Este protocolo muestra que el batido de perlas combinado con la purificación de perlas de captura de ADN proporciona un método rápido y consistente para extraer ADN de muestras de Mycobacterium tuberculosis , lo que lo convierte en una opción efectiva para aplicaciones de secuenciación de próxima generación.
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Artículo de método
Extracción de ADN micobacteriano mediante batido de perlas en tampón personalizado seguido de un flujo de trabajo NGS
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La tuberculosis es una enfermedad mortal, y la aparición de resistencia a los antibióticos en la bacteria agente causal, Mycobacterium tuberculosis, empeora los resultados del tratamiento. Se necesita una identificación precisa y rápida de la resistencia a los medicamentos mediante tecnologías de secuenciación para mejorar los resultados de los pacientes con tuberculosis a través de regímenes terapéuticos personalizados. El método de extracción de ADN es fundamental para los ensayos moleculares posteriores y se complica por la dureza de la pared celular de Mycobacterium, la baja carga bacilar de muchas muestras clínicas y la complejidad de la matriz de esputo. Existen numerosos métodos de extracción de ADN para M . tuberculosis reportados, pero actualmente no existe un estándar de oro. Además, se ha demostrado que pocos de estos métodos funcionan de manera consistente, y muchos no son adecuados para entornos de bajos recursos y alta carga de tuberculosis. En consecuencia, los laboratorios introducen con frecuencia sus propias modificaciones en los procedimientos, lo que da lugar a una variabilidad significativa del método. Aquí, presentamos un protocolo rentable, rápido y estandarizado para la extracción de ADN micobacteriano tanto de esputo clínico como de cultivo que produce ADN adecuado para qPCR, y que debe considerarse para su uso en laboratorios de diagnóstico clínico.
Introducción
La extracción de ADN de alta calidad de M. tuberculosis es necesaria para la detección de la tuberculosis (TB) resistente a los medicamentos mediante la secuenciación dirigida de próxima generación (NGS) y la secuenciación del genoma completo (WGS), pero a menudo se pasa por alto. Desarrollamos un protocolo estandarizado para proporcionar ADN consistente y de alta calidad para aplicaciones clínicas de NGS, incluidos los enfoques de NGS dirigidos como Deeplex-MycTB (GenoScreen) y la secuenciación del genoma completo, que ahora son recomendados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para el diagnóstico de la tuberculosis....
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Protocolo
Este estudio se llevó a cabo en la Universidad de California en San Francisco (UCSF) bajo la aprobación del Comité Institucional de Bioseguridad (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) y sigue las pautas de ética de investigación de la UCSF. Obtuvimos muestras de esputo remanente recolectadas por Discovery Life Sciences bajo un protocolo de Renuncia de Consentimiento aprobado por el IRB de personas con afecciones respiratorias no relacionadas con la tuberculosis.
1. Preparación de tampones
- Tampón Triton personalizado (Tabla 1): Para preparar 100 mL de tampón Triton personalizado, comience combinando 2 mL de....
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Resultados
Probamos el protocolo de extracción de ADN en muestras cultivadas de M. tuberculosis y esputo enriquecido con M. tuberculosis (n = 3 para cada condición). Utilizando cultivo de M. tuberculosis H37Rv mc² 7901, estandarizamos la entrada a 8,4 x 106 células por 50 μL, equivalente a 1 mL de un cultivo MGIT a 200 GU. Para los experimentos de esputo, añadimos 1 mL de esputo agrupado de individuos con afecciones respiratorias no tuberculosas (obtenido comercialmente) con dos concentraciones.......
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Discusión
En este trabajo, presentamos un protocolo robusto y validado para la extracción de ADN de M. tuberculosis de alta calidad mediante el batido de perlas con limpieza magnética de perlas para aplicaciones moleculares y NGS posteriores.
El método ofrece varias ventajas sobre los protocolos existentes de extracción de ADN de M. tuberculosis . Mientras que la extracción tradicional de fenol-cloroformo suele durar varios días e introduce productos q.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
R01AI153213 Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID, por sus siglas en inglés).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Perlas de silicato de circonio de 0,1 mm | Productos Biospec | 11079101z | Perlas utilizadas para el paso de batido de perlas para lisar células micobacterianas |
| Perlas AMPure XP | Beckman Coulter | Referencia A63880 | Perlas magnéticas para la limpieza del ADN después de la lisis |
| EDTA (0,5 M, pH 8,0) | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | Componentes de tampón Triton/Low EDTA personalizados |
| Fastprep 24 | MPbio, Estados Unidos | 116004500 | Equipo para el batido de talones a 6,5 m/s |
| Imprimación hacia adelante | Thermo Fisher Scientific | Síntesis personalizada | Secuencia de cebadores: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG |
| H2O (agua, grado de biología molecular) | Thermo Fisher Scientific | BP2819-1 | Componentes de tampón Triton/Low EDTA personalizados |
| Sonda universal Luna | Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra | M3004 | Reactivo qPCR para el recuento de ADN micobacteriano |
| MycoPrep Kit | BD | SKU/REF 240863 | Digestión de muestras BD MycoPrep para el procesamiento de esputo NALC-NaOH |
| NaCl (cloruro de sodio, solución 5M) | Thermo Fisher Scientific | AM9759 | Componentes de tampón Triton/Low EDTA personalizados |
| PBS | Millipore Sigma | P2272 | Procesamiento de esputo |
| Imprimación inversa | Thermo Fisher Scientific | Síntesis personalizada | Secuencia de cebadores: GTTTACGGCGTGGACTACCA |
| Sonda TaqMan | Thermo Fisher Scientific | Síntesis personalizada | Secuencia de sonda: AGGAGGAACACCGGTGGCGA |
| Tris-HCl (1 M, pH 8,0) | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | Componentes de tampón Triton/Low EDTA personalizados |
| Tritón X-100 | Thermo Fisher Scientific | 28314 | Componentes de tampón Triton/Low EDTA personalizados |
Referencias
- Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
- George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform.
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Reimpresiones y permisos
