El plasma rico en plaquetas (PRP) se utiliza en el tratamiento de los trastornos musculoesqueléticos equinos. Diferentes técnicas producen PRP con diferentes concentraciones de plaquetas y leucocitos. Este artículo describe un método para obtener PRP a partir de la sangre de caballo.
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Artículo de método
Un método simple de tubo de doble centrifugación para obtener plasma rico en plaquetas de sangre equina
En este artículo
Resumen
Resumen
El plasma rico en plaquetas (PRP) se utiliza ampliamente como tratamiento de rutina para afecciones musculoesqueléticas crónicas en caballos, como osteoartritis, tendinopatías y desmopatías. Esta eficacia se debe a la alta concentración de factores de crecimiento y citoquinas antiinflamatorias que se liberan tras la activación de este agente ortobiológico, ya sea activado de forma endógena o exógena. A pesar de su creciente popularidad, existe una notable ausencia de videos instructivos que demuestren las técnicas para obtener PRP en caballos.
Este estudio examina un método de doble tubo de centrifugación para obtener PRP en caballos. La sangre total de seis caballos se recogió en tubos de citrato de sodio y se centrifugó dos veces a 120 × g durante 5 min y 240 × g durante 5 min. La concentración media de plaquetas para PRP fue de 360,95 ± 56,31 plaquetas (PLT) × 103/μL, mientras que la concentración media de leucocitos fue de 3,05 ± 1,53 células × 103/μL. El recuento de plaquetas en PRP fue 2,41 veces mayor que en sangre total, mientras que la concentración de leucocitos en PRP fue 0,44 veces menor. La eficiencia de recolección de PLT en PRP fue del 17%, mientras que la eficiencia de recolección de leucocitos en PRP fue del 3,1%. Las concentraciones medias del factor de crecimiento transformante beta 1 y del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB en el PRP fueron 2601,82 (intervalo de confianza [IC] del 95%: 2358,88-2844,76) pg/mL y 1208,05 (IC del 95%: 1051,09-1365,02) pg/mL, respectivamente. Estos resultados indican que el PRP se puede obtener de manera eficiente y reproducible a través de un método simple y rentable adecuado para su uso por parte de los profesionales equinos.
Introducción
El plasma rico en plaquetas (PRP) es un producto ortobiológico comúnmente utilizado para tratar afecciones musculoesqueléticas equinas crónicas como tendinopatías, desmopatías, osteoartritis y laminitis 1,2,3. También es eficaz en el tratamiento de heridas de extremidades y enfermedades de la superficie ocular 4,5. La justificación de su uso se basa en las altas concentraciones de factores de crecimiento (GF) liberados principalmente por las plaquetas6. Los leucocitos también contribuyen liberando citoquinas reguladoras y antiinflamatorias7. Los GF como el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (PDGF-BB) ejercen potentes efectos anabólicos, proliferativos, angiogénicos y antiinflamatorios8. Tras la activación exógena o endógena, el PRP se polimeriza en un gel rico en plaquetas, lo que facilita el tráfico, el anclaje y la diferenciación celular 6,9. De esta manera, el PRP sirve como un andamio vivo complejo y no solo como un contenedor para GF y citoquinas10.
Varios sistemas clasifican los productos PRP utilizados tanto en humanos como en caballos 6,11,12. Uno de los sistemas más simples y comunes clasifica estos hemocomponentes en función de la concentración de leucocitos11,12. De acuerdo con esta clasificación, los productos de PRP con concentraciones de leucocitos bajas a insignificantes y concentraciones de plaquetas bajas a moderadas, en relación con los niveles en la sangre total del caballo, se denominan PRP puro (P-PRP)6,11,12. Por el contrario, los productos PRP con concentraciones de leucocitos detectables a altas y concentraciones de plaquetas de moderadas a altas se denominan plasma rico en leucocitos y plaquetas (L-PRP)6,11,12.
Los productos de P-PRP se obtienen típicamente mediante centrifugación de tubo a tubo en la que se recolecta sangre completa de caballos en tubos que contienen anticoagulantes como citrato y citrato de sodio, fosfato y dextrosa13. La sangre se centrifuga dos veces para separar las plaquetas de otros componentes14. Por el contrario, los productos L-PRP se preparan principalmente utilizando kits semiautomáticos diseñados para sangre humana, algunos de los cuales han sido validados para su uso en caballos 6,15. Estos kits semiautomáticos generalmente requieren centrífugas especializadas y tienen un costo más alto16, así como posibles preocupaciones sobre el manejo aséptico, lo que puede complicar su uso práctico en entornos clínicos17. Además, estos kits pueden resultar en la concentración indeseable de leucocitos o glóbulos rojos excesivos, lo que podría ser perjudicial en ciertas situaciones clínicas18. Por ejemplo, los recuentos elevados de leucocitos pueden provocar una inflamación excesiva, y una sobreabundancia de glóbulos rojos podría interferir con el proceso de curación o provocar complicaciones como irritación o rechazo de los tejidos15; sin embargo, un método comúnmente utilizado para producir L-PRP equino implica un proceso gravitacional que no requiere equipo especializado19.
A la luz de estas limitaciones, son muy deseables alternativas más sencillas y rentables para la preparación del PRP. Varios estudios in vitro, modelos experimentales de enfermedad musculoesquelética y observaciones en equinos han demostrado que tanto los productos P-PRP como los L-PRP tienen efectos beneficiosos sobre las células y tejidos tratados 1,2,20. Estos productos promueven la curación, reducen la inflamación y mejoran la regeneración de tejidos6. Sin embargo, la decisión de usar P-PRP o L-PRP para tratar a un equino podría estar influenciada por factores técnicos y económicos.
Según los autores, no hay estudios publicados que describan y demuestren completamente un procedimiento paso a paso ampliamente validado para obtener un producto PRP a partir de sangre equina. Este artículo describe los procedimientos necesarios para recolectar sangre completa de caballos de manera segura y producir un producto PRP adecuado tanto para uso experimental como clínico. También incluye la validación de este ortobiológico mediante la cuantificación de plaquetas y leucocitos y la determinación de la concentración de TGF-β1 y PDGF-BB, que son parte integral de sus efectos terapéuticos. Al estandarizar el proceso y demostrar la eficacia del producto, este estudio busca proporcionar un método confiable y accesible para que los profesionales equinos preparen PRP con confianza y precisión.
Aunque el método de doble centrifugación para producir PRP equino fue descrito por primera vez por Argüelles et al.14 en 2006, esta es la primera vez que el protocolo se presenta completamente en un video. Este video pretende servir como un recurso práctico para los practicantes equinos que enfrentan limitaciones técnicas y restricciones presupuestarias que les impiden usar kits de PRP más sofisticados y costosos para caballos con trastornos musculoesqueléticos.
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Protocolo
Este estudio se realizó de acuerdo con los protocolos internos para la preparación y uso de PRP en caballos en el Hospital Veterinario Docente de la Universidad de Caldas, Manizales, Colombia. Este estudio no requirió la aprobación del Comité Interno de Cuidado de Animales ya que los datos se obtuvieron de caballos cojos tratados clínicamente en nuestra institución. Para desarrollar este protocolo se utilizaron datos de seis caballos criollos colombianos, tres yeguas y tres castrados, con una edad promedio de 7,4 (± 2,6) años. Los propietarios de los caballos fueron informados de la naturaleza del estudio y firmaron un consentimiento informado. Todos los caballos incluidos en el estudio estaban clínicamente sanos, excepto por el problema musculoesquelético que se estaba tratando. Solo se incluyeron animales con un recuento basal de plaquetas superior a 100 × 103/mL de sangre total. Es importante tener en cuenta que los caballos con concentraciones plaquetarias más bajas pueden considerarse trombocitopénicos14. Además, estos animales exhibieron recuentos sanguíneos normales, parámetros bioquímicos clínicos hepáticos y renales y valores de análisis de orina dentro del rango normal para la especie equina.
1. Restricción de caballos y desinfección de la piel
- Para la seguridad tanto del caballo como del veterinario, sujete al caballo (Eqqus caballus) de forma segura en un conducto de examen clínico o con una brida (Figura 1A), dependiendo del comportamiento del animal. A continuación, recorte un área de cabello de 5 cm x 5 cm con una afeitadora eléctrica en el tercio medio de un lado del cuello, sobre la vena yugular.
NOTA: Algunos propietarios prefieren que el caballo no sea recortado. Un estudio indica que el corte del cabello en el sitio de la venopunción no es necesario para prevenir la contaminación bacteriana de P-PRP21. Por lo tanto, este procedimiento queda a discreción del veterinario. - Realice una preparación preliminar de la piel no estéril sobre el área recortada de la vena yugular durante al menos 10 cm con una gasa no estéril y guantes durante aproximadamente 3 min. Aplicar varias gasas empapadas en espuma antiséptica en forma circular (Figura 1B).
- Prepare el sitio de venopunción asépticamente usando guantes estériles y gasas empapadas en desinfectante. Frote la piel en el área del cuello con movimientos circulares durante aproximadamente 5 min. Limpie el área con una gasa estéril empapada en alcohol etílico al 95%.
2. Extracción de sangre aséptica
- Coloque 16 tubos de citrato de sodio de 4,5 ml, previamente limpiados con una gasa empapada en alcohol etílico al 95%, en una rejilla de plástico limpia. Impregne las tapas de goma de los tubos de vacío con alcohol etílico al 95%, especialmente en el hueco para el acoplamiento de la aguja.
NOTA: En general, se requieren ocho tubos de citrato de sodio de 4,5 ml para obtener 2,5 ml de PRP. El número de tubos utilizados en un caso particular dependerá de los tejidos blandos o de la articulación específica que se esté tratando. - Inserte estérilmente una aguja de mariposa en el sitio yugular desinfectado (Figura 2A) y conecte tubos de citrato de sodio de 4,5 ml al soporte (Figura 2B). Agite suavemente los tubos y colóquelos en una rejilla de plástico.
NOTA: Se utiliza un tubo de citrato de sodio de 4,5 ml para hemogramas automatizados y para preparar plasma después de la centrifugación de centrifugación dura. Este plasma se utiliza luego como control negativo para las comparaciones de factor de crecimiento y enriquecimiento de citoquinas con PRP.
3. Obtención de plasma rico en plaquetas
- Coloque los tubos de citrato de sodio de 4,5 ml que contienen sangre completa en un rotor basculante de cuatro posiciones en un ángulo de 90° en una centrífuga de banco. Centrifugar los tubos a 120 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, coloque los tubos de 4,5 ml que contienen sangre citratada y dos tubos lisos adicionales de 10 ml en una gradilla y coloque la gradilla en el lado no dominante de la mano del operador dentro de una campana de flujo laminar de clase II sobre una cortina estéril e impermeable.
NOTA: Un estudio sugiere que una campana de flujo laminar de Clase II no es esencial para prevenir la contaminación bacteriana durante la adquisición de PRP21. En cambio, el PRP se puede preparar en una sala limpia libre de corrientes de aire y polvo. En este escenario, la rejilla del tubo de sangre se puede colocar sobre una mesa cubierta con un paño estéril e impermeable. - Primera centrifugación: Con una mascarilla y guantes estériles, coloque una jeringa luer estéril de 10 ml junto con una aguja estéril (21 G 5/8") en el lado dominante de la mano en el interior de la campana de flujo laminar.
NOTA: A partir de este momento, la mano enguantada dominante siempre permanece estéril, mientras que las tapas de goma de los tubos de citrato de sodio deben retirarse con la mano no dominante enguantada. - Inserte la aguja estéril en cada tubo de sangre citratada centrifugado 3 mm sobre la capa leucocitaria (Figura 3A) y aspire suavemente el 50% de la fracción plasmática, evitando turbulencias de líquidos y aspiración de sangre. Una vez aspirados 10 ml de plasma de cuatro tubos de 4,5 ml, distribúyalo en tubos planos estériles de 5 a 10 ml (Figura 3B).
NOTA: Retire las tapas de goma de estos tubos con la mano no dominante y colóquelos sobre un sitio estéril de la cortina o sosténgalos para evitar la contaminación bacteriana. - Segunda centrifugación: vuelva a cerrar los tubos con los tapones de goma y colóquelos en un estado equilibrado en un rotor basculante de cuatro posiciones en un ángulo de 90° en la centrífuga de sobremesa y centrifugue estos tubos a 240 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
NOTA: La elección de la fuerza de centrifugación relativa (RCF o g) se basa en un estudio seminal14 que describió por primera vez este método para obtener PRP a partir de sangre equina. Además, este método ha sido evaluado para su reproducibilidad por otros autores22. - Coloque los tubos en una gradilla y colóquelos en el lado no dominante dentro de la campana de flujo laminar de clase II, encima de la cortina impermeable, estéril e impermeable previamente colocada.
- Use la mano no dominante para quitar las tapas de goma y la mano dominante estéril para aspirar lentamente el primer 75% del plasma usando una aguja espinal de 18 G y 90 mm conectada a una jeringa luer estéril de 10 ml (Figura 3C). Deseche esta jeringa o resérvela para otros usos experimentales o clínicos, ya que contiene plasma pobre en plaquetas (PPP). A continuación, conecte la aguja espinal estéril utilizada anteriormente a una jeringa luer estéril de 5 o 10 ml para aspirar el plasma restante (25%) del tubo liso estéril de 5 a 10 ml. Esta fracción se conoce como P-PRP (Figura 3D).
NOTA: En determinadas condiciones clínicas y experimentales, se utiliza una alícuota de 0,5-1 ml de PRP para hemogramas automatizados seguidos de análisis del factor de crecimiento (TGF-β1 y PDGF-BB) mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. La medición de estos mediadores puede realizarse 3 h después de la activación del P-PRP con sales de calcio o trombina23 o después de inducir daño celular por cambio de temperatura o la adición de detergentes no iónicos24. - Envuelva la jeringa Luer estéril que contiene PRP en un paño pequeño e impermeable estéril con una aguja o tapa estéril adjunta para evitar la contaminación bacteriana del producto ortobiológico (Figura 4A).
NOTA: La estructura anatómica del caballo a tratar debe prepararse para la inyección aséptica como se describe en la sección 1 de este protocolo. El caballo debe estar adecuadamente sujeto y sedado para minimizar las molestias y garantizar la seguridad tanto del caballo como del veterinario. El producto PRP debe manipularse con guantes y agujas estériles y puede o no activarse según la preferencia del médico (Figura 4B).
4. Análisis estadístico
- Recopilar datos sobre los recuentos de plaquetas y leucocitos en sangre total y PRP. Evalúe la normalidad de los datos mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Si los datos se distribuyen normalmente (P > 0,05), compare y analice los datos de la célula mediante la prueba t. Si los datos de concentración de plaquetas y leucocitos no se distribuyen normalmente (P < 0,05), compare y analice los datos mediante una prueba de Wilcoxon.
- Determinar la concentración de eficiencia plaquetaria y leucocitaria en P-PRP de acuerdo con las siguientes fórmulas25:
Eficiencia de recolección de plaquetas =
× 100
Eficiencia de recolección de leucocitos =
× 100 - Recopilar datos de las concentraciones de TGF-β1 y PDGF-BB en sobrenadantes de PRP plasmáticos (control negativo) (después de 3 h de activación con gluconato de calcio) y lisados de PRP obtenidos mediante la adición de una solución detergente no iónica.
- Utilice un modelo mixto lineal generalizado para comparar las concentraciones de factores de crecimiento entre plasma, sobrenadantes de PRP y lisado de PRP. En caso de diferencias estadísticas significativas, aplicar una prueba post-hoc de Tukey.
- Considere p < 0,05 valores estadísticamente significativos para todas las pruebas.
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Resultados
El recuento medio de plaquetas (plaquetas × 103/μL) fue significativamente mayor en PRP que en sangre total (p < 0,001). Por el contrario, la concentración media de leucocitos (leucocitos × 103/μL) en PRP fue significativamente menor que la de sangre total (p < 0,001) (Tabla 1). En concreto, el recuento de plaquetas en el PRP fue 2,41 veces mayor que en la sangre total, mientras que la concentración de leucocitos en el PRP fue 0,44 veces menor. La eficiencia de recolección de ...
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Discusión
El uso de PRP en medicina humana y veterinaria para el tratamiento de trastornos musculoesqueléticos crónicos está aumentando 1,8,26,27. Sin embargo, una crítica importante a las aplicaciones del PRP en entornos experimentales y clínicos es la falta de datos básicos sobre las técnicas y protocolos utilizados para preparar estos hemocomponentes...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.
Agradecimientos
Agradecemos a la Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados de la Universidad de Caldas, Manizales, Colombia por su apoyo financiero para publicar este artículo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de extracción de sangre venosa simple de 10 ml | BD Vacutainer, Franklin Lakes, Nueva Jersey, Estados Unidos | Referencia: 366430 | Esto es solo un ejemplo, se pueden usar tubos de otras marcas. |
| Tubos de citrato de sodio de 4,5 ml (105 M/3,2%) | BD Vacutainer, Franklin Lakes, Nueva Jersey, Estados Unidos | 107451 | Esto es solo un ejemplo, se pueden usar tubos de otras marcas. |
| Centrífuga de banco | Rotofix 32A, Hettich GmbH, Tuttlingen, Alemania | Se pueden utilizar otras centrífugas de banco. | |
| Aguja de mariposa (21 G &veces; 0.75 in.) con 12 in. tubo y soporte pre-conectado | Set de recolección de sangre Safety-Lok, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USA | Referencia 367296 | Este es solo un ejemplo, se pueden usar agujas de mariposa de otras marcas. |
| Solución de espuma de clorhexidina al 2,3-4% | La marca o los nombres comerciales de estos productos pueden variar de un país a otro. | ||
| Campana de flujo laminar de clase II | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, EE. UU. | Se pueden utilizar otras campanas de flujo laminar de clase II | |
| Lector ELISA | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, EE. UU. | ||
| Alcohol etílico al 95% | La marca o los nombres comerciales de estos productos pueden variar de un país a otro. | ||
| ELISA DuoSet PDGF-BB humano | R& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, EE. UU. | DY220 | |
| TGF-beta 1 humano DouSet ELISA | R& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, EE. UU. | DY240 | |
| Solución de espuma de povidona yodada al 4-10% | La marca o los nombres comerciales de estos productos pueden variar de un país a otro. | ||
| Software SPSS 25.0 | IBM Corp, SPSS, NY, EE. UU. | ||
| Jeringas luer estériles de varios volúmenes | Jeringa Discardit, BD Vacutainer, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU. | Esto es solo un ejemplo, se pueden usar jeringas de otras marcas. | |
| Aguja espinal estéril (18 G &veces; 90 mm) | Aguja de espinela BD Quincke, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU. | Este es solo un ejemplo, se pueden usar agujas espinales de otras marcas. |
Referencias
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