Trasplante ortotópico de extremidades delanteras de rata

Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo para demostrar la viabilidad microquirúrgica del trasplante de extremidades anteriores de rata. Este modelo puede servir como una importante plataforma traslacional para la investigación de VCA.

Resumen

El alotrasplante compuesto vascularizado (VCA, por sus siglas en inglés) implica el trasplante de múltiples tipos de tejidos, incluidos piel, músculos, huesos y nervios, lo que ofrece una opción reconstructiva prometedora para pacientes con lesiones traumáticas graves o desfiguraciones. A pesar de su potencial transformador, la VCA se ha enfrentado a importantes desafíos, como el rechazo del injerto, las complicaciones de la inmunosupresión crónica y las complejidades de la recuperación neuromuscular.

Utilizamos un modelo de extremidad delantera de rata como una plataforma rentable y anatómicamente relevante para abordar estos desafíos. La extremidad delantera de la rata refleja de cerca la anatomía de la extremidad humana, lo que mejora el impacto traslacional de nuestros hallazgos. Estudios previos han validado este modelo para medir de forma fiable y reproducible la recuperación funcional, estableciéndolo así como una herramienta clave para evaluar la trayectoria de rechazo de los injertos de extremidades anteriores.

Además, el modelo ofrece una valiosa oportunidad para explorar enfoques terapéuticos innovadores y sirve como una buena plataforma traslacional para nuevas técnicas de preservación. A través de una mayor investigación de este modelo, nuestro objetivo es profundizar nuestra comprensión de los mecanismos detrás del rechazo del injerto y la recuperación neuromuscular. En última instancia, este trabajo se esfuerza por allanar el camino para mejorar los resultados clínicos de la VCA, abordando tanto las limitaciones actuales como los desafíos futuros en la medicina de trasplantes.

Introducción

El alotrasplante compuesto vascularizado (VCA, por sus siglas en inglés) es un procedimiento que cambia la vida para reconstruir defectos tisulares graves. VCA se refiere al trasplante de un tejido compuesto que consta de piel, músculos, huesos, tejido conectivo, vasos sanguíneos y nervios. Un mayor refinamiento y exploración de las técnicas de VCA beneficiaría profundamente a los pacientes que sufren lesiones traumáticas o desfiguraciones¹. Sin embargo, su aplicación más amplia se ve desafiada por obstáculos continuos como el rechazo del injerto, las complicaciones de la inmunosupresión a largo plazo, la recuperación neuromuscular y la logística peritrasplante.

El modelo de extremidad anterior de rata ha surgido como la opción preferida para los estudios de VCA debido a su costo-efectividad y su gran semejanza con las características anatómicas y neuromusculares humanas ^2,3. Nuestro trabajo previo ha demostrado que este modelo proporciona un medio fiable y reproducible para evaluar la recuperación funcional conductual⁴. En este estudio, presentamos una guía detallada, paso a paso, de las técnicas microquirúrgicas esenciales requeridas para este modelo.

A medida que la investigación de VCA continúa evolucionando, el modelo de extremidad delantera de rata permitirá la investigación mecanicista del proceso de rechazo, la regeneración nerviosa y la recuperación funcional neuromuscular. Los investigadores podrían explorar nuevas técnicas de preservación, evaluar la eficacia de los métodos de perfusión mecánica y probar terapias inmunomoduladoras emergentes, que pueden ayudar a reducir la dependencia actual de la inmunosupresión a largo plazo.

Protocolo

Los procedimientos quirúrgicos se llevaron a cabo bajo los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (RA18M74) de la Universidad Johns Hopkins de acuerdo con las pautas establecidas por los Institutos Nacionales de Salud y la Asociación Americana para la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio.

1. Procedimiento del donante (Figura 1)

1. Realizar la inducción de la anestesia mediante inhalación de isoflurano a una concentración del 5% y mantener al 1% durante todo el procedimiento. Comience el procedimiento después de confirmar el nivel preciso de anestesia mediante un pellizco en los dedos de los pies.
2. Haga una incisión circunferencial aproximadamente 1 cm por encima del codo. Divida la piel y exponga el tejido subcutáneo superficial subyacente sin dañarlo (Figura 1A).
3. Diseccionar el tejido/fascia subcutánea, cauterizar todos los vasos superficiales y hacer transectos. Posteriormente, se expondrán el deltoides, parte del pectoral mayor, y el tríceps braquial.
4. Diseccionar sin rodeos debajo del músculo pectoral mayor, revelando los vasos braquiales, así como el nervio mediano y cubital (Figura 1B).
5. Cauterizar la vena superficial en el músculo deltoides y hacer un transecto proximal, luego seccionar el músculo deltoides perpendicular a la orientación de la fibra muscular. Después, disecciona y secciona el pectoral mayor y menor, revelando la arteria axilar, la vena y el nervio. (Figura 1C).
6. Transecte el nervio mediano, cubital y radial en su extremo proximal (justo después de la división), conservando la mayor longitud posible.
7. Diseccionar y liberar la arteria y la vena braquial.
8. Atraviesa el bíceps braquial, el tríceps braquial y el músculo dorsal ancho. Asegúrese de que el húmero esté correctamente expuesto al finalizar la disección.
9. Utilice una pinza de rongeur para seccionar el hueso distal a la tuberosidad deltoides del húmero.
10. Revise suavemente la luz de la arteria y la vena braquial (Figura 1C). Enjuague el injerto con solución salina heparinizada de 6 mL.
11. Monte el manguito de poliimida en ambas arterias braquiales y vena, respectivamente (Figura 1D).
12. Envuelva el injerto con una gasa de algodón húmeda y guárdelo a 4 °C.
13. Eutanasiar a la rata donante mediante una sobredosis de anestésico inhalante (isoflurano). Una vez que no responda por completo a un pellizco en el dedo del pie, realice una toracotomía y extirpe el corazón.

2. Procedimiento del destinatario (Figura 2)

1. Realizar la inducción de la anestesia mediante inhalación de isoflurano a una concentración del 5% y mantener al 1% durante todo el procedimiento. Confirme el estado de la anestesia mediante un pellizco en los dedos de los pies.
2. Haga una incisión circunferencial aproximadamente 1-2 cm por encima del codo.
3. Diseccionar los vasos subcutáneos y cauterizar los vasos más grandes para exponer el deltoides, parte del pectoral mayor y el músculo tríceps braquial.
4. Realice una disección roma debajo del músculo pectoral mayor para revelar los vasos braquiales, así como el nervio mediano y cubital.
5. Seccionar el deltoides y parte del músculo pectoral mayor y menor en su extremo distal, exponiendo los vasos braquiales, los nervios mediano y cubital (Figura 2A).
6. Diseccionar y seccionar el nervio mediano y cubital en su extremo distal. Ligar todas las ramas vasculares (Figura 2B).
7. Transecte el bíceps braquial, el tríceps braquial y el músculo dorsal ancho para exponer el húmero. Cauterice cuidadosamente cualquier sangrado de los músculos seccionados.
8. Transecto el húmero en la tuberosidad deltoidea. Use cera de hueso para sellar la cavidad de la médula.
9. Use una varilla intramedular para volver a conectar la cavidad de la médula ósea del donante y del receptor, luego use cera ósea para sellar la conexión. Suturar el músculo tríceps braquial con una sutura absorbible 6-0, creando así una plataforma para la anastomosis de los vasos.
10. Realizar neurorrafia epiperineural con sutura 10-0 interrumpida del nervio radial.
11. Realizar la anastomosis vascular mediante una técnica de manguito sin sutura (Figura 2C).
12. Realizar neurorrafia epiperineural con suturas 10-0 interrumpidas para reconectar los nervios mediano y cubital (Figura 2D).
13. Vuelva a conectar el deltoides y el músculo pectoral mayor usando suturas interrumpidas.
14. Cierre la herida con sutura 4-0 no absorbible.
15. Administrar solución salina tibia y estéril al 2% del peso corporal por vía subcutánea al final de la cirugía.
16. Observe al animal durante al menos 4 horas bajo una lámpara de calentamiento para su recuperación. Devuélvalo a la instalación de alojamiento de animales una vez que esté alerta, pueda ponerse de pie, demostrar un movimiento coordinado y obtener agua y comida de forma independiente.

3. Tratamiento a largo plazo después del trasplante

1. Monitoree a los animales todos los días para detectar signos de dolor y angustia como se define a continuación.
   1. Comprueba si hay anorexia indicada por la ausencia de heces en la jaula.
   2. Compruebe si el animal no bebe agua, lo que provoca una deshidratación evidenciada por la carpa de la piel.
   3. Verifique si el animal está encorvado, no está dispuesto a moverse, si prefiere una extremidad o si protege el sitio de la incisión.
   4. Compruebe si el animal no se acicala, reflejando un pelaje con volantes o sucio.
   5. Compruebe si el animal lame/araña en exceso. Revise si hay enrojecimiento e hinchazón en el sitio de la incisión y automutilación.
   6. Compruebe si hay comportamiento agresivo, especialmente cuando intente levantar al animal.
   7. Verifique si el animal está jadeando, tiene dificultad para respirar y tiene secreción nasal/ocular de color marrón rojizo.
   8. Revisa si hay sepsis.
2. Retirar las suturas a los 14 días postoperatorio.
3. Administrar una segunda dosis de buprenorfinaSR (dosis en ratas: 1,0 mg/kg SC) en el día 2 postoperatorio (POD2; 48 h después de la dosis inicial).
4. Iniciar una evaluación funcional semanal en la semana 4 post-trasplante.
   1. Brevemente, bajo anestesia general, fije la extremidad delantera del animal en una abducción de 90°. Coloque dos electrodos de aguja a 1 mm de distancia en la axila cerca de la inserción del pectoral mayor en el húmero.
   2. Estimular el nervio mediano proximal percutáneamente a 10 V para inducir una contracción tetánica máxima de los flexores.
   3. Una vez que la flexión digital completa forme un agarre, coloque un lazo de metal conectado a un medidor de fuerza en la palma y asegúrelo dentro de los dedos flexionados. Luego, tire del medidor de fuerza hasta que se pierda el agarre, registrando la fuerza máxima (en Newtons).

Resultados

La supervivencia del injerto se puede monitorear y determinar a través de la observación macroscópica. En la Figura 3 se muestran imágenes representativas del seguimiento a corto plazo (POD7) y a largo plazo (POD120). El injerto pudo recuperarse sin signos aparentes de necrosis. Los datos de supervivencia se muestran en la Figura 4. Tanto las muestras de piel como las de músculo se recolectan en el punto final designado. Las imágenes histológicas representativas...

Discusión

El trasplante ortotópico de extremidades anteriores en ratas es un modelo comúnmente utilizado en el trasplante reconstructivo experimental, ya que no solo contiene tejidos compuestos vascularizados, sino que también permite evaluar la recuperación funcional. Una técnica de sutura convencional para la anastomosis vascular es muy compleja y exige habilidades microquirúrgicas avanzadas que requieren años de formación microquirúrgica. Para reducir en gran medida el tiempo y los costos, se a...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10-0 Micro Sutura No Estéril	AROSurgical	TK-107038
4-0 Sharpoint Nylon Negro	Esutures	A1667N
4-0 Sharpoint Polysyn Taper	esutures	G214N
Jeringas de 5 mL	MDC	2045
6-0 seda	Fisher Scientific	NC9742105
ABB-22 V Doble Micro Recipiente	Sy T	00480
B-1 V Abrazadera de microrecipiente simple	S & T	00462
BD Quincke Esuturas de aguja espinal		405073
Castroviejo Micro Portaagujas	F.S.T	12061-02
Medidor de fuerza Chatilon DFE II	Ametek	DFE II series
Tienda de suministros JH con	punta de algodón	100252
Tijeras finas - Carburo de tungsteno	FST	14569-09
Pinzas	S & T	FRS-15 RM-8
Esponjas de gasa	Fisher Scientific	22-362178
Hemostáticos Halsted-Mosquito	F.S.T	13009-12
Heparina	JHH Pharmacy	NDC 63323-540-05
Catéter intravenoso radiopaco 24 G	esutures	SMTH5053
Joyeros Pinzas de coagulación bipolares, acero inoxidable	ASSI	103000BPS03
Tijeras de resorte Vannas con mango redondo	FST	15400-12
Pinzas especiales	S & Dilatadores	FRAS-15 RM-8
- Instrumentos equilibrados	F.S.T	18602-15