Extracción de ADN micobacteriano mediante batido de perlas en tampón personalizado seguido de un flujo de trabajo NGS

Summary

Este protocolo muestra que el batido de perlas combinado con la purificación de perlas de captura de ADN proporciona un método rápido y consistente para extraer ADN de muestras de Mycobacterium tuberculosis , lo que lo convierte en una opción efectiva para aplicaciones de secuenciación de próxima generación.

Abstract

La tuberculosis es una enfermedad mortal, y la aparición de resistencia a los antibióticos en la bacteria agente causal, Mycobacterium tuberculosis, empeora los resultados del tratamiento. Se necesita una identificación precisa y rápida de la resistencia a los medicamentos mediante tecnologías de secuenciación para mejorar los resultados de los pacientes con tuberculosis a través de regímenes terapéuticos personalizados. El método de extracción de ADN es fundamental para los ensayos moleculares posteriores y se complica por la dureza de la pared celular de Mycobacterium, la baja carga bacilar de muchas muestras clínicas y la complejidad de la matriz de esputo. Existen numerosos métodos de extracción de ADN para M . tuberculosis reportados, pero actualmente no existe un estándar de oro. Además, se ha demostrado que pocos de estos métodos funcionan de manera consistente, y muchos no son adecuados para entornos de bajos recursos y alta carga de tuberculosis. En consecuencia, los laboratorios introducen con frecuencia sus propias modificaciones en los procedimientos, lo que da lugar a una variabilidad significativa del método. Aquí, presentamos un protocolo rentable, rápido y estandarizado para la extracción de ADN micobacteriano tanto de esputo clínico como de cultivo que produce ADN adecuado para qPCR, y que debe considerarse para su uso en laboratorios de diagnóstico clínico.

Introduction

La extracción de ADN de alta calidad de M. tuberculosis es necesaria para la detección de la tuberculosis (TB) resistente a los medicamentos mediante la secuenciación dirigida de próxima generación (NGS) y la secuenciación del genoma completo (WGS), pero a menudo se pasa por alto. Desarrollamos un protocolo estandarizado para proporcionar ADN consistente y de alta calidad para aplicaciones clínicas de NGS, incluidos los enfoques de NGS dirigidos como Deeplex-MycTB (GenoScreen) y la secuenciación del genoma completo, que ahora son recomendados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para el diagnóstico de la tuberculosis resistente a los medicamentos. En particular, si bien la OMS recomienda estas estrategias de diagnóstico basadas en NGS, no especifica los protocolos particulares de extracción de ADN para respaldarlas. Nuestro método se puede utilizar con pruebas avaladas por la OMS, así como con tecnologías emergentes que requieren ADN micobacteriano de alta calidad.

El desafío de la extracción se deriva de la pared celular única de M. tuberculosis, compuesta por ácidos micólicos y lípidos que hacen que sea excepcionalmente difícil de abrir. Las soluciones de extracción publicadas actualmente tienen una variación sustancial en la lisis (por ejemplo, sonicación, química, calor y batido de perlas) y los métodos de extracción de ADN (por ejemplo, extracción con fenol-cloroformo, precipitación de etanol, métodos basados en CTAB y basados en columna y perlas), lo que da lugar a diferencias en el rendimiento, la pureza y la calidad del ADN 1,2,3,4,5,6,7,8 ^,9,10,11,12,13,14,15,16. Además, los grupos de investigación rara vez utilizan el mismo método de extracción de ADN y, a menudo, miden el éxito de manera diferente. Esto dificulta la determinación de qué método funciona mejor, ya que el enfoque óptimo depende del tipo de aplicación molecular. Por ejemplo, la resolución de variantes estructurales de M. tuberculosis en el esputo mediante secuenciación de lectura larga requiere ADN de mayor calidad y polimerasa más precisa que la ejecución de una herramienta de diagnóstico de pago que solo se dirige a una pequeña región de rpoB. Varios factores complican aún más el éxito de la extracción de ADN. La cantidad de ADN que podemos extraer varía según el tipo de muestra, la cantidad de bacterias presentes y si hay sustancias (ADN no micobacteriano coextraído e inhibidores de PCR) que interfieren con el proceso. Incluso aspectos técnicos, como la precisión con la que un técnico de laboratorio pipetea, pueden afectar a los resultados. Los métodos actuales a menudo se quedan cortos cuando se procesan muestras con bajas cargas bacterianas o altos niveles de ADN contaminante, que se encuentran comúnmente en entornos clínicos 17,18,19.

El batido de cordones en un tampón personalizado, seguido de un protocolo de limpieza de cordones, ofrece ventajas clave sobre otros métodos. Se trata de un flujo de trabajo sencillo y rápido que reduce la posibilidad de variación en función del operador y mantiene la integridad del ADN para las aplicaciones NGS posteriores. Este enfoque estandarizado es especialmente adecuado para los laboratorios clínicos que buscan resultados fiables y reproducibles utilizando los ensayos de resistencia a los fármacos NGS recomendados por la OMS y todas las aplicaciones de WGS.

Protocol

Este estudio se llevó a cabo en la Universidad de California en San Francisco (UCSF) bajo la aprobación del Comité Institucional de Bioseguridad (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) y sigue las pautas de ética de investigación de la UCSF. Obtuvimos muestras de esputo remanente recolectadas por Discovery Life Sciences bajo un protocolo de Renuncia de Consentimiento aprobado por el IRB de personas con afecciones respiratorias no relacionadas con la tuberculosis.

1. Preparación de tampones

1. Tampón Triton personalizado (Tabla 1): Para preparar 100 mL de tampón Triton personalizado, comience combinando 2 mL de NaCl 5 M, 1 mL de Tris-HCl (pH 8), 1 mL de Triton X-100 y 0,2 mL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 M. Agregue agua ultrapura para llevar el volumen total a 100 mL. Filtre y esterilice antes de usar. El tampón final contiene 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA y 1% de Triton X-100.
2. TE de EDTA bajo (Tabla 2): Para preparar 100 mL de tampón de TE de EDTA bajo, combine 1 mL de Tris-HCl 1M (pH 8) y 0,02 mL de EDTA 0,5 M. Agregue agua ultrapura para llevar el volumen total a 100 mL. El tampón final contiene 10 mM de Tris-HCl y 0,1 mM de EDTA.

2. Preparación de tubos de lisis

1. Con una hoja de bisturí, corte con cuidado la parte inferior de un tubo con tapón de rosca de 1,5 ml justo debajo del punto de inflexión.
2. Corta la punta de una punta P1000, corta una cuña en forma de V cerca del extremo y coloca en ella la parte inferior preparada del tubo del tapón de rosca. Consulte la Figura 1 para ver un diagrama de la cuchara.
3. Llene un recipiente estéril (por ejemplo, un depósito o una placa de Petri) con perlas de silicato de circonio de 0,1 mm y utilice la cuchara preparada para distribuir una cucharada de perlas (~200 mg) en tubos con tapón de rosca de 1,5 ml.

Figura 1: Cuchara de distribución de cuentas interna. La cuchara fue diseñada para la fácil transferencia de ~ 200 mg de perlas de circonio de 0,1 mm a los tubos de procesamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Preparación de los insumos

NOTA: Toda la preparación de muestras debe realizarse de acuerdo con los protocolos de bioseguridad de su instalación. Recomendamos encarecidamente manipular materiales infecciosos dentro de un gabinete de bioseguridad (BSC) de Clase II para minimizar el riesgo de exposición a aerosoles.

1. Cultivo de células bacterianas
   1. Centrífuga ~ 5 mL de cultivo de M. tuberculosis (ya sea MGIT o cultivo de líquido turbio) en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL a velocidad máxima (≥ 3,000 x g) durante 10 min.
   2. Con una pipeta serológica de 10 mL, retire con cuidado todo menos ~ 500 μL del sobrenadante sin alterar el pellet. Retire el sobrenadante restante con una pipeta P1000 sin alterar el pellet.
   3. Vuelva a suspender el pellet en 350 μL de tampón Triton personalizado pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Si es necesario (es decir, para extraer muestras para procesarlas fuera de un BSL-3), inactive la muestra de acuerdo con los procedimientos operativos estándar.
2. Preparación del esputo
   1. Transfiera 1-5 mL de muestra de esputo (espontánea o inducida) a un tubo centrífugo estéril de 50 mL.
3. Liuefacción de DTT
   1. Agregue cuatro volúmenes de 100 mM de ditiotreitol a la muestra de esputo (el volumen puede variar). Si utiliza un reactivo comercial, siga las instrucciones de dilución del fabricante.
   2. Vórtice a fondo durante 30 s. Incubar a temperatura ambiente (20-25 °C) durante 7 min. Vórtice de nuevo durante 30 s.
   3. Repita los pasos 3.3.1. y 3.3.2. 1x, para muestras muy viscosas, realice hasta 5 ciclos de incubación-vórtice.
   4. Centrifugar a velocidad máxima (≥ 3.000 x g) durante 10 min. Con una pipeta serológica de 10 mL, deseche cuidadosamente todo menos ~ 500 μL del sobrenadante. Retire el sobrenadante restante con una pipeta P1000 sin alterar el pellet.
   5. Vuelva a suspender el pellet en 350 μL de tampón Triton personalizado.
4. Liuefacción de NALC-NaOH
   1. Para preparar la solución de NALC-NaOH, siga las instrucciones del fabricante para la preparación y dilución.
   2. Añadir cuatro volúmenes de solución de NALC-NaOH a la muestra de esputo (espontánea o inducida, el volumen puede variar).
   3. Vórtice durante 30 s. Incubar a temperatura ambiente (20-25 °C) durante 7 min. Repita los pasos 3.4.1 y 3.4.2. 1 vez. Para muestras muy viscosas, realice hasta 5 ciclos de incubación-vórtice.
   4. Agregue PBS a la marca de 50 ml. Vórtice brevemente para mezclar. Centrifugar a velocidad máxima (≥ 3.000 x g) durante 10 min.
   5. Con una pipeta serológica de 50 mL, deseche cuidadosamente todo menos ~ 500 μL del sobrenadante. Retire el sobrenadante restante con una pipeta P1000 sin alterar el pellet.
   6. Vuelva a suspender el pellet en 350 μL de tampón Triton personalizado. Si es necesario (es decir, para extraer muestras para procesarlas fuera de un BSL-3), inactive la muestra de acuerdo con los procedimientos operativos estándar.

4. Extracción de ADN

1. Transfiera la suspensión bacteriana inactivada (350 μL del paso 3) a un nuevo tubo con tapón de rosca de 1,5 mL bien etiquetado que contenga ~250 μL de perlas de silicato de circonio de 0,1 mm.
2. Bead batió el lisado a 6,5 m/s durante 45 s con 2 min de descanso entre carreras. Repita para un total de tres ciclos de batido de cuentas.
3. Centrifugar a velocidad máxima (≥ 12.000 x g) durante 2 min y transferir 150 μL del sobrenadante a un nuevo tubo bien marcado. Tenga cuidado de no transferir cuentas o desechos de celdas.
4. Deje que las perlas magnéticas de limpieza se equilibren a temperatura ambiente durante 30 minutos y se agiten a fondo para garantizar una resuspensión completa antes de su uso.
5. Agregue 180 μL (1,2 veces el volumen) de perlas magnéticas de limpieza y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
6. Coloque en una rejilla magnética y espere a que la solución se aclare durante ~ 2 minutos. Con una pipeta P200, deseche con cuidado el sobrenadante sin alterar las perlas magnéticas.
7. Con el tubo todavía en la rejilla magnética, agregue 500 μL de etanol al 70 % (v/v) recién preparado, dispensando a lo largo de la pared del tubo opuesta a las perlas magnéticas. Espere 30 s.
8. Repita los pasos 4.5. - 4.7. para un total de dos lavados. Al final del último lavado, elimine el etanol residual con una pipeta P10. Seque las cuentas brevemente durante ~ 2 min.
9. Inmediatamente después de que el pellet de perla se vuelva opaco, retire el tubo de la rejilla magnética y vuelva a suspender en 20 μL de Tampón Tris de bajo EDTA. No permita que las cuentas se sequen y agrieten.
10. Mezcle mediante pipeteo o vórtice para asegurarse de que todas las perlas estén en solución. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
11. Coloque en una rejilla magnética y espere a que la solución se aclare durante ~ 2 minutos. Transfiera el ADN eluido a un nuevo tubo bien marcado para su análisis posterior. Aspire <20 μL de ADN extraído para evitar el arrastre de perlas magnéticas.

5. Enumeración qPCR de ADN micobacteriano

1. Para cuantificar el ADN micobacteriano mediante una PCR cuantitativa dirigida a 99 nucleótidos del atpE micobacteriano (Rv1305), ensamble una mezcla de reacción de 10 μL por muestra en hielo que contenga 5 μL de mezcla maestra de sonda universal (2x), 0,4 μL de cebador directo (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGGGG-3', 10 μM) y cebador inverso (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10 μM), 0,2 μL de sonda TaqMan (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGGGGCGA-MGB-3', 10 μM), 2 μL de molde de ADN y 2 μL de agua libre de nucleasas (Tabla 3).
2. Ejecute la reacción utilizando las siguientes condiciones de ciclo térmico: desnaturalización inicial a 95 °C durante 60 s, seguida de 35 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 30 s (con una captura aquí, utilizando una velocidad de rampa de 2,11 °C/s; Tabla 4).
   NOTA: En este caso, la qPCR se realizó utilizando un ensayo TaqMan con sonda marcada con VIC en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 3,
3. Ejecute todas las muestras, estándares y controles por triplicado técnico. Genere curvas estándar utilizando diluciones en serie de ADN purificado de M . tuberculosis . Realice análisis de cuantificación relativa utilizando software de análisis.
4. Exporte los valores de cuantificación relativos resultantes a formato CSV y visualícelos con R Studio (versión 2024.09.1+394) para generar diagramas de caja que comparen los rendimientos de ADN entre los métodos de extracción.

Results

Probamos el protocolo de extracción de ADN en muestras cultivadas de M. tuberculosis y esputo enriquecido con M. tuberculosis (n = 3 para cada condición). Utilizando cultivo de M. tuberculosis H37Rv mc² 7901, estandarizamos la entrada a 8,4 x 10⁶ células por 50 μL, equivalente a 1 mL de un cultivo MGIT a 200 GU. Para los experimentos de esputo, añadimos 1 mL de esputo agrupado de individuos con afecciones respiratorias no tuberculosas (obtenido comercialmente) con dos concentraciones...

Discussion

En este trabajo, presentamos un protocolo robusto y validado para la extracción de ADN de M. tuberculosis de alta calidad mediante el batido de perlas con limpieza magnética de perlas para aplicaciones moleculares y NGS posteriores.

El método ofrece varias ventajas sobre los protocolos existentes de extracción de ADN de M. tuberculosis . Mientras que la extracción tradicional de fenol-cloroformo suele durar varios días e introduce productos q...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perlas de silicato de circonio de 0,1 mm	Productos Biospec	11079101z	Perlas utilizadas para el paso de batido de perlas para lisar células micobacterianas
Perlas AMPure XP	Beckman Coulter	Referencia A63880	Perlas magnéticas para la limpieza del ADN después de la lisis
EDTA (0,5 M, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientific	AM9260G	Componentes de tampón Triton/Low EDTA personalizados
Fastprep 24	MPbio, Estados Unidos	116004500	Equipo para el batido de talones a 6,5 m/s
Imprimación hacia adelante	Thermo Fisher Scientific	Síntesis personalizada	Secuencia de cebadores: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O (agua, grado de biología molecular)	Thermo Fisher Scientific	BP2819-1	Componentes de tampón Triton/Low EDTA personalizados
Sonda universal Luna	Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra	M3004	Reactivo qPCR para el recuento de ADN micobacteriano
MycoPrep Kit	BD	SKU/REF 240863	Digestión de muestras BD MycoPrep para el procesamiento de esputo NALC-NaOH
NaCl (cloruro de sodio, solución 5M)	Thermo Fisher Scientific	AM9759	Componentes de tampón Triton/Low EDTA personalizados
PBS	Millipore Sigma	P2272	Procesamiento de esputo
Imprimación inversa	Thermo Fisher Scientific	Síntesis personalizada	Secuencia de cebadores: GTTTACGGCGTGGACTACCA
Sonda TaqMan	Thermo Fisher Scientific	Síntesis personalizada	Secuencia de sonda: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
Tris-HCl (1 M, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientific	AM9855G	Componentes de tampón Triton/Low EDTA personalizados
Tritón X-100	Thermo Fisher Scientific	28314	Componentes de tampón Triton/Low EDTA personalizados