Para comprender mejor la respuesta de la lesión condrocita a una sobrecarga mecánica del cartílago, el protocolo describe el desarrollo de un modelo de impacto de cartílago ex vivo que fue subletal durante 24 h.
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Artículo de método
In vitro Modelo de impacto para generar lesión subletal por condrocitos en explantes de cartílago bovino
En este artículo
Resumen
Resumen
La osteoartritis postraumática (PTOA) es una enfermedad articular progresiva prevalente, degenerativa y dolorosa que generalmente surge después de un traumatismo articular significativo y afecta a más de 6 millones de estadounidenses. El traumatismo del cartílago inducido por el impacto da lugar a una respuesta a la lesión de los condrocitos que culmina en el PTOA. Es necesario comprender los eventos moleculares asociados con la lesión de los condrocitos para desarrollar terapias que prevengan el PTOA o retrasen su progresión. Para facilitar esto, se desarrolló un modelo de impacto de cartílago ex vivo que fue subletal durante 24 h. Los explantes osteocondrales se cosecharon de articulaciones metacarpofalángicas bovinas, y se utilizó una torre de caída para entregar cargas de impacto a los explantes. Para garantizar que la tensión y el impacto se aplicaran de manera relativamente uniforme al cartílago articular, los explantes se colocaron con la superficie ósea hacia arriba y el hueso se impactó desde arriba. Se aplicaron diferentes cargas a los explantes desde alturas de carro de 4.0 cm, 4.5 cm y 5.0 cm, resultando en tensiones máximas promedio de 10.87 ± 1.84 MPa, 11.69 ± 0.67 MPa y 12.98 ± 0.75 MPa, respectivamente. El estudio analizó el papel de la presencia de hueso subcondral en el cartílago durante el cultivo posterior al impacto y el efecto del uso de un soporte ajustado o suelto durante el impacto, evaluando la viabilidad celular y la apoptosis. El cartílago articular impactado desde 4,5 cm, combinado con un soporte ajustado y la extracción ósea inmediata, proporcionó el modelo óptimo para inducir la lesión del cartílago con una muerte celular mínima a las 24 h después del impacto.
Introducción
La osteoartritis postraumática (PTOA, por sus siglas en inglés) es una enfermedad debilitante que afecta a más de 5 millones de adultos enlos Estados Unidos. Un solo impacto traumático en el cartílago puede desencadenar una respuesta a la lesión de los condrocitos, lo que provoca síntomas de aparición temprana y una lucha de por vida contra el dolor y la disfunción articular. El cartílago tiene poca o ninguna capacidad de reparación intrínseca y, por lo tanto, existe una necesidad insatisfecha de desarrollar terapias para modificar la progresión de la enfermedad3. Debido a que el PTOA se correlaciona con un solo evento traumático claramente definido, existe la oportunidad de intervenir antes de que la enfermedad progrese. Sin embargo, el desarrollo de estos tratamientos se ve obstaculizado por la falta de conocimiento sobre la señalización molecular que regula la respuesta a la lesión condrocitosa y conduce a la artrosis postraumática 2,3,4. Una mejor comprensión de los eventos moleculares después de la lesión de condrocitos podría ayudar a diseñar nuevos tratamientos terapéuticos que rescaten la respuesta de la lesión de condrocitos y prevengan o retrasen el desarrollo de PTOA 2,5,6.
Para comprender mejor la señalización molecular de la lesión de los condrocitos, investigaciones anteriores han utilizado torres de caída o dispositivos similares que impactan mecánicamente los explantes de cartílago para que se inicie una respuesta a la lesión. Estos estudios han tratado de caracterizar muchos aspectos de esta respuesta, incluyendo cambios en las propiedades mecánicas y la estructura 7,8, daño de la matriz y síntesis 6,9,10,11, disfunción mitocondrial 12,13,14,15, vías de transporte de iones 16,17,18,19, y expresión génica 9,11,20,21,22,23. Sin embargo, en muchos de estos estudios, la viabilidad celular no fue reportada o estaba comprometida, con un 50% o menos de viabilidad celular en algunos estudios 24,25,26. Los efectos de confusión de la baja viabilidad celular pueden dificultar el estudio de la respuesta a la lesión. La muerte de los condrocitos que sigue inmediatamente a un traumatismo articular es irreversible, pero las terapias que tratan la lesión de los condrocitos mitigan el PTOA27 posterior. Con el fin de identificar los cambios moleculares que están asociados con la lesión de los condrocitos y no con una pérdida de células viables, es necesario un modelo de impacto del cartílago que mantenga la viabilidad de los condrocitos durante un período de tiempo. Además, un impacto de cartílago que genere una respuesta a la lesión de los condrocitos que sea relativamente uniforme en todo el tejido del cartílago proporcionaría los resultados más consistentes en el análisis del comportamiento celular.
El objetivo del estudio fue desarrollar y caracterizar un modelo de lesión por impacto ex vivo rentable para el cartílago articular que conserve la capacidad de estudiar las vías de señalización inherentes a la respuesta a la lesión aguda del cartílago. Además, este modelo podría utilizarse para evaluar posibles tratamientos para rescatar la respuesta a la lesión. Para lograr esto, primero desarrollamos una técnica estéril para recolectar explantes de cartílago de articulaciones metacarpofalángicas bovinas de animales esqueléticamente maduros utilizando una broca de perforación con punta de diamante montada en una taladradora. Las articulaciones metacarpofalángicas son descartadas por el matadero cuando los animales se procesan para el consumo alimentario, lo que hace que esta articulación sea una fuente de tejido fácilmente accesible y económica. A continuación, establecimos un modelo de lesión por impacto en el que la muestra osteocondral se colocó en un soporte debajo de un dispositivo de torre de caída. En este modelo, los especímenes osteocondrales se colocaron con la superficie articular hacia abajo sobre una superficie de acero inoxidable pulido a espejo # 8, y el hueso se sometió a un impacto desde arriba, entregando una carga relativamente uniforme al tejido cartilaginoso. Se determinaron los parámetros de impacto que mantienen la viabilidad de los condrocitos durante 24 h después del impacto, mientras que aún desencadenan una respuesta de lesión molecular apoptótica. Se evaluaron los soportes que permitían diferentes cantidades de movimiento lateral de la muestra durante el impacto por su efecto sobre la viabilidad celular y la apoptosis; Finalmente, se evaluó el efecto de la remoción de cartílago del hueso subcondral después del impacto.
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Protocolo
El uso de extremidades bovinas obtenidas de un matadero local no requería aprobación ética, ya que los tejidos se recolectaban post mortem de animales procesados para el consumo alimentario.
1. Cosecha de explantes osteocondrales
- Esterilice los siguientes materiales utilizando un autoclave antes de la cosecha del explante: solución salina tamponada con fosfato (PBS; aproximadamente 1 L por junta), broca de extracción de núcleos, adaptador giratorio de agua, una botella de lavado esterilizable en autoclave, un mango de bisturí, dos pinzas y una hoja de sierra de autopsia.
- Coloque la campana de cultivo de tejidos con taladro y un tornillo de banco dentro de un recipiente para contener PBS. Ensamble la broca de extracción de núcleos y el adaptador giratorio en la prensa de perforación y conecte la boquilla del adaptador giratorio con una manguera a una garrafa llena de PBS esterilizado. Ensamble la sierra de autopsia y colóquela dentro del capó (Figura 1A-B).
- Extienda las almohadillas desechables en una pila en la campana de cultivo de tejidos, una para cada articulación.
NOTA: Las almohadillas absorben el PBS y el líquido sinovial que puede gotear al abrir la articulación. El apilamiento de varias almohadillas inferiores permite una fácil extracción de la capa superior cuando se humedece demasiado, proporcionando un espacio de trabajo limpio y seco durante todo el procedimiento. - Prepare un tubo de ensayo de 50 mL que contenga un 70% de etanol y otro tubo de ensayo de 50 mL que contenga 0,13% v/v de betadine en PBS, y colóquelos en la campana. Coloque las pinzas y el mango del bisturí en el tubo de ensayo de etanol para mantener la esterilidad durante la manipulación de tejidos y coloque una placa de cultivo celular estéril de 6 pocillos en la parte posterior de la campana.
- Prepare 3 mL de medio de cultivo celular por muestra anticipada. Los medios de cultivo consisten en medio de Eagle modificado (DMEM) con 0,9 mM de piruvato de sodio, insulina, transferrina y selenio (ITS), 50 mg/mL de ácido L-ascórbico, aminoácidos no esenciales del medio esencial mínimo (MEM), penicilina, estreptomicina y anfotericina B. Agregue ácido L-ascórbico e ITS el día de uso28.
- Obtenga las patas delanteras bovinas de animales esqueléticamente maduros de un matadero local dentro de las 6 h posteriores al sacrificio. Mantenga el pañuelo en hielo durante el transporte.
- Aísle la articulación metacarpofalángica retirando la pezuña con una sierra de cinta para carne sin abrir la cápsula articular. Retire la piel con hojas de bisturí # 22 sin perforar la cápsula articular.
- Enjuague bien cada pierna fuera del gabinete de bioseguridad con agua fría para eliminar la suciedad y cúbrala con betadine para desinfectar.
- Dentro de la campana de cultivo de tejidos, abra la cápsula articular con una nueva hoja de bisturí #22. Aísle la articulación distal y mantenga el cartílago articular hidratado con PBS de una botella de lavado (Figura 1C). Cubrir el cartílago articular con una gasa estéril empapada con PBS para mantener la hidratación.
- Aísle aún más la articulación metacarpofalángica distal cortando el metatarso con la sierra de autopsia (Figura 1D). Coloque la articulación distal en el tornillo de banco con el cartílago cubierto hacia arriba y apriétela hasta que esté segura. Durante todo el proceso, humedezca la gasa sobre el cartílago regularmente con PBS.
- Doble la gasa lejos de un cóndilo y ajuste la posición del tornillo de banco de modo que la broca de extracción esté por encima de la región más plana de la superficie articular (Figura 1E).
- Abra la válvula de garrafa para permitir que el PBS fluya a través de la broca de extracción de núcleos. Utilice una botella de lavado para hidratar continuamente el tejido con PBS y enfriar las muestras durante la perforación.
NOTA: El PBS de la garrafa y la botella de lavado tiene un efecto de enfriamiento durante el proceso de extracción de núcleos. - Núcleo del cóndilo lentamente, presionando la broca en la superficie del cóndilo. Libere la presión con frecuencia y permita que el calor se disipe. Continúe hasta que la profundidad de extracción de muestras sea de aproximadamente 2 mm en el hueso subcondral. Repita para cada lado (Figura 1E).
NOTA: Los signos de sobrecalentamiento incluyen evaporación rápida del líquido o olor a quemado. - Use la sierra de autopsia para liberar los núcleos osteocondrales cortando el hueso paralelo a la superficie del cartílago articular, continuando exprimiendo PBS desde la botella de lavado hasta la interfaz de la sierra de autopsia y el hueso osteocondral mientras corta. Durante este paso, mantenga la gasa humedecida en la superficie del cartílago articular para evitar la deshidratación.
- Almacene los núcleos osteocondrales (Figura 1F) en una solución diluida de betadine (ver paso 1.3) hasta que se hayan procesado todas las uniones.
- Enjuague los núcleos osteocondrales en PBS y transfiera las muestras a pocillos individuales de una placa estéril de 6 pocillos que contenga 3 mL de medios de cultivo precalentados (DMEM con 0,9 mM de piruvato de sodio, insulina-transferrina-selenio (ITS), 50 mg/mL de ácido L-ascórbico, aminoácidos no esenciales, penicilina, estreptomicina y anfotericina B)28. Mantener las muestras en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2 hasta el procedimiento de impacto del día siguiente.
2. Impacto del explante osteocondral
- Fabrique un soporte de impacto de acero inoxidable con una superficie de impacto pulida a espejo (Figura complementaria 1 y Figura complementaria 2) y perfore los orificios correspondientes en la placa base de la torre de caída (Figura complementaria 3).
- Esterilice los siguientes materiales con un autoclave antes del procedimiento de impacto: cabezal de impacto esférico de acero inoxidable de 15 mm de diámetro, soporte de acero inoxidable con superficie de impacto pulida a espejo, 4 tornillos 6/32, 4 arandelas, pinzas.
- Coloque una torre de caída que había sido previamente diseñada y fabricada29 en un gabinete de bioseguridad. Para este estudio, se utilizó una torre de caída con una cabeza de impacto esférica de 15 mm de diámetro montada en un carro equipado con una célula de carga y un acelerómetro (Figura 2A), con una masa total del carro de 358,4 g.
- Fije el soporte a la placa base de la torre de caída con cuatro tornillos esterilizados en autoclave (Figura 2B). En este estudio se probaron soportes con aberturas circulares de 8,7 mm y 9,1 mm de diámetro.
- Coloque un núcleo osteocondral en el soporte (Figura complementaria 1, Figura complementaria 2, Figura complementaria 3) debajo de la cabeza del impactador de la torre de caída con el hueso hacia arriba.
NOTA: Se eligió colocar el núcleo osteocondral con el hueso hacia arriba y la superficie articular hacia abajo30 para una carga más homogénea. - Ajuste el carro de la torre de caída a la altura deseada en relación con la parte superior del hueso. Determine la altura aproximada de la torre de caída a partir de estudios piloto. En este estudio se evaluaron alturas de 4,0, 4,5 y 5,0 cm.
- Haga clic en el botón Inicio del software de adquisición de datos (Archivo de codificación suplementario 1) justo antes de soltar el carro de la torre de caída liberando el tope del husillo (Figura 2A) y permitiendo que la cabeza del impactador caiga bajo el peso de la gravedad sobre la muestra. Levante inmediatamente el carro y apóyelo en el tope del husillo.
NOTA: Durante el impacto, los datos se recogerán a 100 kHz utilizando un software de adquisición de datos conectado a un módulo de adquisición de datos, que registra las señales de una célula de carga situada entre el cabezal del impactador y el carro, así como de un acelerómetro. Si bien levantamos el carro tan pronto como sea posible después del impacto, no tiene una función antirrebote u otro mecanismo para evitar un segundo impacto. - Coloque el archivo .txt generado por el software de adquisición de datos en la misma carpeta que el código de análisis de datos de Matlab (Supplementary Coding File 2, también disponible en https://github.com/sogol-younesi/cartilage-impact-analysis) y ejecute el código de análisis de datos para filtrar los datos brutos y calcular los parámetros de impacto.
NOTA: El código de análisis de datos utiliza un grosor de cartílago de 0,563 mm para calcular la energía del impacto. Esto se determinó como el grosor promedio del cartílago tomado de > 50 ubicaciones en cada una de las cinco muestras en un estudio separado utilizando el método de aguja31 y un probador mecánico Biomomentum Mach-1. Los parámetros de impacto se calculan como se ha descrito anteriormente32. - Retire el cartílago del hueso con una hoja de bisturí # 11, según corresponda. Regrese la muestra al medio y a la incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2 hasta la obtención de imágenes al día siguiente.
NOTA: En este estudio se evaluó el efecto de la eliminación del cartílago del hueso inmediatamente después del impacto o 24 horas después del impacto.
3. Caracterización de la viabilidad celular en muestras de cartílago
- Retire el cartílago del hueso si es necesario. Corta la muestra de cartílago por la mitad con un bisturí afilado. Evite hacer múltiples cortes; Apunta a una sola incisión para asegurar un borde liso.
- Sumerja cada medio espécimen de interés en una solución que consista en 5 μM de homodímero de etidio y 2,5 μM de calcien AM en PBS. Proteger de la luz e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos para completar la tinción de muertos vivos.
- Enjuague las muestras con PBS 2x y guarde las muestras en PBS hasta la obtención de imágenes. Tome la imagen tan pronto como sea posible después de que se complete la tinción.
- Coloque la muestra de cartílago en posición vertical sobre unas gotas de PBS en una placa de microscopía para que el semicírculo completo sea visible desde la parte frontal del microscopio. Capture imágenes con un microscopio confocal invertido. Doble el cartílago ligeramente con pinzas si no puede mantenerse erguido por sí solo.
- Usando FIJI, una distribución de ImageJ con complementos incluidos33, primero convierta la imagen a 8 bits haciendo clic en Imagen > Escriba > 8 bits. A continuación, establezca el umbral en Imagen > Ajustar > umbral y haga clic en Aplicar. A continuación, realice la función Cuenca hidrográfica en Procesar > binario y ejecute Analizar partículas... en Analizar para los canales verde y rojo. Analice las imágenes capturadas a una altura z constante para cada espécimen para obtener comparaciones precisas entre grupos.
- Calcule la viabilidad celular dividiendo el número de células vivas por el número total de células de la muestra.
4. Caracterización de la apoptosis en muestras de cartílago
- Sumerja cada medio espécimen de interés en un reactivo de detección verde de caspasa-3/7 de 8 μM en PBS. Proteger de la luz e incubar a 37 °C durante 30 min.
- Lave las muestras con PBS 3x. Fije las muestras teñidas incubándolas en paraformaldehído (PFA) al 4% durante 15 min. Lavar con PBS nuevamente y almacenar en PBS hasta la obtención de imágenes. Imagen dentro de las 24 h posteriores a la tinción.
- Imagen con microscopio confocal (ver paso 3.4 arriba). Para comparaciones válidas de la intensidad de fluorescencia entre grupos, mantenga parámetros de imagen consistentes para todas las muestras, incluida la lente del objetivo, la potencia del láser de excitación, la ganancia del detector del tubo fotomultiplicador, el tamaño del orificio, el grosor del corte óptico, la velocidad de escaneo, el promedio de línea y la resolución de la imagen.
- Con la extensión FIJI de ImageJ, seleccione Valor medio de gris en el menú Analizar > establecer mediciones... .
- Utilice la herramienta Sección de polígono para delinear toda el área de la muestra que se muestra en una imagen. Realice la función Medir en el menú Analizar y registre el valor medio de gris, utilizando los mismos parámetros de procesamiento en todos los grupos.
- Utilice la herramienta Sección de polígono para seleccionar un área de la imagen que no contenga la muestra y vuelva a realizar la función Medir. Regístrelo como el valor medio de gris de fondo.
- Calcule la intensidad de fluorescencia restando el valor medio de gris de fondo del valor medio de gris de la muestra.
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Resultados
La carga de impacto mecánico a los explantes osteocondrales se aplicó utilizando una torre de caída con alturas de carro de 4,0 cm, 4,5 cm y 5,0 cm por encima del tejido (n = 3 o 4). El aumento de la altura del carro antes de que se liberara dio como resultado mayores fuerzas de impacto, tensiones máximas promedio, tasas de carga y energías de impacto (Tabla 1).
Buscamos desarrollar un modelo de lesión de cartílago ex vivo que fuera subletal durante 24 h después del i...
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Discusión
El objetivo de este estudio fue caracterizar y optimizar un modelo de impacto del cartílago que no comprometa la viabilidad celular para el estudio de eventos moleculares después de una lesión de condrocitos, con el objetivo final de desarrollar un tratamiento que rescate las células lesionadas para prevenir la progresión del PTOA. Para lograr este objetivo, se administró una carga mecánica a la porción ósea de los núcleos osteocondrales, transfiriendo la carga al tejido cartilaginoso. A...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por la subvención R21 de los NIH NIAMS AR080255. Los autores desean agradecer a Kevin Carr por aportar su experiencia en mecanizado y fabricación a este proyecto. Los autores agradecen a la carnicería de Mooresville (Mooresville, IN) por proporcionar tejido para este estudio. Los autores agradecen al personal del Centro de Microscopía Biológica de Indiana por su ayuda con la microscopía confocal.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| #11 hoja de bisturí estéril | Thermo Fisher Scientific | 10-001-823 | Retire el cartílago del hueso |
| #22 hoja de bisturí estéril | Thermo Fisher Scientific | 10-001-833 | Retire la piel de los tejidos bovinos y abra la articulación cortando los ligamentos |
| 10-1000 ul puntas de pipeta | Thermo Fisher Scientific | 02-707-411 | Medir y transferir PBS, medios de cultivo y otras soluciones |
| Etanol de 200 grados | Thermo Fisher Scientific | 03-007-647 | Se utiliza para preparar etanol al 70% como agente esterilizante para desinfectar herramientas quirúrgicas y mantener un ambiente estéril durante la preparación y el procesamiento de tejidos. |
| Tubo de centrífuga de 50 ml (estéril) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Se utiliza para almacenar medios y muestras |
| Garrafón de 5 galones | Thermo Fisher Scientific | 04-355-233 | Recipiente PBS estéril que se conecta al adaptador giratorio mediante una manguera. |
| Placa de 6 pocillos (estéril) | Thermo Fisher Scientific | 140685 | Se utiliza para almacenar temporalmente núcleos osteocondrales en un entorno estéril con medios precalentados durante la recolección, la incubación antes de los estudios de impacto y la obtención de imágenes |
| Acelerómetro | Kistler | 8743A5 | Se utiliza para medir la aceleración producida durante un |
| impacto Kit de tinción de apoptosis (CellEvent) | Thermo Fisher Scientific | C10423 | Se utiliza para detectar y visualizar células apoptóticas |
| Frascos de lavado esterilizables en autoclave | Nalgene | 2405-0500 | Llene con PBS estéril para hidratar el cartílago durante la recolección de tejidos. |
| Sierra de autopsia | Mopec | BD 810 | Elimine cualquier exceso de hueso después de abrir la articulación o extraer el núcleo osteocondral |
| Hoja de sierra de autopsia | Mopec | BD 101 | Se utiliza para cortar hueso para aislar y liberar explantes osteocondrales. |
| Betadine | Avrio Health L.P. | n/a | Se utiliza para la desinfección del exterior de las muestras bovinas antes de trasladarlas a la campana y se diluye para desinfectar las muestras osteocondrales finales. |
| Manguera transparente de 4 pies | n/a | n/a Se | utiliza para conectar la garrafa de 5 litros que contiene PBS al adaptador giratorio de la taladradora para transportar PBS. |
| Broca de perforación de núcleos | Herramientas Superhard industriales UKAM | 3EDCD7160 | Utilizado para extraer explantes osteocondrales del hueso perforando el cartílago articular y el hueso subcondral.- diámetro de la broca: 7/16" (Taladros de núcleo de diamante galvanizado) |
| Llave de media luna | McMaster Carr | 5362A1 | Utilizada para apretar la abrazadera (que mantiene la articulación en su lugar) y apretar la broca de extracción de núcleos |
| Pipetas serológicas desechables | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11 | Medición y transferencia de PBS y medios de cultivo |
| Almohadilla inferior desechable | Thermo Fisher Scientific | 23-666-062 | Se utiliza para cubrir el espacio del mostrador para absorber agua y líquidos durante la cosecha para mayor comodidad e higiene |
| Unidades de filtro de vacío desechables | Thermo Fisher Scientific | SCGP00525 | Filter PBS y otras soluciones |
| Taladro de prensa | WEN | 433TV 3.25-Inch | Aplique fuerza para perforar muestras osteocondrales- WEN 433TV 3.25-Inch Industrial Strength Drill Press |
| inclinando ángulo de inclinación Vise | WEN | TV434 | Asegura muestras osteocondrales en una posición fija en el ángulo deseado durante el proceso de extracción de núcleos. |
| Torre de caída | hecha a medida | n/a | Se utiliza para impactar las muestras |
| FIJI (ImageJ Extension) | n/a | n/a | Software utilizado para procesar y analizar imágenes de microscopía, incluida la viabilidad celular y la cuantificación de la apoptosis |
| Pinzas | Fisherbrand | 12-000-163 | Se utiliza para cortar tejido en la campana, abrir la articulación y transferir las muestras |
| Gasa (estéril) | Dukal | 6412 | Se utiliza para hidratar el cartílago articular después de abrir la cápsula articular |
| Botella de vidrio de 1 litro de medios | Sigma Aldrich | CLS13951LHTC | Se utiliza para almacenar PBS estériles |
| Guantes | Thermo Fisher Scientific | 19-130-1597D | Se utilizan para proteger al equipo de recolección |
| Insulina-Transferrina-Selenio (ITS) | Gibco | 41400-045 | Suplemento de medios |
| Software de adquisición de datos LabVIEW National | Instruments | n/a | Captura datos de la celda de carga y el acelerómetro durante las pruebas de impacto para su posterior análisis. |
| Ácido L-ascórbico | Merck | A4403 | Suplemento de medios |
| Microscopio de barrido confocal láser | Olympus | FV1000D | Se utiliza para capturar imágenes tridimensionales de alta resolución de muestras de tejido teñidas. |
| Kit de tinción de ensayo vivo y muerto | Thermo Fisher Scientific | L3224 | Se utiliza para diferenciar entre células vivas y muertas en muestras de tejido para evaluar la viabilidad celular |
| Celda de carga | Kistler | 9712B5000 | Se utiliza para medir la fuerza aplicada durante un impacto. |
| MATLAB | El programa MathWorks Inc. | n/a | |
| Sierra de cinta para carne | Skymsen | MSKLE | Quitar la pezuña del carpo de muestras bovinas |
| Micropipeta 10-100 uL | Thermo Fisher Scientific | FBE00100 | Medición y transferencia PBS y medios de cultivo |
| Medio esencial mínimo (MEM) solución de aminoácidos no esenciales | Gibco | 11140-050 | Suplemento de medios |
| Águila modificada' s Medio (DMEM) | Gibco | 10566-016 | Cultivo de explantes osteocondrales. |
| Penicilina-Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15-140-148 | Suplemento de medios |
| salina tamponada con fosfato | Thermo Fischer Scientific | BP399-20 | Utilizado para enjuagar, hidratar y enfriar tejidos para mantener condiciones fisiológicas, prevenir la deshidratación y preparar soluciones de tinción |
| Soporte de muestras en torre de caída | hecho a medida | n/a | Asegura el núcleo osteocondral durante el impacto. |
| Mango de bisturí | Thermo Fisher Scientific | 16-100-107 | Se utiliza para cortes precisos, disección de tejidos y apertura de la articulación. |
| Tornillos (añadir a cad) | Rosca 6-32 Tamaño-18-8 Tornillos de cabeza hueca de acero inoxidable | ||
| Piruvato de sodio | Gibco | 11360-070 | Suplemento de medios |
| Cabeza de impactador esférico | McMaster Carr | 9292K52 | Autoclave antes del procedimiento de impacto |
| Mascarillas quirúrgicas | Máscara de filtro | 375101 | Utilizado para proteger al equipo de recolección |
| Adaptador de giro de agua | Herramientas superduras industriales UKAM | 7035812 | Se conecta a la broca de perforación para proporcionar un flujo continuo de PBS para enfriar durante el proceso de perforación. |
Referencias
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