Artículo de método

Cribado CRISPR de todo el genoma para revelar genes radiosensibles y radiorresistentes

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DOI:

10.3791/67982

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23 de mayo de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pulmonary Oncology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Tumor Precision Diagnosis and Treatment Technology and Translational Medicine, Hubei Engineering Research Center, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 3Hubei Key Laboratory of Tumor Biological Behaviors, Zhongnan Hospital of Wuhan University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se ofrece un enfoque meticuloso y estructurado para seleccionar genes resistentes y sensibles a la radiación mediante la aplicación de un método de cribado CRISPR/Cas9 de todo el genoma. Este protocolo también tiene el potencial de servir como un marco versátil para otros esfuerzos de investigación que investigan los mecanismos de resistencia a los medicamentos químicos administrados clínicamente.

Resumen

El sistema CRISPR-Cas9 ha sido aprovechado y reutilizado en una poderosa herramienta de edición del genoma. Al aprovechar esta tecnología, los investigadores pueden cortar, pegar e incluso reescribir con precisión secuencias de ADN dentro de células vivas. Sin embargo, la aplicación de la tecnología de pantalla CRISPR va mucho más allá de la mera experimentación. Sirve como una herramienta fundamental en la lucha contra las enfermedades genéticas, diseccionando sistemáticamente paisajes genéticos complejos, permitiendo a los investigadores desentrañar los mecanismos moleculares que subyacen a los fenómenos biológicos y permitiendo a los científicos identificar y abordar las causas fundamentales de enfermedades como el cáncer, la fibrosis quística y la anemia de células falciformes. Entre todos, el cáncer representa un desafío formidable para la medicina, ya que estimula los esfuerzos de erradicación. La radioterapia, como tratamiento tradicional, da resultados pero tiene limitaciones. Erradica las células cancerosas pero también daña los tejidos sanos, causando efectos adversos que reducen la calidad de vida. Además, no todas las células cancerosas responden a la radioterapia, y algunas pueden desarrollar resistencia, empeorando la afección. Para abordar esto, se introduce una tecnología integral de detección CRISPR de genoma completo, ya que permite la identificación eficiente de genes radiosensibles y radiorresistentes, avanzando así en el campo de la investigación y el tratamiento del cáncer. Se llevó a cabo un cribado CRISPR de todo el genoma en células de adenocarcinoma de pulmón expuestas a irradiación siguiendo el protocolo descrito, a través del cual se identificaron los genes asociados a la radiorresistencia y a la radiosensibilidad.

Introducción

La investigación de los fenómenos biológicos está inherentemente entrelazada con el estudio de los comportamientos celulares y, a su vez, el examen de los comportamientos celulares está fundamentalmente relacionado con la exploración de su genoma. A medida que la tecnología moderna continúa evolucionando, los investigadores médicos están redirigiendo progresivamente su atención hacia la alteración de los comportamientos celulares a través de la edición de genes para mejorar los resultados del tratamiento de diversas enfermedades. En este sentido, la tecnología de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) se ha convertido en una herramienta revolucionaria para la edición del genoma debido a su aplicación relativamente sencilla1. El sistema CRISPR-Cas9 consta de nucleasa Cas9 y ARN de guía única (sgRNA), que reconoce y se une específicamente a la secuencia de ADN objetivo, guiando a la nucleasa Cas9 para que corte en ese lugar, lo que resulta en una rotura de doble cadena (DSB) en el ADN del genoma 2,3,4. Además, la introducción de otras sustancias puede dar lugar a inserciones, deleciones o mutaciones específicas en el genoma, lo que permite la edición genética dirigida.

En la investigación de la genómica funcional, la detección de ARN de interferencia (ARNi) fue una vez un método ampliamente utilizado para realizar experimentos de pérdida de función a gran escala para investigar las funciones de los genes en el cáncer. La tecnología de ARNi estudia la función de los genes silenciando específicamente los genes objetivo, lo que ayuda a los investigadores a identificar factores oncogénicos críticos. Sin embargo, está limitado por los efectos fuera del objetivo y la eficiencia incompleta de la eliminación de genes. Los efectos fuera del objetivo pueden conducir al silenciamiento de otros genes no objetivo, comprometiendo así la precisión y fiabilidad de los resultados experimentales 1,2. Además, el ARNi exhibe una baja eficiencia de eliminación para ciertos genes, lo que potencialmente no logra suprimir completamente la expresión génica objetivo. A diferencia de los cribados de ARNi tradicionales, el cribado CRISPR demuestra una mayor especificidad y eficiencia3. Esta tecnología no solo permite la edición precisa de genes específicos, sino que también permite el cribado a gran escala de todo el genoma, lo que proporciona un sólido apoyo a la investigación de la función génica. La tecnología de cribado CRISPR, una potente herramienta de edición genética basada en el sistema CRISPR-Cas9, se utiliza para cribar y revelar de forma eficiente funciones desconocidas de genes específicos en las células5,6,7,8. Los investigadores diseñan sgRNAs en lotes para genes específicos o regiones génicas, y preparan las correspondientes bibliotecas de sgRNAs con precisión y rigor, asegurando su integridad y funcionalidad9. Estas bibliotecas de sgRNA se encapsulan en partículas lentivirales, que se utilizan para infectar eficazmente las células huésped. Después de una infección exitosa, las células infectadas se cultivan bajo condiciones de detección definidas personalmente. Tras el cribado, se extrae el ADN genómico de las células cribadas, manteniendo altos estándares de pureza y cantidad. Posteriormente, las regiones objetivo de interés para el sgRNA se someten a la amplificación por PCR, un proceso que replica con precisión los segmentos deseados de los ácidos nucleicos 3,9. Por último, se realiza una secuenciación de alto rendimiento en los fragmentos de ADN amplificados, lo que permite un análisis exhaustivo y eficiente de las regiones objetivo, proporcionando así información valiosa sobre la función y el comportamiento de los genes estudiados4.

El cáncer representa una amenaza formidable para la salud humana como enfermedad compleja. En todo el mundo, los investigadores y los médicos están realizando esfuerzos concertados para desentrañar los mecanismos moleculares de la carcinogénesis y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas. Se han establecido colaboraciones internacionales para acelerar la traducción de los hallazgos de la investigación básica en aplicaciones clínicas, con el objetivo final de mejorar los resultados de los pacientes. Sasmal et al. propusieron una estrategia de ensamblaje bioortogonal basada en un sistema sintético de huésped-huésped para dirigirse con precisión a las células cancerosas metastásicas, que ha ayudado significativamente a docenas de científicos en el avance de las tecnologías médicas. Su destacado trabajo de investigación tiene una alta innovación y conocimientos únicos, haciendo contribuciones significativas a la comunidad científica10. El cáncer se caracteriza por el tumultuoso estado de inestabilidad genómica, derivado de la regulación errática de las respuestas al daño del ADN11-14. El daño en el ADN incluye defectos de un solo nucleótido, roturas de una sola cadena y DSBs. La recombinación homóloga (HR) y la unión de extremos no homólogos (NHEJ) participan en la reparación de DSBs en diferentes etapas 15,16,17. Sobre esta base, la radioterapia ha surgido como una opción de tratamiento viable, que utiliza rayos de alta energía (como rayos X y rayos γ) para irradiar el tejido tumoral, causando daño en el ADN de las células tumorales, interrumpiendo así su crecimiento y proliferación18. Sin embargo, la radioterapia no siempre produce los efectos deseados en una proporción significativa de pacientes con cáncer, lo que puede resultar de daños en los tejidos paracancerosos y limitaciones impuestas por las características inherentes al tumor, como la baja sensibilidad a la radioterapia 19,20,21.

Teóricamente, se puede utilizar cualquier tipo de célula para una pantalla CRISPR. Sin embargo, mantener una representación suficiente en las poblaciones mutadas requiere un gran número de células iniciales. Los tipos de células con baja abundancia no son particularmente adecuados para el cribado de todo el genoma. En cuanto a la elección de la biblioteca, la mayoría de las bibliotecas contienen de 3 a 6 ARNg por gen diana, y es fundamental mantener la distribución de cada ARNg dentro de la población18. La pérdida de representación debido al enriquecimiento o agotamiento de ARNg específicos puede dar lugar a una distribución desigual de los resultados. Para abordar este problema, optar por bibliotecas CRISPR disponibles comercialmente que hayan sido probadas en el mercado puede ser una opción preferible20. In vitro Es posible que el cribado CRISPR que utiliza líneas celulares cancerosas homogéneas no capture completamente la heterogeneidad genética y epigenética de los tumores in vivo . Si bien el cribado in vitro reveló genes clave implicados en la reparación del daño del ADN y la señalización autocrina inducida por la radiación, no replicó completamente el microambiente tumoral, incluida la radiorresistencia inducida por la hipoxia (a través de ROS, adaptación metabólica y autofagia), los efectos paracrinos mediados por el sistema inmunitario y la modulación de citocinas dependiente de la MEC. Antes de emplear el cribado CRISPR para explorar los genes asociados con la sensibilidad o la resistencia a la radiación, estos factores deben considerarse cuidadosamente. A la luz del panorama actual del tratamiento, es urgente identificar y estudiar en profundidad los factores asociados con la radiorresistencia y la radiosensibilidad para mejorar eficazmente la eficacia de la radioterapia22. Dada la ventaja clave de la pantalla CRISPR en el estudio de las funciones de genes desconocidos, se proporciona una tecnología de detección CRISPR de genoma completo sistemáticamente detallada para identificar de manera eficiente los genes radiosensibles y radiorresistentes.

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Protocolo

Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Selección de una dosis adecuada de radiación

  1. Preparación y siembra de células adherentes
    1. Ajuste la densidad celular a 5 x 105 células por ml con el medio de cultivo celular completo RPMI 1640 que contiene 10% de FBS para el paso y crecimiento celular. Distribuya las células en placas de cultivo de 3,5 cm para la radiación a diferentes dosis. Añadir 2 mL (1 x 106 células) a cada plato e incubar durante la noche a 37 °C con 5% de CO2.
  2. Aplicación de diferentes dosis de radiación
    1. Numere los platos de cultivo de 3,5 cm del 1 al 5. Utilice el Grupo # 1 como grupo de control, con los 4 grupos restantes designados como grupos de tratamiento.
    2. Selle los bordes de las placas de 6 pocillos con una membrana de sellado para los grupos de tratamiento y administre dosis de radiación de 2, 4, 6 y 8 Gy, respectivamente. Después del tratamiento, regrese los platos a la incubadora.
  3. Siembra de líneas celulares después de la radiación
    1. Prepare platos de 6 y 96 pocillos. Lave las células en las placas de cultivo de 3,5 cm una vez con PBS, digiera las células en crecimiento logarítmico con tripsina al 0,25% y ajuste la densidad celular a 1 x 105 células por ml con el medio completo RPMI 1640 que contiene 10% de FBS.
    2. Siembre 10 μL/pocillo (1.000 células/100 μL) en las placas de 6 pocillos a 3 repeticiones por cada dosis de radiación. Agregue 2 mL de medio completo a cada pocillo y cuente después de 14 días (cuando cada grupo de clones tenga aproximadamente 50 celdas).
    3. Siembre 30 μL/pocillo (3.000 células/100 μL) en las placas de 96 pocillos a 5 repeticiones por cada dosis de radiación. Agregue 70 μL de medio completo a cada pocillo y mida la viabilidad celular después de 72 h.
  4. Medición de la viabilidad celular
    NOTA: Tasa de inhibición clonogénica = 1 - (número de clones en el grupo de tratamiento/número de clones en el grupo de control) x 100%. El ensayo CCK-8 utiliza una sal de tetrazolio soluble en agua (WST-8) que puede ser reducida por las deshidrogenasas celulares para generar un producto de formazano amarillo altamente soluble en agua11. La cantidad de formazano producido es directamente proporcional al número de células viables, y su densidad óptica (medida a una longitud de onda de 450 nm) refleja con precisión la actividad metabólica celular y el estado proliferativo11,13. Sobre la base de este principio bien establecido, el ensayo CCK-8 ha sido ampliamente adoptado para diversas aplicaciones, incluidos los ensayos de proliferación celular y las pruebas de sensibilidad a los medicamentos tumorales. En este protocolo, el ensayo CCK-8 se emplea para evaluar sistemáticamente la viabilidad celular bajo diferentes dosis de radiación.
    1. Mezcle el reactivo CCK8 con el medio RPMI 1640 sin FBS en una proporción de 1:9. Deseche el medio en las placas de 96 pocillos y agregue 100 μL del medio que contiene CCK8 a cada pocillo.
    2. Incubar en la oscuridad durante 1 h y medir el valor de OD a 450 nm con un lector de microplacas.
      NOTA: Tasa de supervivencia celular = [(Valor OD del grupo de tratamiento - Valor OD del pocillo blanco) / (Valor OD del grupo control - Valor OD del pocillo blanco)] x 100%
  5. Selección de la dosis de radiación
    1. Integrar la tasa de inhibición clonogénica con la tasa de supervivencia celular para seleccionar una dosis de radiación adecuada en función de las necesidades de investigación. Seleccione una dosis de radiación con una tasa de inhibición del 50% para el cribado de genes radiorresistentes y radiosensibles.

2. Selección del MOI y la concentración de puromicina adecuados

  1. Siembra de células adherentes
    1. Ajuste la densidad de células a 3 x 105 células por ml e inocule 1 ml (3 x 105 células) por pocillo en una placa de 12 pocillos. Incubar la placa durante la noche a 37 °C con 5% de CO2.
  2. Infección lentiviral
    1. Utilice una pipeta para aspirar el medio de la placa de 12 pocillos y sustitúyalo por 1 ml de medio completo RPMI 1640 que contenga un 10 % de FBS. Prepare una biblioteca lentiviral CRISPR de genoma completo de calidad verificada (se recomiendan bibliotecas disponibles comercialmente) y configure un gradiente de concentración logarítmico (por ejemplo, 0-10-50-100-200-400-800)4,5,6,7,8.
    2. Añadir la cantidad correspondiente de lentivirus a 2 μL/plato de policeno y equilibrar a temperatura ambiente durante 5 min. Gotee lentamente la mezcla de lentivirus y polibreno en cada pocillo, mezcle bien e incube durante la noche a 37 °C con 5% de CO2.
  3. Determinación de la concentración mínima de puromicina para la destrucción celular
    1. Ajuste la densidad de células parentales a 3 x 105 células/ml e inocule 1 ml (3 x 105 células) por pocillo en una placa de 12 pocillos. Incubar la placa durante la noche a 37 °C con 5% de CO2.
    2. Agregue puromicina a cada pocillo de la placa de 12 pocillos en un gradiente de concentración de 0-0.1-0.2-0.5-1-2-4-8 μM. Cuente las células después de 72 h. La concentración mínima que mata a todas las células en el pocillo es la concentración mínima de puromicina para la destrucción celular, que se utilizará para el cribado posterior de células infectadas por el virus.
  4. Selección de puromicina después de la infección
    1. Al segundo día después de la infección, aspire el medio de cada pocillo y reemplácelo con 1 mL de medio completo RPMI 1640 que contenga 10% de FBS. Continuar el cultivo durante 48 h.
    2. Después de 72 h de infección, reemplace el medio existente con un medio completo que contenga la concentración mínima de puromicina para la eliminación celular. Configure 2 pocillos en la placa de 12 pocillos sin infección lentiviral como controles negativos y positivos. Trate el control negativo con puromicina y deje el control positivo sin tratar. Continuar cultivando durante 72 h.
    3. Después de 72 h de selección de puromicina, todas las células parentales del control negativo estarán muertas, mientras que las células parentales del control positivo muestran una muerte mínima. Calcule el MOI de cada pozo.
      NOTA: MOI = (Número de células en el grupo infectado por el virus / Número de células en el grupo de control positivo) x 100%. Utilice la concentración del virus con un MOI de ~0,3 para el cribado posterior.

3. Infección de la biblioteca lentiviral CRISPR en todo el genoma

  1. Siembra de líneas celulares adherentes
    1. Ajuste la densidad celular a 1 x 107 celdas por mL en medio completo RPMI 1640 que contiene 10% de FBS para el paso y el crecimiento celular. Inocular 1 mL de células (1 x 107 células ) en cada placa de cultivo de 15 cm a 37 °C con 5% de CO2 durante 8 h. Una vez que las células se adhirieron y alcanzaron una confluencia del 70%-80%, estaban listas para la infección viral (haciendo un número de copias de aproximadamente 500).
  2. Infección lentiviral
    1. Aspire el medio de las placas de cultivo de 15 cm y reemplácelo con 15 mL de medio completo RPMI 1640 que contenga un 10% de FBS. Preparar una biblioteca lentiviral CRISPR de genoma completo de calidad comprobada.
    2. Añadir la cantidad correspondiente de lentivirus con el MOI = 0,3 a 30 μL/placa de polibreno y equilibrar a temperatura ambiente durante 5 min, gotear lentamente la mezcla de lentivirus y polibreno en las placas de cultivo de 15 cm, mezclar bien e incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante la noche. Simultáneamente, prepare una placa de cultivo de 15 cm con la célula parental como contraste.
  3. Selección de puromicina después de la infección
    1. Al segundo día después de la infección viral, aspire el medio de las placas de cultivo de 15 cm y reemplácelo con 15 mL de medio completo RPMI 1640 que contenga 10% de FBS. Continuar el cultivo durante 48 h.
    2. A las 72 h después de la infección, sustituya el medio por un medio completo que contenga la concentración letal mínima de puromicina. Trate las células parentales no infectadas como un control negativo de la misma manera y continúe el cultivo durante 72 h. Después de 72 h de selección de puromicina, todas las células parentales del grupo de control negativo serán eliminadas, y las células supervivientes de la infección lentiviral se considerarán infectadas con éxito.
  4. Extracción del genoma del día 0
    1. Digiera las células de una placa de cultivo de 15 cm con tripsina al 0,25%, vuelva a suspender en un medio completo RPMI 1640 que contenga un 10% de FBS y cuente el número de células. Etiquete este ejemplo como Día 0.
    2. Centrifugar a 300 x g durante 5 min (a temperatura ambiente) y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender en 1 mL de PBS, centrifugue a 300 x g durante 5 min y deseche el sobrenadante. Extraiga el ADN genómico del día 0, mida la concentración y la pureza del ADN utilizando un espectrofotómetro UV de nanogotas.
    3. Para la detección de la integridad del sgRNA, utilice la electroforesis en gel de agarosa para analizar la biblioteca de sgRNA amplificada, asegurándose de que las bandas estén claras y no se degraden significativamente, preservando así la integridad de la biblioteca23. Para la evaluación de la cobertura de la biblioteca lentiviral, emplee la tecnología de secuenciación profunda para realizar análisis de secuenciación en los sgRNAs dentro de la biblioteca24,25.
    4. En el cribado CRISPR, la amplificación por PCR sirve como verificación preliminar de la integridad del fragmento de sgRNA y de la calidad de la biblioteca6. Para analizar de manera más exhaustiva la cobertura de la biblioteca y los patrones de distribución de sgRNA, y para garantizar una representación adecuada de los sgRNA para cada gen objetivo durante el cribado, realice NGS para obtener información detallada sobre la solidez del cribado9.
      NOTA: Al detectar cambios en la abundancia de sgRNA antes y después de la selección, e identificar la posible integración de sgRNA fuera del objetivo o la contaminación de la biblioteca, la precisión y la confiabilidad de la pantalla CRISPR podrían mejorarse aún más. Estas muestras del día 0 sirven como controles negativos cruciales y se someten a una evaluación integral de la calidad mediante amplificación por PCR y NGS para lograr 2 objetivos clave: (1) confirmación de la depleción de genes esenciales (lo que indica una representación adecuada de la biblioteca) y (2) demostración de expresión estable en genes no esenciales (establecimiento de condiciones experimentales de referencia)9.
    5. Asegurar que la cobertura alcance el nivel esperado para asegurar la diversidad y representatividad de la biblioteca y evitar sesgos en el proceso de selección. Para la medición de la eficiencia de la infección, utilice imágenes de fluorescencia para evaluar la eficiencia de la infección, asegurándose de que cumple con los requisitos del experimento.

4. Aplicación de radiación como condición de detección

  1. Agrupación
    1. Ajuste la densidad de las células infectadas con CRISPR a 1 x 107 células por ml e inocule 1 ml en cada placa de Petri de 15 cm. Incubar durante la noche a 37 °C con 5% de CO2.
  2. Tratamiento con radiación
    1. Divida aleatoriamente las células en 2 grupos: un grupo de tratamiento y un grupo de control, con 6 platos por grupo. Administre una dosis adecuada de radiación a las células del grupo de tratamiento, mientras que deje las células del grupo de control sin tratar para que se propaguen normalmente. Después de la radiación, continúe incubando a 37 °C con 5% de CO2 durante 7 días.
    2. En la segunda semana, repita la administración de una dosis adecuada de radiación a las células del grupo de tratamiento, dejando las células del grupo de control sin tratar y permitiendo que se propaguen normalmente. Después de la radioterapia, continuar incubando a 37 °C con 5% de CO2 durante otros 7 días.

5. Extracción y secuenciación del genoma

  1. Extracción del día 14
    1. Después de 14 días de tratamiento, digiera las células de los grupos de tratamiento y control con tripsina al 0,25%, vuelva a suspenderlas utilizando un medio RPMI 1640 completo que contenga 10% de FBS y etiquételas como Día 14-RT o Día 14-NC.
    2. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender en 1 mL de PBS, centrifugue a 300 x g durante 5 min y deseche nuevamente el sobrenadante. Extraiga el ADN genómico del día 14 y detecte la concentración y la pureza del ADN mediante espectroscopía de absorbancia UV de nanogotas.
  2. Amplificación por PCR
    1. Prepare los cebadores correspondientes de la secuencia (consulte la Tabla de materiales) y dilúyalos hasta 10 μM. Configure un sistema de reacción de 20 μL agregando los reactivos en un tubo de microcentrífuga estéril, centrifugue durante 5 s a 300 x g y mezcle bien. Configure los parámetros del instrumento de PCR de acuerdo con la condición de amplificación para obtener productos de PCR.
  3. Detección de electroforesis en gel de agarosa
    1. Prepare una placa de fundición de gel, selle los bordes del molde con agarosa, inserte el peine y prepare un gel de agarosa de concentración adecuada de acuerdo con la longitud de la muestra de ADN.
    2. Pese con precisión una cierta cantidad de polvo de agarosa, agregue una cantidad adecuada de tampón de electroforesis, mezcle bien y caliente en un horno de microondas para que se derrita. Después de enfriar un poco, agregue una cantidad adecuada de tinte de ácido nucleico, mezcle suavemente y vierta lentamente en el molde de fundición en gel. Deja que el gel se solidifique durante 30 min.
    3. Retire el peine y agregue una cantidad adecuada de tampón de electroforesis al tanque de electroforesis hasta que cubra el gel. Agregue una cantidad adecuada de tampón de carga a la muestra de ADN, mezcle bien y use una pipeta para agregar lentamente la mezcla al pocillo de la muestra.
    4. Establezca el voltaje adecuado en función del tamaño del fragmento de ADN y la concentración del gel de agarosa. Después de la electroforesis, retire con cuidado el gel y colóquelo en un generador de imágenes en gel para observar los resultados y verificar si la amplificación por PCR fue exitosa.
  4. Secuenciación de Illumina
    1. Recoja el ADN genómico de los tres grupos (grupo de día 0, grupo de control y grupo de tratamiento) y envíelo a una empresa para la construcción de la biblioteca y la secuenciación de Illumina. Realizar análisis bioinformáticos y visualización de los resultados de la secuenciación para obtener genes sensibles y resistentes a la radioterapia26.
    2. Establecer múltiples experimentos repetidos para el análisis de datos y realizar análisis estadísticos sobre los resultados experimentales para garantizar la consistencia y reproducibilidad de los datos27,28.
  5. Evaluación de la calidad de los datos de secuenciación
    1. Someter los datos brutos a rigurosos mecanismos de filtrado y control de calidad para garantizar la precisión de la secuenciación de la información5. Calcule la puntuación Phred (Qphred) para cada nucleótido en función de la tasa de errores de secuenciación, utilizando un algoritmo de conversión especificado y un modelo que evalúe la probabilidad de que se produzca un error durante la llamada base28.
    2. Mantener la tasa de error de secuenciación para cada posición base por debajo del 1% (equivalente a un umbral Q30) y asegurarse de que al menos el 80% de los datos de secuenciación cumplan con este estándar Q30 para respaldar los procedimientos analíticos posteriores.
  6. Procesamiento de datos y control de calidad a nivel de muestra
    NOTA: Para más detalles, consulte los informes publicados anteriormente 29,30.
    1. Alinee las lecturas filtradas de los datos de secuenciación con las secuencias de la biblioteca de sgRNA. Estadísticas de informes, incluido el recuento de sgRNAs en la biblioteca con una alineación perfecta, la abundancia promedio de sgRNAs, el número de sgRNAs no detectados y la proporción de lecturas de muestras individuales mapeadas con éxito a la biblioteca de sgRNAs. Utilice una relación de asignación más alta para indicar una mayor cobertura.
    2. Cuente el enriquecimiento de las lecturas de cada gen (dirigido por diferentes sgRNAs) en cada muestra. Normalice las lecturas de soporte para cada sgRNA en todas las muestras utilizando el método de normalización de la "mediana" de MAGeCK. Realice un control de calidad a nivel de muestra mediante la evaluación de la distribución de los recuentos de lecturas de sgRNA, la generación de diagramas de caja, la realización de análisis de componentes principales (PCA) y la construcción de mapas de calor de correlación.
    3. Supongamos que los recuentos de lectura de sgRNA siguen una distribución de Poisson. Represente recuentos normalizados de sgRNA de diferentes grupos en diagramas de caja para visualizar la distribución general de datos dentro de las muestras y comparar las distribuciones entre grupos.
    4. Utilice el ACP para simplificar el análisis de datos al reflejar las diferencias entre los componentes principales y la tasa de variación dentro de cada componente, lo que facilita la observación de las variaciones intra e intergrupales. Utilice un mapa de calor de correlación para ilustrar las relaciones entre las muestras.
  7. Análisis básico
    1. Realice análisis diferenciales de sgRNA entre grupos e identifique genes esenciales después del control de calidad y el procesamiento preliminar de datos. Realizar análisis de enriquecimiento funcional de los genes relevantes30. Clasifique los genes esenciales en función de la puntuación de agregación de rangos (RRA) robusta calculada por MAGeCK u otros métodos estadísticos como MLE, con una puntuación de RRA más baja que indica una mayor importancia.
    2. Utilice el lenguaje R u otros lenguajes de programación para realizar análisis bioinformáticos en los resultados clasificados y visualice los hallazgos utilizando diagramas de análisis GO y KEGG30. Vincular genes o proteínas a los términos GO correspondientes (función molecular, proceso biológico y componente celular) a través del mapeo de ID o la anotación de secuencias.
    3. Utilice KEGG como base de datos para comprender las funciones de alto nivel y los sistemas biológicos, conectando el catálogo de genes identificados con las funciones del sistema a nivel celular, de especies y de ecosistema. Seleccione las 10 o 20 rutas principales de los análisis GO y KEGG para una visualización intuitiva de las direcciones de las rutas.

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Resultados

El cáncer de pulmón, con la tasa de mortalidad más alta, representa una enfermedad médica altamente agresiva y prevalente. En la Figura 1 se muestra el flujo de trabajo esquemático utilizando la línea celular de cáncer de pulmón A549 para llevar a cabo un cribado CRISPR de todo el genoma con radiación como condición de cribado. En primer lugar, explorar la sensibilidad de las células A549 a diferentes dosis de radiación a través de la formación de clones y experimentos con CCK8 (

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Discusión

Como tecnología de edición genética de vanguardia, la pantalla CRISPR ha provocado cambios profundos en el campo de la investigación científica5. Derivada del sistema CRISPR-Cas9, esta tecnología se ha convertido en una herramienta esencial para el estudio de las funciones de los genes debido a su alta eficiencia y precisión9. El principio de ingeniería de CRISPR/Cas9 implica el diseño y la introducción de sgRNAs específicos con aproximadam...

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Agradecimientos

Este estudio contó con el apoyo del Proyecto Regional de Innovación Científica y Tecnológica de la provincia de Hubei (2024EIA001) y el Proyecto de Apoyo a la Construcción de la Plataforma de Innovación Científica y Tecnológica Médica del Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan (PTXM2025001). La Figura 1 se creó con Figdraw.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de cultivo de células y tejidos de 150 mmWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.715011Plato de
cultivo celular y tisular de 35 mmWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.706011cultivo celular
A549ATCC--
Kit de recuento celular-8Shanghai Beyotime Biotech IncC0041Para ensayo de viabilidad celular
CO2 medio independientePHCbiMCO-50AICCultivo celular
Contador celular automatizado Countess 3 FL ThemoScientificAMQAF2001Para recuento celular
EDTAGibco25200056Cultivo celular
Suero fetal bovinoGibco10099141Cultivo celular
Microscopía de fluorescenciaLEICAebq 100-04Para microscopio de fluorescencia
Biblioteca lentiviral CRISPR de todo el genomaShanghai OBiO Technology Co., Ltd.H5070Para infección lentiviral
MiniAmp plus PCRThemo ScientificC37835de amplificación de PCR
, 12 pocillosWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.712002
Placas de cultivo celular NEST, WuxiNEST Biotechnology Co., Ltd.703002
Placas de cultivo celular NEST de cultivo celular, 96 pocillosWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.701001Cultivo celular
PBSGibco C10010500BTCell culture
PCR forward primer (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG)Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd.-Para amplificación de PCR
Cebador inverso de PCR (GATGTGCGCTCTGCCCCACTGACGGGCA)Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd.-Para amplificación por PCR
PolybreneShanghai Beyotime Biotech IncC0351Para infección lentiviral
PuromicinaMCEHY-K1057Para selección post infección lentiviral
RPMI 1640 medio de cultivo celularGibco23400-021Cultivo celular
TIANGENamp kit de ADN genómicoBeijing TIANGEN Biotech Co., Ltd.DP304Para extracción de ADN genómico
Difractómetro de polvo de rayos XPerkinElmerPara radioterapia
Línea celular de Para placas de cultivo celular NEST

Referencias

  1. Barrangou, R., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas systems: Prokaryotes upgrade to adaptive immunity. Mol Cell. 54 (2), 234-244 (2014).
  2. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
  3. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
  4. Arroyo, J. D., et al. A Genome-wide CRISPR death screen identifies genes essential for oxidative phosphorylation. Cell Metab. 24 (6), 875-885 (2016).
  5. Sidik, S. M., et al. A genome-wide CRISPR screen in toxoplasma identifies essential apicomplexan genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
  6. Jing, Y., et al. Genome-wide CRISPR activation screening in senescent cells reveals SOX5 as a driver and therapeutic target of rejuvenation. Cell Stem Cell. 30 (11), 1452-1471 (2023).
  7. Shifrut, E., et al. Genome-wide CRISPR screens in primary human t cells reveal key regulators of immune function. Cell. 175 (7), 1958-1971 (2018).
  8. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  9. Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer biology and therapy. Nat Rev Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).
  10. Sasmal, R., et al. Synthetic host-guest assembly in cells and tissues: Fast, stable, and selective bioorthogonal imaging via molecular recognition. Anal Chem. 90 (19), 11305-11314 (2018).
  11. Roos, W. P., Thomas, A. D., Kaina, B. DNA damage and the balance between survival and death in cancer biology. Nat Rev Cancer. 16 (1), 20-33 (2016).
  12. Huang, R., Zhou, P. K. DNA damage repair: Historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).
  13. O'Connor, M. J. Targeting the DNA damage response in cancer. Mol Cell. 60 (4), 547-560 (2015).
  14. Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481 (7381), 287-294 (2012).
  15. Carusillo, A., Mussolino, C. DNA Damage: From threat to treatment. Cells. 9 (7), 1665(2020).
  16. Li, X., Heyer, W. D. Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance. Cell Res. 18 (1), 99-113 (2008).
  17. Chang, H., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 495-506 (2017).
  18. Andratschke, N., et al. European society for radiotherapy and oncology and European organization for research and treatment of cancer consensus on re-irradiation: Definition, reporting, and clinical decision making. Lancet Oncol. 23 (10), e469-e478 (2022).
  19. Olivares-Urbano, M. A., Grinan-Lison, C., Marchal, J. A., Nunez, M. I. CSC radioresistance: A therapeutic challenge to improve radiotherapy effectiveness in cancer. Cells. 9 (7), 1651(2020).
  20. Schaue, D., McBride, W. H. Opportunities and challenges of radiotherapy for treating cancer. Nat Rev Clin Oncol. 12 (9), 527-540 (2015).
  21. Allen, C., Her, S., Jaffray, D. A. Radiotherapy for cancer: Present and future. Adv Drug Deliv Rev. 109, 1-2 (2017).
  22. Xue, C., Greene, E. C. DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-Mediated genome editing. Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).
  23. Tzelepis, K., et al. A CRISPR dropout screen identifies genetic vulnerabilities and therapeutic targets in acute myeloid leukemia. Cell Rep. 17 (4), 1193-1205 (2016).
  24. Rottner, A. K., et al. A genome-wide CRISPR screen identifies CALCOCO2 as a regulator of beta cell function influencing type 2 diabetes risk. Nat Genet. 55 (1), 54-65 (2023).
  25. Chen, M., et al. CRISPR-Cas9 for cancer therapy: Opportunities and challenges. Cancer Lett. 447, 48-55 (2019).
  26. Gupta, D., et al. CRISPR-Cas9 system: A new-fangled dawn in gene editing. Life Sci. 232, 116636(2019).
  27. Li, B., et al. Genome-wide CRISPR screen identifies host dependency factors for influenza A virus infection. Nat Commun. 11 (1), 164(2020).
  28. Hung, K. L., et al. Targeted profiling of human extrachromosomal DNA by CRISPR-CATCH. Nat Genet. 54 (11), 1746-1754 (2022).
  29. Bhattacharya, D., Van Meir, E. G. A simple genotyping method to detect small CRISPR-Cas9 induced indels by agarose gel electrophoresis. Sci Rep. 9 (1), 4437(2019).
  30. Razavi, Z., Soltani, M., Souri, M., Van Wijnen, A. J. CRISPR innovations in tissue engineering and gene editing. Life Sci. 358, 123120(2024).
  31. Wang, W., et al. A genome-wide CRISPR-based screen identifies KAT7 as a driver of cellular senescence. Sci Transl Med. 13 (575), eabd2655(2021).
  32. Xu, X., et al. Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing. Mol Cell. 81 (20), 4333-4345 (2021).
  33. Huang, M., et al. FACS-based genome-wide CRISPR screens define key regulators of DNA damage signaling pathways. Mol Cell. 83 (15), 2810-2828 (2023).
  34. Feng, J., et al. Genome-wide CRISPR screen identifies synthetic lethality between DOCK1 inhibition and metformin in liver cancer. Protein Cell. 13 (11), 825-841 (2022).
  35. Saurat, N., et al. Genome-wide CRISPR screen identifies neddylation as a regulator of neuronal aging and AD neurodegeneration. Cell Stem Cell. 31 (8), 1162-1174 (2024).
  36. Du, Y., Liu, Y., Hu, J., Peng, X., Liu, Z. CRISPR/Cas9 systems: Delivery technologies and biomedical applications. Asian J Pharm Sci. 18 (6), 100854(2023).
  37. Shi, J., et al. A genome-wide CRISPR screen identifies WDFY3 as a regulator of macrophage efferocytosis. Nat Commun. 13 (1), 7929(2022).
  38. Liu, N., Olson, E. N. CRISPR modeling and correction of cardiovascular disease. Circ Res. 130, (2022).
  39. Feng, X., et al. Genome-wide CRISPR screens using isogenic cells reveal vulnerabilities conferred by loss of tumor suppressors. Sci Adv. 8 (19), 6638(2022).
  40. Ghaemi, A., et al. CRISPR-Cas9 genome editing delivery systems for targeted cancer therapy. Life Sci. 267, 118969(2021).
  41. Derry, W. B. CRISPR: Development of a technology and its applications. FEBS J. 288 (2), 358-359 (2021).
  42. Sharma, G., Sharma, A. R., Bhattacharya, M., Lee, S. S., Chakraborty, C. CRISPR-Cas9: A preclinical and clinical perspective for the treatment of human diseases. Mol Ther. 29 (2), 571-586 (2021).

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