Method Article

Ensamblaje modular estandarizado de operones policistrónicos con clonación modular (MoClo) utilizando el kit de herramientas In-Cloning

DOI:

10.3791/68103

⸱

September 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Systems and Synthetic Biology (SSB), Wageningen University and Research, Agrotechnology and Food Sciences, 2Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 3Center for Molecular Biology of Heidelberg University (ZMBH), 4Center for Synthetic Microbiology, Philipps-University Marburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo presenta un protocolo paso a paso que demuestra cómo se puede adaptar la clonación modular (MoClo) para la clonación de operones policistrónicos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los kits de herramientas de clonación modular (MoClo) permiten el ensamblaje rápido de construcciones multigénicas. Se basan en la clonación Golden Gate, que utiliza enzimas de restricción de tipo IIS que cortan fuera de su sitio de reconocimiento. Dado que el reconocimiento y la secuencia de corte están desacoplados, los salientes creados por las enzimas de restricción de tipo IIS se pueden elegir deliberadamente, y las estrategias de clonación generalmente evitan el corte de fragmentos de ADN correctamente unidos. Esto permite ensamblajes altamente eficientes de múltiples fragmentos de ADN en una sola reacción. En MoClo, a las partes funcionales individuales del ADN, como promotores, sitios de unión ribosómica, secuencias codificantes y terminadores, así como ensamblajes de orden superior, se les asignan voladizos estandarizados, de modo que se pueden crear bibliotecas de piezas reutilizables. La mayoría de los kits de herramientas de MoClo bacterianos están diseñados para clonar unidades transcripcionales monocistrónicas y no proporcionan una ruta estructurada para el ensamblaje de operones policistrónicos. Este protocolo demuestra el ensamblaje de unidades de transcripción policistrónicas con el kit de herramientas de clonación de entrada y salida . El mismo enfoque es transferible a otros kits de herramientas de MoClo.

Introduction

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La clonación molecular, la introducción de ADN recombinante en un replicón como un plásmido, es una metodología fundamental en biología molecular. Los métodos de construcción y ensamblaje de ADN se han vuelto cada vez más sofisticados en las últimas décadas. A estas alturas, los investigadores pueden construir cromosomas sintéticos completos e incluso genomas a partir de ADNsintetizado 1. La clonación molecular tradicional a menudo se basa en estrategias de clonación ad hoc y puede ser laboriosa y costosa para grandes construcciones multigénicas2. En los últimos años, la clonación Golden Gate (GG) y los kits de herramientas de clonación modular jerárquica derivada (MoClo) 2,3 se han convertido en soluciones populares para permitir un ensamblaje de ADN rentable y en tiempo.

Las enzimas de restricción de tipo IIS son endonucleasas que reconocen una secuencia direccional (no palindrómica) y se escinden fuera de esta secuencia de reconocimiento4. Como resultado, las secuencias de voladizo creadas por la escisión no dependen del sitio de reconocimiento, sino que se pueden elegir4. Además, los fragmentos de ADN funcionales, aquí llamados 'partes', se pueden diseñar de tal manera que la escisión elimine el sitio de reconocimiento de los extremos de las partes2 que se van a unir. Las estrategias de clonación de GG aprovechan esto para permitir ensamblajes eficientes de ADN de varias partes en reacciones de un solo recipiente5. Los kits de herramientas de MoClo se basan en la clonación de GG y tienen como objetivo proporcionar una forma modular y jerárquica para el ensamblaje de construcciones multigénicas. Los voladizos utilizados para ensamblar piezas están estandarizados, lo que permite la creación de bibliotecas de piezas reutilizables e intercambiables. Los kits de herramientas MoClo se basan en plásmidos aceptores, que están diseñados para aceptar múltiples secuencias de ADN y liberar el producto ensamblado. Cada plásmido aceptor contiene dos sitios de reconocimiento de dos enzimas diferentes de tipo IIS, uno que se utiliza para aceptar la carga de ADN y el otro paraliberar ADN 3,6 ensamblado. En la Figura 1 se muestra una ilustración de ese principio para la clonación de una pieza individual, un terminador, en un plásmido aceptor de MoClo (Nivel 0). Tanto el plásmido aceptor como el inserto son cortados por la enzima de restricción BbsI, de una manera que deja voladizos compatibles y elimina los sitios de reconocimiento de BbsI. Los plásmidos correctamente ligados, por lo tanto, ya no son cortados por BbsI. El corte del plásmido resultante con la enzima SapI tipo IIS libera el fragmento previamente insertado en el siguiente paso de ensamblaje (Nivel 1).

En este protocolo, se utiliza la caja de herramientas In- and Out-Cloning MoClo7. Aquí, los plásmidos de nivel 0 contienen partes genéticas fundamentales definidas, como promotores con regiones no traducidas (UTR) 5', secuencias codificantes y terminadores con 3'UTR, la Figura 1 muestra una descripción general esquemática del Nivel 0. En el Nivel 1, se ensamblan varias piezas en una unidad de transcripción (TU), la Figura 2 muestra una descripción general esquemática de las piezas de Nivel 1 y la clonación. Clonación de entrada y salida MoClo ha sido diseñado para el ensamblaje sin cicatrices de unidades de transcripción en el Nivel 1 mediante el uso de una enzima Tipo IIS que crea voladizos de 3 nucleótidos. Esto permite que los voladizos estén completamente dentro del ráster de codones de la secuencia de codificación, utilizando los codones de inicio ATG y final TGA para el ensamblaje. Los niveles M y P se utilizan para el ensamblaje de múltiples unidades de transcripción liberadas de plásmidos de nivel 1 3,8. La Figura 3 muestra una descripción general esquemática de las partes para clonar en los niveles M y P, y el ensamblaje de un operón bicistrónico en el nivel M (un operón bicistrónico es una unidad transcripcional que expresa múltiples secuencias codificantes (CDS)). Los niveles P y M han sido diseñados para permitir ciclos iterativos de uno a otro, de modo que no existe un límite teórico en el número de piezas que se pueden ensamblar, sin embargo, esto no se describe en este protocolo, ya que el enfoque principal de este protocolo es mostrar el ensamblaje de un operón bicistrónico. Aunque no hay límite para la cantidad de piezas que se pueden ensamblar, hay un límite para el tamaño de una construcción que se puede ensamblar; se han ensamblado hasta 100.000 pb utilizando un kit MoClo9. Además, las construcciones grandes o las construcciones que contienen genes tóxicos pueden causar una carga en la célula; Para estos casos, se han publicado protocolos modificados10.

La clonación entrante y externa inicialmente no describió un esquema para el ensamblaje de unidades de transcripción policistrónicas. Los operones policistrónicos son un modo de organización génica muy común en las bacterias 11,12,13, y por lo tanto, existe un notable interés en su ensamblaje ascendente de forma modular 14. Aquí, se describe un esquema estructurado para el ensamblaje de operones policistrónicos mediante clonación de entrada y salida. El esquema presentado permite un intercambio fácil de la posición de las secuencias codificantes dentro de las unidades de transcripción policistrónicas, así como los ensamblajes que consisten en transcripción mono y policistrónica.

El siguiente protocolo paso a paso muestra el diseño y la clonación de un operón policistrónico mediante la clonación de entrada y salida. La estrategia presentada para clonar unidades de transcripción policistrónicas se puede adaptar fácilmente a otros kits de herramientas de MoClo.

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Protocol

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NOTA: Este protocolo describe el diseño y ensamblaje de un operón policistrónico a través de tres niveles del estándar In-Cloning (0, 1 y M). El operón policistrónico ensamblado aquí comienza con un promotor, seguido de un sitio de unión ribosómica (RBS), una secuencia codificante (CDS), un segundo RBS, un segundo CDS y finalmente un terminador (Figura S1). Se recomienda encarecidamente utilizar un software de clonación molecular para simular la clonación in silico, para garantizar que la estrategia de clonación diseñada sea correcta. Aquí se describe un ejemplo de ensamblaje de un promotor como una parte de Nivel 0, ensamblaje de un RBS con una secuencia de codificación y un terminador en una Unidad de Transcripción de Nivel 1, y el ensamblaje de un operón bicistrónico en el Nivel M, y en la Figura S1 se muestra una descripción general esquemática de todo el ensamblaje.

1. Nivel 0: Domesticación de piezas

NOTA: El término "domesticación" se utiliza para indicar que una pieza molecular se ha integrado en una biblioteca de piezas de MoClo y se puede ensamblar a lo largo de los niveles del kit de MoClo. Por lo general, todos los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción Tipo IIS utilizadas dentro del kit se eliminan de la parte que se va a domesticar, por ejemplo, mediante una recodificación sinónima.

  1. Diseño del inserto
    1. Elija las partes moleculares, como el promotor, el CDS y el terminador, que se ensamblarán juntas en el operón.
      NOTA: En este protocolo, el operón se inicia con el promotor PLuxB, que puede ser activado por la proteína LuxR en presencia del compuesto inductor N-(β-cetocaproil)-L-homoserina lactona (OC6)17. GFP es el primer CDS del operón; su RBS es iGEM BBa_B0064. GFP es seguido por un enlazador no terminal, el 'puente terminador'. El segundo CDS es mTurquoise. Su RBS ha sido diseñado por una calculadora RBS18. Finalmente, el operón termina con el terminador L3S2P2119.
    2. Elija la posición en la que se debe ensamblar la pieza, se muestra una descripción general en la Figura 1. Según la posición, elija el plásmido aceptor que se utilizará en el GG.
      NOTA: Las piezas se pueden domesticar para su uso posterior en varias posiciones. Por ejemplo, un promotor se puede ensamblar como una sola parte más tarde conectándose con una parte 5'UTR (pSL252), o se puede domesticar con un 5'UTR ya contenido (pSL099). Un CDS se puede ensamblar en cuatro plásmidos aceptores, para ensamblarse sin una etiqueta (pSL102), para ensamblarse con una etiqueta de terminal N (pSL104), para ensamblarse con una etiqueta de terminal C (pSL101) o para ensamblarse con una etiqueta de terminal N y una etiqueta de terminal C (pSL103). En el ejemplo dado, el promotor se domestica en pSL252, el primer RBS se domestica en pSL253, el primer CDS se domestica en pSL102, el puente terminador se domestica en pSL106, el segundo RBS se domestica en pSL099, el segundo CDS se domestica en pSL102 y el terminador se domestica en pSL106.
    3. Agregue extensiones al inserto diseñado según el plásmido aceptor elegido. La Tabla 1 proporciona una descripción general de la extensión requerida para el ensamblaje de GG por plásmido aceptor. Estas extensiones deben agregarse durante el diseño de los cebadores para PCR, el diseño de los oligos en caso de recocer dos oligos para construir una pieza, o durante la síntesis de genes.
      NOTA: Para que una pieza sea domesticada, es necesario asegurarse de que la pieza en sí no contenga sitios de reconocimiento de las enzimas de tipo IIS utilizadas en el kit, SapI (5'-GCTCTTC-3'), BbsI (5'-GAAGAC-3') y BsaI (5'-GGTCTC-3'). La presencia de sitios de reconocimiento en las piezas reduce drásticamente la eficiencia del ensamblaje correcto porque el producto final puede ser cortado por la enzima Tipo IIS utilizada (ver Figura 1).
  2. Buena reacción
    1. Para la reacción GG, agregue 50 fmol del inserto deseado, 50 fmol del plásmido aceptor, 1 μL de tampón de ADN ligasa T4x 10x, 1 μL de T4 ligasa y 1 μL de BbsI. Agregue agua libre de nucleasas hasta un volumen total de 10 μL. Además, incluya un control negativo con la misma reacción sin el inserto deseado.
    2. Ejecute el siguiente programa en un termociclador: 25 ciclos de 37 °C durante 3 min (37 °C es la temperatura óptima de la enzima de restricción) y 16 °C durante 4 min (16 °C es la temperatura óptima de la ligasa T4), seguido de una digestión final a 50 °C durante 20 min (a 50 °C, la ligasa T4 muestra muy poca o ninguna actividad, mientras que la enzima de restricción aún puede funcionar, limitando así la cantidad de plásmido aceptor sin cortar en el producto final) y una inactivación por calor de las enzimas a 80 °C durante 20 min (a 80 °C, todas las enzimas se inactivan por calor y la reacción termina)6.
    3. Transforme la reacción GG agregando 5 μL de la reacción GG en 50 μL de células de E. coli químicamente competentes y realice una transformación de choque térmico con un paso de recuperación como se describe en un protocolo publicado anteriormente15.
    4. Extienda 100 μL del crecimiento de transformación en una placa de agar Luria-Bertani (LB) con 100 μg/mL de espectinomicina. Incubar la placa durante la noche a 37 °C.
    5. Compare la eficiencia de transformación del control negativo con la del ensamblaje completo contando el número de colonias blancas en ambas placas. Continúe con el siguiente paso si el ensamblaje tiene aproximadamente 10 veces (o más) colonias blancas que el control negativo.
      NOTA: La mayoría de las colonias resultantes deben ser blancas, con solo una pequeña fracción de colonias rojas. Los plásmidos aceptores en el kit de herramientas de In-Cloning tienen un casete de selección dual, que contiene mCherry (Nivel 0 y Nivel 1) o LacZα (Nivel M y Nivel P), y un gen ccdB, que codifica un inhibidor de la girasa. La transformación de la reacción GG se realiza en células de E. coli sensibles a ccdB, por lo tanto, solo las células que tienen el plásmido ensamblado pueden crecer, mientras que el plásmido aceptor original no se puede propagar. Ejemplos de cepas sensibles a ccdB incluyen DH5α y TOP10. El mCherry/LacZα permite la identificación visual de las células que escapan del mecanismo ccdB 16.
    6. Para cada ensamblaje, cultivar dos colonias blancas recogiendo algo de material de la colonia con una punta de pipeta y volver a suspenderlo en 5 ml de medio LB con 100 μg/ml de espectinomicina cada una e incubar durante la noche a 37 °C en una incubadora agitadora a 250 rpm. Realice una extracción de plásmidos basada en columnas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Verifique que el plásmido extraído tenga la secuencia esperada mediante la secuenciación de Sanger.

2. Nivel 1: Determinación de posiciones

NOTA: El nivel 1 es el nivel entre la domesticación de piezas y el ensamblaje de un operón policistrónico (Figura 2). Aquí se determinan las posiciones de los ensamblajes intermedios en el constructo final. La posición de un ensamblaje de Nivel 1 dentro del operón se puede alterar utilizando un plásmido aceptor de Nivel 1 diferente. El ejemplo dado describe el ensamblaje de una unidad bicistrónica, pero el esquema dado se puede adaptar fácilmente para el ensamblaje de hasta seis secuencias de codificación (con un RBS cada una). El ensamblaje de más secuencias de codificación requiere además un ciclo entre el nivel P y M. Con el ciclo iterativo entre el nivel P y M, no existe un límite superior fijo para el número de secuencias de codificación que se pueden ensamblar en un solo operón.

  1. Elección de piezas y plásmidos aceptores
    1. Elija las partes de nivel 0 que se ensamblarán en una unidad de transcripción. Como mínimo, estos deben incluir un promotor, un CDS y un terminador.
    2. Elija la posición en la que se debe ensamblar la unidad de transcripción en el operón. En función de esa posición, elija el plásmido aceptor adecuado. En la Figura 2 se muestra una descripción general.
      NOTA: Los 7 fragmentos de ADN para la construcción del operón bicistrónico que se muestran como ejemplo se ensamblan en dos construcciones de Nivel 1. El promotor, el primer RBS, el primer CDS y el puente terminador se ensamblan en pSL68; el segundo RBS, el segundo CDS y el terminador se ensamblan en pSL69.
  2. Buena reacción
    1. Para la reacción GG, agregue 50 fmol de cada uno de los insertos deseados, 50 fmol del plásmido aceptor, 1 μL de tampón de ADN ligasa T4x 10x, 1 μL de T4 ligasa y 1 μL de SapI. Agregue agua libre de nucleasas hasta un volumen total de 10 μL.
    2. Ejecute el siguiente programa en un termociclador: 25 ciclos de 37 °C durante 3 min y 16 °C durante 4 min, seguidos de una digestión final a 50 °C durante 20 min e inactivación térmica de las enzimas a 80 °C durante 20 min6.
    3. Opcional: Agregue 0,5 μL de SapI a la reacción GG e incube a 37 °C durante 1 h.
      NOTA: SapI no es tan estable como las otras enzimas de restricción tipo IIS utilizadas. Se ha encontrado que un paso de digestión con SapI después de la reacción GG reduce la cantidad de colonias que transportan el plásmido aceptor religado. SapI tiene un isoesquizomero, BspQI, que puede no necesitar este paso final de digestión.
    4. Transforme 5 μL de la reacción GG en 50 μL de células de E. coli químicamente competentes y realice una transformación de choque térmico, preferiblemente con un paso de recuperación como el realizado en el paso 1.2.3.
    5. Placa 100 μL del crecimiento de transformación en una placa de agar LB con 100 μg/mL de ampicilina. Incubar la placa durante la noche a 37 °C.
    6. Para cada una, cultive dos colonias blancas recogiendo algo de material de la colonia con una punta de pipeta y resuspendiéndolo en 5 ml de medio LB con 100 μg / ml de ampicilina cada una. Incubar durante la noche a 37 °C en una incubadora agitadora a 250 rpm. Realice una extracción de plásmidos basada en columnas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    7. Confirme el montaje correcto a través de un resumen de restricción con BbsI, comprobando que el tamaño del recorte coincide con el tamaño esperado del inserto. Digestión de 1000 ng de ADN plasmídico añadiendo 1 μL del tampón de digestión 10x apropiado y 1 μL de BbsI. Añadir agua sin nucleasas hasta un volumen total de 10 μl. Incubar la reacción a 37 °C durante 15 min.
    8. Realice la electroforesis en gel cargando el plásmido digerido en un gel de agarosa al 1%, haga funcionar el gel a 100 V durante 35 min.
      NOTA: Se puede realizar una digestión in silico del plásmido esperado para simular un gel de agarosa para predecir el resultado.

3. Nivel M: Ensamblaje de un operón policistrónico

NOTA: En este paso, se está ensamblando el operón policistrónico. En el caso presentado de un operón bicistrónico, se ensamblan dos insertos de nivel 1 en las posiciones 1 y 2. En consecuencia, se elige el plásmido aceptor pMA60. Además, se requiere un enlazador final. Todos los plásmidos aceptores de nivel M y P tienen el voladizo GGGA como segundo voladizo. Los enlazadores finales unen el plásmido inserto y aceptor y permiten el ensamblaje de una construcción de nivel P en el nivel M y viceversa. Para un ensamblaje de Nivel P de dos insertos de Nivel 1, se utiliza el enlazador final pMA668 y ocupará la tercera y última posición. En la Figura 3 se muestra una descripción general de los niveles M y P y una visualización del paso de clonación. Con el ensamblaje únicamente en el nivel M (o P), se pueden clonar operones de hasta 6 secuencias codificantes (posiciones 1-6). La posición 7 está siendo ocupada por el enlazador final. El ensamblaje de un mayor número de secuencias codificantes en un operón es posible, pero requiere pasar al nivel M (o P), que no se describe en este protocolo.

  1. Para la reacción GG, agregue 50 fmol de cada inserto deseado, 50 fmol del plásmido aceptor, 1 μL de tampón de ADN ligasa T4x 10x, 1 μL de T4 ligasa y 1 μL de BbsI. Agregue agua libre de nucleasas hasta un volumen total de 10 μL.
  2. Ejecute el siguiente programa en un termociclador: 50 ciclos de 37 °C durante 3 min y 16 °C durante 4 min, seguidos de una digestión final a 50 °C durante 20 min e inactivación por calor de las enzimas a 80 °C durante 20 min6.
  3. Transforme 5 μL de la reacción GG en 50 μL de células de E. coli químicamente competentes y realice una transformación de choque térmico con un paso de recuperación como se realizó en el paso 1.2.3.
  4. Extienda 100 μL del crecimiento de transformación en una placa de agar LB con 100 μg / mL de espectinomicina. Incubar la placa durante la noche a 37 °C, o a 30 °C si se espera una carga metabólica o toxicidad del conjunto.
  5. Para cada ensamblaje, haga un cultivo de dos colonias blancas. Para ello, sumerja una punta de pipeta en la colonia y utilícela para inocular 5 ml de LB con 100 μg/ml de espectinomicina. Incubar durante la noche a 37 °C o 30 °C en una incubadora agitadora a 250 rpm. Realice una extracción de plásmidos basada en columnas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  6. Confirme el ensamblaje correcto mediante un resumen de restricción con BsaI, comprobando que el tamaño del recorte coincide con el tamaño esperado del inserto, como se realizó en el paso 2.2.7.
    NOTA: La construcción puede ser demasiado larga para ser cubierta por la secuenciación de Sanger para su confirmación. Luego se puede confirmar mediante secuenciación de plásmidos completos, que está disponible como un servicio comercial de varios proveedores de servicios de secuenciación.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, se muestran los resultados de un ensamblaje ascendente de un operón policistrónico del Nivel 0 al Nivel M (Figura S1). El operón se inicia con el promotor PLuxB, que puede ser activado por la proteína LuxR en presencia del compuesto inductor N-(β-cetocaproil)-L-homoserina lactona (OC6)17. GFP es el primer CDS del operón, su RBS es iGEM BBa_B0064. GFP es seguido por un enlazador no terminal, el 'puente terminador'. El segundo RBS e...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La clonación molecular puede llevar mucho tiempo y ser engorrosa, especialmente con estrategias de clonación ad hoc. Los kits de herramientas MoClo pueden mejorar la clonación molecular por su modularidad, ensamblaje jerárquico y reacciones en un solo recipiente altamente eficientes. Se basan en el ensamblaje del ADN a través de reacciones Golden Gate. Gracias a los voladizos estandarizados, las bibliotecas de partes moleculares se pueden reutilizar y compartir con otros

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TAL, STdV y DS contaron con el apoyo de la Sociedad Max Planck en el marco del proyecto MaxGENESYS.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicilinaMerck Life ScienceA9518
Agar bacterianoFisher Scientific & nbsp;P0011B
BbsI-HFNew England BiolabsR3539
BsaI-HF V2New England BiolabsR3733
E. coli DH5α Células competentes
Eppendorf y Eppendorf; Mastercycler  Cicladores Térmicos NexusEppendorf6333000014
Espectrofotómetro de microvolumen EzDrop 1000Biotecnología Blue-RayBRED-1000
Kit de Minipreparación para Plásmidos GeneJETTermo CientíficaK0503
In- & Salida - Kit de herramientas de clonación
Búfer de ligasaNew England BiolabsB0216
NaClFisher Scientific & nbsp;BP358
New Brunswick Innova®   42/42R - Agitador Incubadora ApilableEppendorfM1335-0080
PhenoBooth+Instrumentos cantantesPHB-007
SaPiNew England BiolabsR0569
SpectinomicinaMerck Life ScienceS4014
Material de laboratorio estándar
Ligasa de ADN T4New England BiolabsM0202
Thermomix MMB. Braun Biotech Internacional
TriptonaFisher Scientific & nbsp;LP0042B
Extracto de levaduraFisher Scientific & nbsp;LP0021B

References

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