | Generador de imágenes THUNDER de Leica Microsystems con fuente de luz LED8 y software LAS X (3.7.1.21655). Para las imágenes de fluorescencia, se utilizó un filtro de banda cuádruple personalizado con rueda de filtros externa (PN: 11536075) con dos filtros de banda única adicionales (PN: 8118215) para obtener imágenes de siete canales de colorante por pasada. Las líneas de excitación, dicroica y emisión del filtro son (1) cubo de banda cuádruple: dicroico a 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, sin filtros de excitación o emisión; (2) rueda de filtro externa posición 1: 434/32, posición 2: 520/40, posición 3: 585/20, posición 4: 720/60, posición 5: paso; (3) banda única de 1— 585/22 excitación, 594 dicroico, 625/30 emisión; (4) banda única de 2— 635/20 excitación, 647 dicroico, 667/30 emisión. |
| Limpiador de lentes ópticos Zeiss | Amazona | B00GPVQVCO | Limpiador de lentes de objetivo de microscopio |
| Anticuerpos | |||
| Ag85B | Abcam | ab43019 | IgG policlonal de conejo, ciclo 1 |
| Actina de músculo liso alfa DyLight 755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R | 1A4/asm-1, ciclo 1 |
| CD4 Alexa Fluor 488 | R& Sistemas D | FAB8165G | IgG policlonal de cabra, ciclo 1 |
| CD8 Alexa Fluor 647 | BioLeyenda | 372906 | C8/144B, ciclo 1 |
| CD68 iFluor 594 | Caprico Biotechnologies | 1064135 | KP1, ciclo 1 |
| Burro anti-cabra IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | Referencia A32814 | Burro policlonal, ciclo 1 |
| IgG anti-ratón Donkey Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Scientific | Referencia A32787 | Burro policlonal, ciclo 1 |
| Burro anti-conejo IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Scientific | Referencia A32794 | Burro policlonal, ciclo 1 |
| Hoechst | Biotio | 40046 | Etiqueta nuclear, ciclo 1 |
| CD15 | BD Biociencias | 347420 | MMA, ciclo 2 |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82 | L26, ciclo 2 |
| CD45 Ficoeritrina (PE) | Novus Biologicals | NBP2-34528PE | 2B11 + PD7/26, ciclo 2 |
| IgM anti-ratón Donkey Alexa Fluor 488 | Inmunoinvestigación de Jackson | 715-545-020 | Burro policlonal, ciclo 2 |
| Biotina Lumican | R& Sistemas D | BAF2846 | IgG policlonal de cabra, ciclo 2 |
| Pancitoqueratina Alexa Fluor 750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750 | AE-1/AE-3, ciclo 2 |
| Estreptavidina Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | N/A, ciclo 2 |
| Hoechst | Biotio | 40046 | Ciclo 2 |
| fuertes | |||
| Blocking Buffer (Ciclo 1) | |||
| Tritón-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 0,3% en volumen |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 1% en volumen |
| Bloque BD Fc humano | BD Biociencias | 564220 | 1% en volumen |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | 97,7% en volumen |
| Solución de tinción de anticuerpos primarios #1 (Ciclo 1) | |||
| Búfer de bloqueo (ciclo 1) | Ver arriba | Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos | |
| Hoechst | Biotio | 40046 | 1:5000 |
| CD8 AF647 | BioLeyenda | 372906 | 1:10 |
| Solución de tinción de anticuerpos primarios #2 (Ciclo 1) | |||
| Búfer de bloqueo (ciclo 1) | Ver arriba | Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos | |
| CD4 AF488 | R& Sistemas D | FAB8165G | 1:10 |
| Ag85B | Abcam | ab43019/NA | 1:100 |
| Solución de tinción de anticuerpos secundarios #1 (Ciclo 1) | |||
| Búfer de bloqueo (ciclo 1) | Ver arriba | Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos | |
| Burro Anti-Cabra AF Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814/AB_2762838 | 1:100 |
| Burro anti-conejo AF Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | A32794/AB_2762834 | 1:100 |
| Burro anti-ratón AF Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32787/AB_2762830 | 1:50 |
| Solución de tinción de anticuerpos primarios #3 (Ciclo 1) | |||
| Búfer de bloqueo (ciclo 1) | Ver arriba | Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos | |
| CD68 iF594 | Caprico Biotechnologies | 1064135 | 1:10 |
| a-SMA DL755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R/NA | 1:30 |
| Búfer de bloqueo sin BSA (Ciclo 2) | |||
| Tritón-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 0,3% en volumen |
| Bloque BD Fc humano | BD Biociencias | 564220 | 1% en volumen |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | 98,7% en volumen |
| Solución de tinción de anticuerpos primarios #4 (Ciclo 2) | |||
| Tampón de bloqueo sin BSA (ciclo 2) | Ver arriba | Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos | |
| CD15 | BD Biociencias | 347420 | 1:30 |
| Biotina Lumican | R& Sistemas D | BAF2846 | 1:100 |
| CD45 PE | Novus Biologicals | NBP2-34528PE | 1:20 |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82 | 1:10 |
| Pan-citoqueratina AF750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750 | 1:10 |
| Solución de tinción de anticuerpos secundarios #2 (Ciclo 2) | |||
| Tampón de bloqueo sin BSA (ciclo 2) | Ver arriba | Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos | |
| IgM anti-ratón burro AF488 | Inmunoinvestigación de Jackson | 715-545-020/AB_2340844 | 1:100 |
| Estrepavidina AF594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | 1:200 |
Referencias
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