Investigaciones multiescala del procesamiento cortical mediante la integración de politrodos laminares y optogenética con microelectrocorticografía en roedores

Resumen

Aquí, presentamos dos protocolos para el registro de microelectrocorticografía de alta densidad (μEcoG) en ratas y ratones, incluidos los métodos quirúrgicos, de implantación y de registro. Los registros de μECoG se realizan en combinación con el registro de politrodos laminares en la corteza auditiva de la rata o con la manipulación optogenética de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial del ratón.

Resumen

La electrocorticografía (ECoG) es un puente metodológico entre la neurociencia básica y la comprensión de la función del cerebro humano en la salud y la enfermedad. ECoG registra señales neurofisiológicas directamente desde la superficie cortical con una resolución temporal de milisegundos y una resolución espacial columnar en grandes regiones de tejido cortical simultáneamente, lo que lo coloca en una posición única para estudiar cálculos corticales locales y distribuidos. Aquí, describimos el diseño de dispositivos micro-ECoG (μECoG) personalizados y su uso en dos procedimientos. Estas rejillas tienen 128 electrodos de baja impedancia con un espaciado de 200 μm fabricados sobre un sustrato de polímero transparente con perforaciones entre electrodos; estas características permiten el registro simultáneo de μECoG con registros de politrodos laminares y manipulaciones optogenéticas. En primer lugar, presentamos un protocolo para el registro epidural combinado de μECoG sobre la corteza somatosensorial de los bigotes de ratones con manipulación optogenética de tipos específicos de células corticales genéticamente definidas. Esto permite la disección causal de las distintas contribuciones de diferentes poblaciones neuronales al procesamiento sensorial, al tiempo que monitorea sus firmas específicas en las señales μECoG. En segundo lugar, presentamos un protocolo para experimentos agudos para registrar la actividad neuronal de la corteza auditiva de ratas utilizando rejillas μECoG y politrodos laminares. Esto permite un mapeo topográfico detallado de las respuestas neuronales evocadas sensorialmente a través de la superficie cortical simultáneamente con grabaciones de múltiples unidades neuronales distribuidas a través de la profundidad cortical. Estos protocolos permiten realizar experimentos que caracterizan la actividad cortical distribuida y pueden contribuir a la comprensión y a las eventuales intervenciones para diversos trastornos neurológicos.

Introducción

Las funciones cerebrales que subyacen a la sensación, la cognición y la acción están organizadas y distribuidas a través de vastas escalas espaciales y temporales, que van desde los picos de neuronas individuales hasta los campos eléctricos generados por las poblaciones de neuronas en una columna cortical y la organización topográfica de las columnas en las áreas del cerebro (por ejemplo, somatotopía en la corteza somatosensorial, tonotopía en la corteza auditiva primaria). La comprensión de la función cerebral requiere la detección de señales eléctricas a través de estas escalas espaciales¹. En la actualidad, la neurociencia cuenta con muchos métodos ampliamente utilizados para monitorizar la actividad del cerebro. Desde el punto de vista electrofisiológico, los politrodos laminares (como los neuropíxeles) permiten la monitorización de un número modesto (~300) de neuronas individuales, normalmente dentro de un puñado de columnas espaciadas a distancia, con una resolución temporal alta (≥1 kHz). Las imágenes de Ca²⁺ permiten el monitoreo de un número modesto a grande de neuronas individuales identificadas genética y anatómicamente dentro de una extensión espacial de ~ 1-2 mm a una resolución temporal más baja (~ 10 Hz)². La resonancia magnética funcional permite monitorizar el estado metabólico de un gran número de neuronas (~1 M de neuronas en un volumen de 36^mm3) en todo el cerebro a una resolución temporal muy baja (~0,2 Hz). El EEG/MEG permite monitorizar la actividad eléctrica de toda la superficie cortical/cerebro con una resolución temporal modesta (<100 Hz) y una resolución espacial muy baja (centímetros)³. Si bien cada una de estas metodologías ha proporcionado información fundamental y sinérgica sobre la función cerebral, los métodos que permiten la detección directa de señales electrofisiológicas a alta resolución temporal desde ubicaciones anatómicas precisas en amplias regiones espaciales de la corteza son incipientes. La necesidad de una amplia cobertura espacial se enfatiza por el hecho de que en el cerebro, la función neuronal cambia mucho más dramáticamente a través de la superficie en comparación con^{la profundidad.}

La electrocorticografía (ECoG) es un método en el que se implantan rejillas de electrodos de baja impedancia en la superficie del cerebro y permiten el registro o la estimulación de la corteza ^1,5. Por lo general, la ECoG se implementa en entornos neuroquirúrgicos humanos como parte de los estudios clínicos para el tratamiento de la epilepsia farmacológicamente intratable. Sin embargo, también proporciona información única sobre el procesamiento cortical distribuido en los seres humanos, como el habla y el mapeo topográfico sensorial ^6,7. Estas capacidades han motivado su uso en modelos animales, incluyendo monos, ratas y ratones 5,8,9,10,11. En roedores, se ha demostrado recientemente que el micro-ECoG (μECoG) permite la monitorización eléctrica directa de poblaciones neuronales de alta resolución temporal (~100 Hz) con resolución espacial columnar (~200 μm) y amplia cobertura espacial (muchos milímetros). μECoG permite a los investigadores investigar la dinámica neuronal distribuida asociada con el procesamiento sensorial complejo, las funciones cognitivas y los comportamientos motores en modelos animales^12,13. Los avances recientes han integrado μECoG con la optogenética y los registros de politrodos laminares 14,15,16,17,18,19,20, lo que permite investigaciones multiescala de redes corticales y cierra la brecha entre la actividad neuronal a microescala y la dinámica cortical a macroescala ^21,22. De manera crítica, debido a que la señal μECoG es muy similar en humanos y modelos animales no humanos, el uso de μECoG hace que la traducción de los resultados y hallazgos de modelos animales a humanos sea mucho más directa²³. Como tal, los enfoques integradores son cruciales para avanzar en nuestra comprensión de los circuitos neuronales y son prometedores para el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas para los trastornos neurológicos ^5,24,25.

En consecuencia, existe una necesidad emergente de protocolos que integren matrices de μECoG de alta densidad con registros laminares y herramientas optogenéticas para permitir investigaciones multiescala exhaustivas del procesamiento cortical ^8,26. Para abordar esta brecha, hemos desarrollado dispositivos μECoG diseñados a medida con 128 electrodos de baja impedancia con un diámetro de electrodo de 40 μm y un espaciamiento entre electrodos de 20 μm en un sustrato polimérico flexible y transparente (parileno-C y poliimida) con perforaciones entre electrodos, lo que permite registros simultáneos de μECoG y politrodo laminar con manipulaciones optogenéticas^13,22. Los aspectos clave de este protocolo experimental incluyen: (i) resolución espacial columnar y cobertura a gran escala de la actividad cortical a través de matrices μECoG de alta densidad; (ii) la capacidad de registrar desde múltiples capas corticales utilizando politrodos laminares insertados a través de la rejilla μECoG; y (iii) la incorporación de técnicas optogenéticas para activar o inhibir selectivamente poblaciones neuronales específicas, permitiendo así la disección causal de circuitos neuronales 27,28,29. La configuración de alta densidad permite registros de alta resolución espacial, proporcionando efectivamente una "vista en columna" de la actividad cortical, ya que estudios previos han demostrado que las señales μECoG pueden resolver la actividad a una escala espacial comparable al diámetro de la columna cortical de roedores (~20 μm)¹¹. Esta metodología integrada permite el monitoreo y la manipulación simultáneos a múltiples escalas de la actividad neuronal, lo que podría permitir experimentos causales para determinar las fuentes neuronales de las señales μECoG, así como el procesamiento cortical distribuido. Para lograr estos objetivos, este manuscrito proporciona protocolos detallados para el uso de matrices μECoG de alta densidad en dos combinaciones.

En primer lugar, describimos μECoG combinado con la manipulación de células piramidales de capa 5 (L5) en la corteza somatosensorial primaria (S1) del ratón. En el ratón, la matriz μECoG se coloca por vía epidural (debido a la intratabilidad quirúrgica de la durotomía en ratones). Una fibra óptica se coloca sobre la rejilla o se combina con una lente para enfocar la luz optogenética sobre una pequeña área objetivo de la superficie cortical. La estrategia optogenética se describe aquí para la inhibición de las neuronas excitadoras de la capa 5, pero se puede adaptar fácilmente a cualquier población de neuronas provistas de la línea de ratón correspondiente, específica de la población, que expresa Cre. En segundo lugar, describimos el uso combinado de μECoG con politrodos laminares de silicio para registrar simultáneamente los potenciales eléctricos de superficie cortical (CSEP) y la actividad de pico de una sola unidad de múltiples neuronas a través de las capas corticales de la corteza auditiva de rata (A1). La matriz tiene perforaciones entre electrodos, lo que permite la inserción de politrodos laminares multicanal a través de la rejilla para registrar la actividad neuronal en diferentes capas corticales. Durante el procedimiento de craneotomía, la matriz μECoG se coloca subduralmente sobre la corteza auditiva y el polítrodo laminar se inserta a través de las perforaciones. Las señales neuronales de la sonda μECoG y laminar se registran simultáneamente, muestreadas a 6 kHz y 24 kHz, respectivamente, utilizando un sistema amplificador conectado ópticamente a un procesador de señal digital.

Protocolo

Ambos protocolos siguen los mismos pasos clave (anestesia, fijación, craneotomía, registro de μECoG) pero tienen diferencias notables. En la siguiente descripción, se combinan los pasos compartidos, mientras que se anotan las especificidades de cada protocolo. Estos pasos a continuación corresponden al registro de μECoG con optogenética (ratón) o al registro de μECoG con una sonda laminar (rata). Todos los procedimientos descritos aquí se llevaron a cabo de conformidad con las autoridades éticas o legales locales (IACUC o Comités de Ética). Los medicamentos utilizados pueden variar de acuerdo con el protocolo ético aprobado.

1. Preparación y protocolo para los procedimientos con ratones y ratas

1. Diferencias notables entre los protocolos de ratón y rata
   1. Configuraciones para la cirugía frente a registros electrofisiológicos
      1. En el caso de una rata, utilice la misma configuración tanto durante la cirugía como durante los registros electrofisiológicos.
      2. En el caso de un ratón, realice la cirugía en la primera configuración y los registros electrofisiológicos en la segunda configuración.
   2. Fijación de la cabeza
      1. En el caso de una rata, utilice la misma pinza para el hocico para la cirugía y el registro electrofisiológico.
      2. En el caso de un ratón, utilice una pinza para el hocico para la cirugía y una barra de cabeza metálica externa en la configuración para la electrofisiología para permitir la fijación bajo anestesia ligera con isoflurano. Implante la barra de cabeza con cemento dental en el cráneo.
   3. Configuración de la grabación: Utilice una electrónica de adquisición, un software de grabación y un software de estimulación sensorial distintos para las dos especies.
      1. Para el protocolo del ratón, utilice el sistema SpikeGadgets (https://spikegadgets.com) y el software de código abierto Trodes (https://spikegadgets.com/trodes/) para la adquisición de datos.
      2. Para el protocolo rata, utilice el software de grabación Synapse - Neurophysiology Suite (https://www.tdt.com/component/synapse-software/) para la adquisición de datos.
   4. Inducir la anestesia por inyección (rata) o inhalación (ratón).
   5. Lugar de grabación
      1. Realizar grabaciones en la corteza somatosensorial (S1) de un ratón.
      2. Realizar grabaciones en la corteza auditiva primaria (A1) de una rata.
         NOTA: Esta diferencia en la localización anatómica requiere diferentes sitios de craneotomía para cada especie.
2. Preparación y prueba de la red
   1. Remoje la rejilla (excluyendo la placa de conectores) en un detergente enzimático diluido (50% de detergente, 50% de agua destilada) durante al menos 1 h.
   2. Transfiéralo a un baño de agua destilada pura y deje que se seque al aire en un lugar seguro y limpio.
   3. Realice la electrodeposición de negro de platino como parte de la preparación inicial del dispositivo μECoG, no antes de cada sesión de grabación.
      NOTA: Una vez depositado, el recubrimiento de Platinum Black forma una capa estable que sigue siendo efectiva para múltiples grabaciones, aunque su rendimiento debe controlarse mediante pruebas de impedancia periódicas. La electrodeposición de negro de platino (rango objetivo de 10-20 kΩ a 1 kHz) disminuye la impedancia del electrodo y mejora la relación señal-ruido en las grabaciones neuronales.
   4. Para realizar la electrodeposición, prepare una solución de ácido cloroplatínico (generalmente ácido cloroplatínico al 1-3% [H2PtCl6]) que contenga una pequeña cantidad de acetato de plomo (alrededor del 0,005%) como modificador de la deposición. Conecte los electrodos μECoG para que sirvan como electrodo de trabajo en una celda electroquímica de tres electrodos, con un contraelectrodo de platino y un electrodo de referencia Ag/AgCl.
   5. Aplique una densidad de corriente constante de aproximadamente -0,5--2 mA/cm² durante 10-30 s mientras monitorea los valores de impedancia.
   6. Pruebe y registre la impedancia de los electrodos de rejilla (por ejemplo, con un Nano-Z).
   7. Revise la rejilla sobre una fuente de luz y prepare la rejilla para su uso en el registro posterior a la cirugía.
3. Soldadura de cable de referencia
   1. En el caso de un ratón, suelde el extremo de un cable de plata (10 mm de largo, 30 G) a un pin de oro para conectarlo al cable de referencia del sistema de grabación.

2. Cirugía

1. Preparación de materiales y seguimiento general (Cuidado y registro de animales)
   1. Preparación: Limpiar y desinfectar a fondo la zona quirúrgica con un desinfectante adecuado. Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos estén esterilizados, por lo general utilizando un autoclave.
   2. Colocación de herramientas quirúrgicas: Coloque las herramientas quirúrgicas en la almohadilla quirúrgica estéril. Llene el área quirúrgica con aplicadores de punta de algodón y triángulos quirúrgicos de algodón absorbentes. Deseche cualquier residuo biopeligroso en una bolsa de eliminación específica.
   3. Regulación de la temperatura: Encienda la almohadilla térmica dentro del sitio de registro quirúrgico y electrofisiológico. Controle la temperatura de la almohadilla térmica durante toda la cirugía y el registro.
   4. Almohadilla quirúrgica: Coloque una almohadilla quirúrgica o manta azul sobre la cama de regulación de temperatura.
      NOTA: Esta almohadilla debe tener un fondo blanco de algodón suave, que debe mirar hacia arriba.
   5. Posicionamiento del microscopio: Prepare el microscopio y el iluminador adjunto (por ejemplo, anillo LED) a un lado del área quirúrgica. Compruebe que funciona correctamente.
   6. Fresa quirúrgica: Prepare la fresa quirúrgica para el procedimiento de craneotomía.
   7. Suministro de oxígeno: Ajuste el caudal del tanque de oxígeno a 1,0 L/min (rata) o 0,5 l/min (ratón) y coloque la máscara de oxígeno cerca de la almohadilla de regulación. El animal necesitará oxígeno continuo después de la anestesia.
   8. Reemplazo de líquidos: A lo largo de la cirugía, reemplace cualquier pérdida de líquidos, con el objetivo de reemplazar al menos el 1,5% del peso corporal del animal (ratón) o 1 ml por hora (rata). Prepare las soluciones isotónicas en consecuencia.
   9. Animal: Lleve al animal de la instalación de animales a la sala de cirugía de acuerdo con los procedimientos aprobados. Utilice ratones de 8 a 16 semanas de edad, ya sea machos o hembras, de fondo C57Bl6; asimismo, utilizar ratas de 7 semanas de edad, machos, de la cepa Sprague Dawley.
   10. Preparación de medicamentos: Pesar al animal utilizando una báscula con una precisión de 0,1 g. Prepare las cantidades adecuadas de fármaco para la cirugía, utilizando soluciones prediluidas si es necesario.
2. Inducción de la anestesia
   1. Inducción de anestesia para un ratón
      1. Colocar el animal en la cámara de inducción de isoflurano (3-5% de isoflurano en 0,5 L/min Ø₂).
      2. Una vez que se confirme la anestesia profunda (ausencia de reflejo en el pinzamiento de la cola / dedo del pie), coloque al animal en la almohadilla térmica de cirugía y fíjelo en la cabeza.
      3. Inyectar fármacos subcutáneos para la analgesia general: Meloxicam: 5 mg/kg y Buprenorfina: 0,1 mg/kg.
      4. Fije la cabeza del mouse siguiendo los pasos 2.2.1.5-2.2.1.6.
      5. Coloque el hocico en la máscara de anestesia y la cabeza sin apretar en el soporte para la cabeza. Para colocar el ratón en la barra de mordida, primero, asegúrese de que la lengua esté debajo de la varilla y no entre la varilla y el paladar. Use fórceps para mover la lengua si es necesario.
      6. Inserte los incisivos del animal en el orificio de la varilla de la barra de mordida. Asegure la máscara de anestesia del ratón (1,5-2% de isoflurano en 0,5 L/min Ø₂) apretando suavemente el tornillo de fijación. La estabilización de la cabeza durante la cirugía está garantizada únicamente por la barra de mordida.
      7. Proteja los ojos del animal con un ungüento o lubricante para los ojos a base de petróleo para evitar que se seque durante la cirugía.
      8. Mantenga la anestesia durante todo el procedimiento con un flujo continuo de isoflurano a través de la mascarilla.
   2. Inducción de la anestesia para una rata
      1. Utilice isoflurano inicialmente para sedar al animal y facilitar la inyección de anestesia de inducción.
      2. Administrar los fármacos para la anestesia y la analgesia:
         Meloxicam: Dosis de 5 mg/kg, concentración 10 mg/mL, 0,4 mL/kg
         Ketamina: Dosis de 90 mg/kg, concentración 100 mg/mL, 0,9 mL/kg
         Xilacina: Dosis de 10 mg/kg, concentración 100 mg/mL, 0,1 mL/kg
      3. Permita que el animal alcance la anestesia profunda en 15-30 minutos, dependiendo del peso y la edad.
   3. Monitorización de la anestesia
      1. Monitoree continuamente los signos vitales del animal (frecuencia respiratoria) durante todo el procedimiento. Verifique la frecuencia respiratoria como un signo particularmente útil de cambios tempranos en el estado anestésico, y ajuste el nivel de anestesia si la frecuencia respiratoria cambia.
      2. El reflejo de retirada de la pata es un signo crítico del estado anestésico. Pruebe este reflejo periódicamente, ya que su ausencia total asegura niveles suficientes de anestesia para la cirugía.
3. Fijación de la cabeza y monitorización de las constantes vitales
   1. Monitoreo de los signos vitales de los animales
      1. Revise y registre los signos vitales del animal en una hoja experimental. Si los reflejos del animal (por ejemplo, la retirada de las patas) no se han extinguido por completo, administre media dosis adicional de ketamina suplementaria (rata) o aumente la concentración de isoflurano en incrementos del 0,5% (ratón).
   2. Fijación de la cabeza de una rata
      1. Una vez que la rata esté completamente anestesiada (sin reflejos de pata o cola), inserte los incisivos del animal en el orificio de la varilla de la montura de la cabeza.
      2. Inserte con cuidado las puntas de los brazos de montaje en la cresta de la nariz para fijar la cabeza durante la cirugía, asegurándose de que no entre en contacto con los ojos.
      3. Ajuste el ángulo de los brazos hasta que el paladar del animal esté firmemente presionado contra la varilla. Asegúrese de que el cráneo permanezca inmóvil bajo presión.
      4. Asegure ambos brazos del soporte apretando los tornillos con una llave hexagonal.
   3. Configuración de oxígeno para una rata
      1. Asegure el tubo de plástico del tanque de oxígeno sobre el hocico y la nariz del animal, sujetándolo con cinta quirúrgica. Evite las arrugas en el tubo que puedan obstruir el flujo de aire. Ajuste el tanque de oxígeno a un caudal de 1 L/min.
         NOTA: Los signos vitales de los animales, incluida la frecuencia cardíaca y la frecuencia respiratoria, deben controlarse a intervalos de 15 a 30 minutos durante todo el procedimiento.
4. Incisión en el cuero cabelludo
   1. Afeitado y preparación
      1. Afeita el área desde la parte superior del hocico hasta la parte posterior de la cabeza, extendiéndose de un ojo al otro y alrededor de las orejas. Retire la mayor parte del pelaje con unas tijeras o una maquinilla eléctrica y luego aplique crema depilatoria.
   2. Desinfección
      1. Desinfecte el área con un hisopo de algodón empapado en Betadine, luego enjuague con un hisopo de algodón empapado en etanol al 70%. Repita este proceso tres veces y termine con una aplicación final de Betadine para asegurarse de que el área esté estéril.
   3. Inyección de anestésico local
      1. Inyectar el anestésico local lidocaína (1%, 0,1 mL para ratón/0,4 mL por kg para rata) por vía subcutánea en la línea media del cuero cabelludo del animal. Masajee suavemente el cuero cabelludo para esparcir la lidocaína y espere 5 minutos para que el anestésico haga efecto.
   4. Incisión
      1. En el caso de un ratón, levante un punto de la piel con unas pinzas y reseque una pequeña sección de piel (de aproximadamente 1 cm de diámetro) con unas tijeras quirúrgicas.
      2. En el caso de una rata, haz una incisión precisa en la parte anterior del cuero cabelludo, justo encima de la nariz, en la línea media con el bisturí. Tira suavemente de la piel hacia atrás, creando una incisión recta desde entre los ojos hasta la base del cráneo. Levante con cuidado el cuero cabelludo, corte el tejido conectivo y exponga el cráneo por completo.
      3. Exponga el sitio de la craneotomía siguiendo los pasos 2.4.4.4-2.4.4.5.
      4. Con un raspador, limpie el tejido conectivo y el periostio de la parte superior del cráneo. Enjuague la solución salina y use aspiración o una esponja quirúrgica para limpiar el sitio.
      5. Use clips quirúrgicos en los márgenes de la piel para facilitar la exposición clara de la región del cráneo donde se realizará la craneotomía.
5. Craneotomía
   1. Procedimiento general de perforación
      1. Ajuste la velocidad del taladro quirúrgico a un ajuste bajo de 5000 rpm o 7000 rpm para cirujanos experimentados. Realice todas las perforaciones mientras visualiza a través del microscopio.
      2. Sostenga el taladro paralelo a la superficie del cráneo y descanse suavemente contra la superficie.
      3. Con una ligera presión sobre el pedal, comience a perforar en un solo lugar. Realice la perforación en intervalos cortos (5-10 s) con controles frecuentes para detectar cambios en el color del hueso.
         NOTA: El hueso comenzará de un blanco opaco y, a medida que el agujero se hace más profundo, se volverá más translúcido, revelando un tinte rosado.
      4. Cuando la perforación se haya acercado al cerebro, reduzca la velocidad y busque signos de humedad que se filtre en el agujero. Cuando el agujero sea de color rosa oscuro y tenga un ligero brillo, deje de perforar. Con una aguja corta de 30 G, perfore suavemente la capa restante de hueso. El líquido transparente debe salir del nuevo orificio.
   2. Procedimiento de perforación para un ratón
      1. Para colocar un electrodo de referencia para registros fisiológicos, perfore un orificio de rebaba en la parte frontal del hemisferio ipsilateral al área registrada.
      2. Defina el contorno de la craneotomía perforando una zanja poco profunda en su perímetro. En el eje medio-lateral, se parte de la cresta ósea lateral como referencia y se traza una ventana de 4 mm.
      3. En el eje antero-posterior, perfore una ventana de 3 mm comenzando ~ 1 mm anterior de la cresta ósea posterior. El tamaño final de la craneotomía abierta es de aproximadamente una ventana de 4 x 3 mm.
   3. Procedimiento de perforación para una rata
      1. Taladre dos orificios: uno en el cuadrante posterior izquierdo, el otro en el cuadrante anterior derecho.
      2. Inyecte el músculo masetero con una segunda dosis de lidocaína (0,4 mL/kg a 10 mg/mL) y distribúyalo uniformemente en el lugar donde se va a realizar el corte.
      3. Resecar solo el conjunto mínimo de músculos necesarios para exponer el área de la craneotomía.
      4. Con una hoja de bisturí #10 nueva, cree un corte transversal dorsal-ventral en el haz de músculo por encima de la mandíbula del animal (lado derecho). Sostenga el borde posterior del corte con pinzas de agarre y despegue el cráneo mientras corta a lo largo de la cresta ósea del pómulo. De esta manera, el músculo se puede separar del hueso con un sangrado mínimo.
      5. Reseca el músculo anterior de manera similar hasta que se revele una línea de fisura en el cráneo. Esta línea será el límite anterior de la ventana de la craneotomía.
      6. Limpie el músculo alrededor de la cresta posterior con el bisturí y las pinzas, utilizando una fuente de luz fuerte para evitar cortar en regiones muy vascularizadas.
      7. Muele la cresta posterior con el taladro hasta que ya no se eleve por encima de la superficie del cráneo.
         NOTA: Este paso es esencial para establecer la rejilla μECoG para que entre en contacto directo con la superficie cortical.
      8. Taladra el borde dorsal de la ventana, justo por encima de la cresta donde se unió el músculo resecado. Coloque el borde posterior anterior a la cresta posterior perforada. Coloque el borde anterior posterior a la línea de fisura que se extiende hacia abajo cerca de la cuenca del ojo.
         NOTA: Al limpiar el músculo anterior, se debe tener cuidado de evitar el ojo.
6. Perforación de ventana craneotomía
   1. Perforación de la ventana de craneotomía (Consejos)
      1. Al perforar, asegúrese de que la broca se mantenga paralela a la superficie del cráneo. Aplique la menor cantidad de fuerza posible, usando el taladro como un cepillo permitiendo que el taladro haga un ligero contacto con el cráneo mientras usa movimientos cortos y repetitivos a lo largo de la línea de craneotomía prevista.
         NOTA: En las ratas, el borde posterior de la ventana tiene el hueso más grueso. Si se perfora demasiado atrás, el hueso puede exhibir una calidad escamosa y "crujiente" que complica la medición del progreso de la perforación. Si se coloca incorrectamente, esta área ósea puede revelar una coloración roja venosa que da una falsa impresión de proximidad al cerebro.
      2. Perfore cada lado de la ventana de la craneotomía hasta que el hueso se vea de color rosa pálido con una fisura o grieta blanca delgada a lo largo de su longitud. Aplique una ligera presión; El hueso debe producir un "movimiento" distintivo cuando se perfora por completo. Si la grieta parece inconexa, continúe perforando ligeramente hasta lograr una línea continua.
   2. Extirpación del cráneo adelgazado dentro de la ventana de la craneotomía
      1. Cuando el cráneo se haya adelgazado lo suficiente como para que una presión extremadamente ligera haga que toda la ventana se mueva visiblemente, retire el cráneo adelgazado.
      2. Enjuague el sitio de la craneotomía con una gota de solución salina y espere al menos 1 minuto. Esto debilita el hueso adelgazado y ayuda a que el hueso se desprenda de la duramadre. Drene el exceso de solución salina con un triángulo de algodón absorbente o una aspiradora.
      3. Levante con cuidado el cráneo adelgazado con fórceps, evitando dañar el tejido subyacente.
      4. Use una esponja hemostática para mantener el cerebro húmedo.
      5. Sujete firmemente la ventana en los lados dorsal y ventral con pinzas dentadas y tire directamente hacia afuera del cráneo. Si hay alguna dificultad para sacar la ventana del sitio, deténgase y reanude la perforación ligera hasta que el hueso esté lo suficientemente debilitado.
      6. Para las grabaciones de μECoG del ratón, deje la duramadre intacta.
7. Implante de cemento y poste de cabeza para un ratón
   1. Inserte y asegure el cable de referencia.
      1. Inserte el extremo del alambre de plata ~ 1 mm en el orificio de la rebaba, lo suficiente como para entrar en contacto con la superficie del cerebro pero sin causar sangrado.
      2. Aplique el cemento dental en su lugar mientras aplica la primera capa.
   2. Preparación de cemento dental
      1. Use un plato mezclador de cerámica enfriado para preparar la mezcla de cemento dental. Este cemento se espesa rápidamente y requiere la preparación regular de una nueva mezcla. Limpie el plato mezclador antes de preparar una nueva mezcla.
         NOTA: El cemento nunca debe estar en contacto directo con el cerebro.
   3. Aplicación de la primera capa
      1. Aplique la primera capa de cemento alrededor de la craneotomía y en todo el cráneo con microaplicadores. Esta capa actúa como aislamiento eléctrico entre el cráneo y la barra de cabeza de metal.
      2. Rodear completamente la craneotomía con cemento, incluida la cobertura lateral, para proporcionar una protección adecuada para la craneotomía abierta y la rejilla μECoG.
   4. Colocación de la barra de cabecera metálica
      1. Fije la sección grande de la barra principal a su soporte sin apretarlo completamente.
      2. Coloque la barra de cabeza como desee, colocando la sección delgada a lo largo de la línea media del cráneo en contacto con la superficie de cemento.
   5. Fijación del implante
      1. Cubra la barra de cabecera con cemento dental y conéctela a la superficie de cemento.
   6. Extracción del soporte
      1. Espere unos minutos para que el cemento dental se fortalezca.
      2. Una vez que la barra de dirección esté completamente asegurada, retírela quitando primero el tornillo del soporte. Luego, retraiga el soporte hacia atrás, asegurándose de que no se aplique fuerza a la barra principal.
8. Durotomía para cirugía de ratas
   NOTA: Este es un paso quirúrgico desafiante.
   1. Levantamiento de la duramadre
      1. Usando pinzas No. 5, sostenidas lo más paralelas posible a la superficie del cerebro, levante una pequeña porción de la duramadre del cerebro.
      2. Utilice una aguja nueva de 30 g (lo más corta posible) para rasgar con cuidado la duramadre levantada.
         NOTA: La duramadre es una capa delgada y transparente de tejido que se encuentra directamente sobre el cerebro. Se retira para los registros de μECoG en ratas. Es fundamental realizar la durotomía sin alterar la vasculatura de la superficie del cerebro. Los métodos recomendados para realizar la duratomía incluyen el uso de fórceps y una aguja de jeringa para perforar la duramadre antes de tirar de ella hacia atrás, o el uso de una herramienta de duratome anclada cerca del cráneo para retraer la duramadre con cuidado.
   2. Resección de la duramadre
      1. Continúe agarrando la duramadre con las pinzas y levantándola lejos del cerebro. Crea un desgarro diagonal con la aguja mientras levantas.
      2. Use las pinzas para pelar cuidadosamente la duramadre hacia los lados de la ventana de la craneotomía, asegurándose de que la superficie del cerebro permanezca intacta.
9. Transferencia del ratón a la configuración para el registro electrofisiológico
   1. Retire al animal de la instalación de la cirugía levantando suavemente el hocico y los incisivos de la barra de incisivos y luego tirando del animal hacia atrás. Inyectar Clorprotixeno (1 mg/kg, intraperitoneal [IP]), un sedante que permite mantener la anestesia continua utilizando una concentración más baja de Isoflurano.
   2. Coloque el ratón en la configuración de grabación electrofisiológica.
      1. Asegúrese de que la almohadilla térmica esté en su lugar y funcione correctamente.
      2. Fije la cabeza del animal usando la barra de cabeza en el soporte en la configuración electrofisiológica.
      3. Acerque la mascarilla de isoflurano para cubrir completamente el hocico del animal.
   3. Ajuste de la anestesia
      1. Reducir gradualmente los niveles de anestesia a 0,7-1% de isoflurano (en incrementos de 0,5% como máximo cada 5 min).
      2. Controlar la frecuencia respiratoria y los movimientos del animal.
         NOTA: La frecuencia respiratoria debe aumentar ligeramente en comparación con el estado quirúrgico, pero el animal no debe moverse.
      3. Si el animal está en movimiento, aumente inmediatamente la concentración de isoflurano al 2% antes de devolverla lentamente a un nivel más bajo en incrementos del 0,5%.
   4. Inserción de bigotes para la estimulación sensorial
      1. Conecte las vibrisas del ratón al dispositivo de estimulación de bigotes. En este protocolo, inserte nueve vibrisas en puntas de pipeta cortas de 10 μL, que están conectadas a actuadores piezoeléctricos que proporcionan desviaciones rápidas de las vibrisas.

3. Grabación

1. Instalación de la red
   1. Pasos preliminares
      1. Encienda el sistema de grabación y el amplificador.
      2. Revisa los signos vitales del animal.
   2. Procedimiento
      1. Para colocar el animal y las herramientas, siga los pasos 3.1.2.2-3.1.2.4.
      2. Coloque al animal en la configuración de grabación y asegúrese de que la craneotomía permanezca húmeda aplicando regularmente una solución salina.
      3. En el caso de una rata, coloque el micromanipulador en la barandilla del equipo, ubicada muy detrás del sitio de la craneotomía, para evitar interferencias.
      4. En el caso de un ratón, coloque el micromanipulador lateralmente al sitio de la craneotomía junto al animal.
      5. Para adjuntar y colocar la cuadrícula en un ratón, siga los pasos 3.1.2.6-3.1.2.12.
      6. Fije la rejilla μECoG a la etapa principal mediante los conectores ZIF-clip (conector de etapa principal). Sostenga la placa electrónica del escenario en su lugar a través de una barra mecánica fijada a un micromanipulador.
      7. Baje la rejilla μECoG horizontalmente para alinearla plana sobre la craneotomía a lo largo del eje anteroposterior.
         NOTA: A lo largo del eje lateral-medial, el borde de la rejilla debe estar cerca del borde medial de la craneotomía.
      8. Una vez que la rejilla esté colocada cerca del cerebro pero no en contacto con él, conecte el cable de referencia de la rejilla al pin de alambre de plata y oro implantado. Si es necesario, conecte el cable de tierra al animal (por ejemplo, a un músculo descubierto) para reducir el ruido eléctrico.
      9. Además, baje la rejilla para entrar en contacto con el cerebro.
      10. Mueva la rejilla lateralmente para "deslizarse" sobre la superficie dura húmeda. Continúe ajustando hasta que la rejilla esté centrada a lo largo del eje mediolateral.
      11. Use aspiración o una esponja quirúrgica alrededor de los bordes de la craneotomía para eliminar cualquier exceso de solución salina.
      12. Una vez que la preparación esté un poco más seca, asegúrese de que la rejilla se adhiera más firmemente a la duramadre y no se deslice sobre su superficie. Cuando esté más seco, aplique un movimiento lateral a medial a la rejilla flexible, asegurando el contacto con los electrodos más laterales. El cable flexible de la rejilla se doblará naturalmente para adaptarse al contorno del cerebro.
      13. Para colocar la cuadrícula en una rata, siga los pasos 3.1.2.14-3.1.2.18.
      14. Asegure el vástago de la horquilla de sujeción en el micromanipulador, asegurándose de que la placa de conexión de la rejilla se desplace sobre el lado posterior de la ventana de craneotomía cuando se baje.
      15. Ajuste la posición del micromanipulador en la barandilla para que la rejilla quede aproximadamente por encima del sitio de la craneotomía. Baje la rejilla hasta que quede cerca de la superficie del cerebro. Humedece la superficie del cerebro con una pequeña gota de solución salina.
      16. Realice estos pasos con el microscopio. Usando los diales del micromanipulador, ajuste la posición de la rejilla hasta que quede plana contra la superficie del cerebro en el centro de la craneotomía.
      17. Absorbe la humedad con cuidado con un triángulo de algodón absorbente sin tocar la rejilla. Asegúrese de que cada fila de la rejilla esté en contacto con la superficie del cerebro.
          NOTA: La eliminación de la humedad evita la propagación pasiva de la señal eléctrica a través del fluido entre la superficie cortical y la rejilla, que difunde espacialmente la señal detectada en el electrodo.
      18. Con las pinzas número 2 o número 5, inserte el cable de conexión a tierra de la rejilla en el mismo orificio de rebaba o inserte el cable de referencia en un orificio de rebaba y el cable de tierra en el tejido muscular cercano.
          NOTA: Los cables deben insertarse solo ~ 1 mm, lo suficiente para entrar en contacto con el cerebro pero no para causar sangrado o trauma en el cerebro.
2. Comprobación de la posición de la rejilla
   1. Monitorización de la actividad electrofisiológica
      1. Observar la actividad electrofisiológica mediante el software de registro. Bajo anestesia ligera, las señales cerebrales son variables y pueden exhibir una variedad de patrones.
      2. La conexión adecuada de los cables de red, de referencia y de tierra debe producir una alta relación señal-ruido, con amplitudes de señal en el rango de mV. Monitoree el ruido en el rango de alta frecuencia utilizando el filtrado de paso de banda con Trodes (por ejemplo, 100-6000 Hz) y asegúrese de que no exceda unas pocas decenas de microvoltios (μV).
   2. Evaluar la capacidad de respuesta sensorial utilizando ruido (por ejemplo, aplausos o chasquidos de dedos) para inducir potenciales eléctricos de superficie cortical (CSEP) visibles relacionados con eventos.
      NOTA: La estimulación de un solo bigote debe evocar un CSEP claro y nítido relacionado con el evento en solo unos pocos canales (mouse).
   3. Verificación de la posición de la red
      1. En el caso de una rata, confirme que la rejilla está colocada correctamente sobre la corteza auditiva. Por lo general, el primer bloque registrado debe ser un estímulo de ruido blanco de 60 segundos para verificar que la red registra una respuesta adecuada del cerebro. Realice grabaciones de diagnóstico de tono y ruido blanco con la rejilla solo antes de insertar el polytrode para ayudar a determinar si la rejilla se colocó correctamente y si hay una respuesta de señal.
      2. Para un mouse, para verificar la posición de la cuadrícula, realice una sesión de mapeo rápida con 20-30 deflexiones de bigotes espaciadas por 350 ms. Registre la actividad en la banda de potencial de campo local (LFP) mediante Trodes y analícela sin conexión con un código de MATLAB personalizado para visualizar la extensión espacial de la actividad evocada por los bigotes.
   4. Reposicionamiento
      1. Si la rejilla requiere ajuste, humedezca la superficie cortical con gotas de solución salina sobre la rejilla.
      2. Deje la solución salina durante 30 s a 1 min antes de intentar levantar la rejilla.
      3. Levante la rejilla con cuidado y lentamente.
      4. Vuelva a colocarlo siguiendo los pasos descritos en el paso 3.1.
3. Politros laminares para una rata
   1. Configuración de Polytrode
      1. En primer lugar, conecte el adaptador de la etapa principal a la parte posterior del polytrode. Sujete el conector al tercer conjunto de canales en la placa del adaptador. Asegúrese de que la marca negra en el clip mire hacia el lado derecho del extremo comercial del polytrode.
   2. Inserción de politrodo
      1. Inserte el politrodo en el cerebro hasta que los últimos electrodos (los más altos) sean visibles por encima de la superficie cortical. Un descenso lento (hasta 1 μm/s) mejora la calidad de la señal. Espere 15 minutos, permitiendo que el cerebro se adapte a la presencia del polítrodo.
      2. Después de 15 minutos, compruebe si los últimos electrodos han entrado en la superficie cortical. De lo contrario, baje el polytrode un poco más y espere 10 minutos más antes de continuar.
4. Posicionamiento de la fuente de luz optogenética en un ratón
   1. Utilice un sistema de tornillo de ajuste fino en tres dimensiones, montado en un brazo articulado, o un micromanipulador para montar el soporte de fibra óptica.
   2. Para guiar la fuente de luz y ayudar a posicionar la fibra, encienda la luz optogenética a baja intensidad. Utilice el brazo articulado para posicionar la luz optogenética de forma aproximada hacia el área objetivo.
   3. Enfoque y ajuste la posición de la fibra con un micromanipulador o tornillos de ajuste fino.
5. Registro de las señales
   1. Preparación
      1. Desconecte todas las luces, cables de extensión y protectores contra sobretensiones innecesarios en el equipo quirúrgico para reducir la interferencia eléctrica. Apague las luces del techo de la plataforma.
      2. Cierre la puerta del espacio de grabación aislado y la puerta de la sala de cirugía antes de comenzar el experimento.
   2. Inicio de la adquisición
      1. En el caso de una rata, inicie Synapse en la plataforma/computadora de grabación y confirme que la adquisición funciona mediante una vista previa y la verificación de señales. Provoca transitorios de voltaje grandes y agudos en la señal μECoG mediante la presentación de estímulos cerca del animal, es decir, aplausos.
      2. Para un mouse, inicie la sesión de grabación en Trodes.
   3. Hidratación
      1. Inyecte a la rata o al ratón por vía subcutánea 1 ml o 0,1 ml de solución salina cada 1-2 h durante el registro para prevenir la deshidratación. En el caso de una rata, espere de 5 a 10 minutos después de administrar solución salina antes de ejecutar un nuevo bloque de grabación.
   4. Conjuntos de estímulos
      1. En el caso de una rata, una vez confirmado el lugar de registro, se procede a registrar los conjuntos de estímulos necesarios. Un conjunto de ejemplos podría incluir
         Ruido blanco (60 s)
         Diagnóstico de tono (5 min)
         Tono puro (23 min)
         Ondulación móvil dinámica
         Tono 150 (15 min)
         TIMIT (38 min)
      2. En el caso de una rata, vuelva a presentar el ruido blanco y los diagnósticos de tono cada vez que se reposicione la rejilla.
      3. Estímulos táctiles para un ratón: Proporciona estímulos táctiles en una estructura de prueba, con cada prueba conteniendo una serie de desviaciones aleatorias de bigotes cada 350 ms. En el ejemplo proporcionado, cada ensayo incluye 14 deflexiones presentadas a lo largo de 4500 ms.
      4. Estímulos optogenéticos para un ratón: En algunos ensayos, aplique un pulso cuadrado de luz optogenética durante toda la duración del ensayo (5 s). Determine el nivel de luz requerido en función de la opsina utilizada y de la profundidad del tejido que se alcanzará utilizando estimaciones de la penetrancia de la luz (https://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php)
6. Limpieza
   1. Elevación y limpieza de la rejilla
      1. Una vez finalizada la grabación, cierre el software de grabación y vuelva a enchufar las fuentes de luz del equipo.
      2. Si el cerebro está seco, aplique una pequeña gota de solución salina sobre la superficie del cerebro con una jeringa. Deje la solución salina durante 30 s a 1 min antes de intentar levantar la rejilla.
      3. Trabajando bajo el microscopio, levante suavemente la rejilla de la superficie del cerebro usando micromanipuladores.
      4. Si se necesita fuerza adicional mientras se levanta la rejilla, use pinzas con punta de carbono (cerradas) para levantar suavemente la rejilla del cerebro. Asegúrese de que el movimiento del micromanipulador sea ligeramente anterior para despegar suavemente la rejilla de la superficie del cerebro.
      5. Una vez que la rejilla se haya retirado por completo, sepárela de la horquilla de agarre y límpiela siguiendo los pasos 3.6.1.6-3.6.1.7.
      6. Remoje la rejilla (excluyendo la placa de conexión) en un detergente enzimático diluido (50% Enzol, 50% agua destilada) durante al menos 1 h. Luego, transfiéralo a un segundo baño de agua destilada pura y deje que se seque al aire en un lugar seguro y limpio.
      7. Si áreas de la rejilla han depositado sangre o tejido, use un triángulo de algodón empapado en una solución enzimática para limpiarlo suavemente.
      8. Una vez seco, regrese la rejilla a su caja.
   2. Eutanasia del animal
      1. En el caso de un ratón, retire al animal de la fijación de la cabeza y colóquelo en la cámara de eutanasia. Añadir una gasa con 5 mL de isoflurano y esperar 60 s después del cese de la respiración. Verifica la falta de reflejo de retirada y decapita con tijeras afiladas.
      2. En el caso de una rata, inyecte 0,2 ml de pentobarbital IP. Espere 60 segundos después del cese de la respiración, acueste al animal boca arriba y use una cuchilla # 11 para realizar una toracotomía doble.
   3. Limpieza del equipo
      1. Lleve todas las herramientas quirúrgicas al lavabo del laboratorio y colóquelas sobre una toalla quirúrgica. Rocíe las herramientas con una solución de lejía al 10% y lávelas bien en el fregadero. En el caso de las herramientas más sucias, déjelas remojar en una solución de lejía antes de lavarlas.
      2. Alternativamente, use un detergente en polvo (por ejemplo, Contrex AP) con agua frotando los instrumentos con un cepillo en el fregadero.
      3. Una vez que las herramientas estén limpias y enjuagadas, límpielas con toallitas con alcohol y devuélvalas a su espacio de almacenamiento.
   4. Higienización del espacio de trabajo
      1. Deseche todas las agujas y cuchillas usadas en el recipiente para objetos punzocortantes.
      2. Deseche los hisopos de algodón, los triángulos y las toallitas con alcohol contaminados en la bolsa de riesgo biológico.
      3. Limpie todas las superficies de trabajo de la sala de perforación con alcohol y limpie todos los instrumentos antes de cerrar el espacio de trabajo.

Resultados

Hemos descrito los protocolos de registro de señales electrocorticográficas combinados con métodos optogenéticos y registros laminares. Aquí, se presentan señales típicas obtenidas de la corteza somatosensorial del ratón (Figura 1, Figura 2 y Figura 3) y dentro de la corteza auditiva de ratas en respuesta a la estimulación sensorial (Figura 4, Figura 5 y

Discusión

Los protocolos aquí descritos permiten integrar matrices de microelectrocorticografía de alta densidad (μECoG) con sondas laminares y técnicas optogenéticas. La facilidad de uso de este protocolo en modelos de roedores lo convierte en una poderosa herramienta para la investigación de la dinámica cortical, y el número de sujetos se puede aumentar fácilmente. La cuadrícula μECoG de alta densidad permite un mapeo eficiente y espacialmente preciso de la topografía cortical en múltiples áreas...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 cuchilla desechable #11	Swann Morton	303	Para procedimientos quirúrgicos
2 cuchillas desechables #10	Swann Morton	3901	Para procedimientos quirúrgicos
Barras de jaula de 30 mm	Thorlabs	ER	componentes de la jaula
30 mm	Thorlabs	CP33T	que sujeta las lentes
70% etanol	Decon Labs	V1016	Limpieza / Desinfectante (diluido al 70%)
Cepillo aplicador de precisión ajustable Amalgambond PLUS Verde azulado 200/Bx	Aplicador de precisión Henry Schein	1869563	para el cemento
Jeringa de catalizador Amalgambond PLUS de 0,7 ml Ea	componente de cemento	Henry Schein	1861119
Tucker-Davis Technologies)	Tucker-Davis Technologies	PZ5M-512	Se utiliza para el estímulo auditivo y el registro software.
Brazo articulado	Noga	DG60103	para sujetar el sistema de tornillos de ajuste fino
Lentes asféricas para la recogida de luz (y una para enfocar la luz)	Thorlabs	ACL25416U-B	para recoger la luz LED
Equipo auditivo	Tucker-Davis Technologies, Sony, Cortera	RP2.1 Procesador en tiempo real mejorado/HB7 Unidad de auriculares	Se utiliza para el estímulo auditivo y el software de grabación.
de buprenorfina	LLC	#42023017905	Analgesia general
C& B Cemento base Metabond Ea	Henry Schein	1864477	componente de cemento
C& B Metabond L-Powder Cemento Transparente 3 g	Henry Schein	1861068	componente de cemento
Clorclorhidrato de clorprotixeno (ratón)	Sigma Aldrich	Cat. No. C1671	Para la sedación, debe prepararse el mismo día y mantenerse a 4
Microelectrocorticografía de 128 canales diseñada a medida (μ ECoG)	Neuronexus	E128-200-8-40-HZ64	Para grabaciones de neurofisiología. Colocado en la corteza.
Las esponjas de gelatina Dengofoam	Dengen dental	600034 (SKU)	se pueden usar secas o húmedas, saturadas con solución estéril de cloruro de sodio
Broca, tamaño 5 a 9 (Mouse)	Fine Science Tools	19007-XX	XX es del tamaño de la broca, por ejemplo, 05 o 09. Para procedimientos con ratón
Broca de acero Fresa redonda de acero (5,5 mm/7,5 mm)	LZQ Tools	Broca de barra dental Fresa de acero inoxidable	Para procedimientos con ratas
Pinzas Dumont No. 5	Fine Science Tools	11251-10	Para procedimientos quirúrgicos
Pinzas Dumont #5 dobladas 45°	Instrumentos de precisión World	14101	para quitar la ventana de craneotomía
Reproductor de DVD (Sony)	Sony	CDP-C345	Sistema utilizado para aceptar y reproducir conjuntos de estímulos
Altavoz electrostático	Sony	XS-162ES	Utilizado para estímulos auditivos y software de grabación. Ubicado dentro de la plataforma, reproduce el sonido del roedor sedado
Detergente enzimático (Enzol)	Productos de esterilización avanzados	2252	Limpieza/Desinfectante
EverEdge 2.0 Scaler Sickle Double End H6/H7 #9	Henry Schein	6011862	para fregar el cráneo
Sistema de tornillos de ajuste fino en 3 dimensiones	Narishige	U-3C	para un posicionamiento preciso del extremo
de fibra ópticaPin de oro	Harwin Inc	G125-1020005	Usado para referencia de contacto en ratón Soldado al alambre de plata
Pinzas de agarre	Herramientas de ciencia fina	00632-11	Para procedimientos quirúrgicos
Isoflurano	Covetrus	11695067772	requieren un vaporizador
Ketamina (Inyección de clorhidrato) (Rata)	Dechra	17033-101-10	Anestesia/
Analgésico LED	Nuevo Energy	LED XLAMP XPE2 BLUE STARBOARD	Fuente de luz LED azul
	Driver LED Thorlabs	LEDD1B	Driver LED
Lidocaine	Covetrus	VINB-0024-6800	para diluir al 1% en solución salina
Meloxicam	Covetrus	6451603845	Antiinflamatorio utilizado para la analgesia
general Micromanipulador	Narishige (Equipo estereotáxico)	SR-6R + Componentes SR-10R-HT	Se utiliza para manipular ECoG y roedores con movimientos finos
Pinzas n.º 2	Fine Science Tools	91117-10	Para procedimientos quirúrgicos
Pinzas n.º 55	Fine Science Tools	1129551	Para procedimientos quirúrgicos
Lubricante oftálmico (lágrimas artificiales)	Akorn	17478-062-35	Se utiliza para proteger los ojos de la desecación durante los procedimientos
quirúrgicosFibra óptica 200µ m Diámetro del núcleo	Thorlabs	M133L02	Conector FC/PC 2 m de largo
Pentobarbital (Rata)	Covetrus / Dechra	VINV-C0II-0008	Anestesia/Analgésico
Platino Negro	Sigma	205915-250MG	Para registros de neurofisiología (Utilizado para galvanoplastia de los contactos en el μ Cuadrículas ECoG).
Povidona Yodada 10%	Betadine	https://betadine.com/medical-professionals/betadine-solution/	sin número de catálogo (no al por menor
) Detergente en polvo (Contrex AP)	Decon Labs	5204	Cinta de limpieza / desinfectante
precortada para tubo de oxígeno	ULINE (Varios proveedores)	S-14726	Se utiliza para sujetar el tubo de oxígeno al cono de la nariz del equipo estereotáxico de roedores
Mango de bisturí # 3	World precision instruments	500236-G	para cuchillas # 10, #11 y #15
Scraper	Fine Science Tools	1007516	Para procedimientos
quirúrgicos Agujas cortas de 30 G	ExelInt	26437	Para procedimientos quirúrgicos e inyecciones
Silver Wire	Warner Instruments	63-1319	Para grabaciones de neurofisiología (Utilizado para conexión a tierra y como electrodo de referencia).
Solución salina esterilizada (cloruro de sodio al 0,9% para inyección)	Hospira	00409-7101-67 (NDC)	Para dilución de inyectables y reemplazo de fluidos corporales
Stoelting Hopkins Bulldog	Fine Science Tools	10-000-481	Para procedimientos quirúrgicos
Desinfectante de superficies (Cobertura más desinfectante NDP)	Steris life science	638708	Limpieza/Desinfectante
Conectores TDT ZIF-clip para su adquisición.	Tucker-Davis Technologies	ZIF-Clip Analog Headstages	Conecta ECoG con equipo de adquisición externo
Horquilla de sujeción de dos puntas	Tucker-Davis Technologies	Z-ROD128	Se utiliza para conectar los clips TDT con el micromanipulador
Xilacina (Rata)	Covetrus	1XYL006	Anestesia/Analgésico