Optimización del aislamiento y la purificación de las células mesangiales glomerulares murinas

Summary

Este estudio desarrolló un protocolo optimizado para el aislamiento de células mesangiales murinas (MCs) y su cultivo celular ex vivo . Estas células pueden pasar varias veces, congelarse, revivirse y cultivarse sin comprometer el crecimiento celular o la expresión de proteínas.

Abstract

Las células mesangiales (MC) son células estromales ubicadas en el espacio medio del glomérulo, con funciones fundamentales en la homeostasis glomerular. Desde la década de 1980 se han desarrollado y optimizado métodos para aislar, purificar y cultivar MC glomerulares para su uso en la investigación biomédica, particularmente en el campo de la nefrología. Los ratones son los modelos animales experimentales más utilizados en la investigación de enfermedades renales. En este estudio, desarrollamos un protocolo optimizado para el aislamiento de MCs murinos y el cultivo celular ex vivo . Estas células pueden pasar varias veces, congelarse, revivirse y cultivarse sin comprometer el crecimiento celular o la expresión de proteínas. Este enfoque optimizado reduce significativamente la duración del estudio para los investigadores y permite la preservación celular a largo plazo. El equipo necesario para los procedimientos es fácilmente accesible en un laboratorio biomédico básico, y los pasos del procedimiento son sencillos. La adquisición de células diana requiere solo 2-3 semanas, una reducción de al menos 1 semana en comparación con los métodos existentes.

Introduction

El glomérulo es una red de capilares que realiza la tarea esencial de filtrar la sangre para formar orina¹. Las células mesangiales (MC) están incrustadas dentro de la matriz mesangial, situada entre los capilares glomerulares, y están en una posición única para influir en la dinámica glomerular a través de sus diversas funciones². Los MC desempeñan funciones cruciales en el glomérulo, incluido el desarrollo glomerular, el soporte estructural de los capilares glomerulares, la fagocitosis y la producción de la matriz de la membrana basal glomerular³. El estudio de las células mesangiales es fundamental para avanzar en nuestra comprensión de la fisiología y la patología renal.

También es destacable la participación de las células mesangiales en condiciones patológicas. En respuesta a una lesión o enfermedad glomerular, como la nefropatía diabética o la glomerulonefritis, las células mesangiales pueden proliferar y secretar un exceso de componentes de la matriz extracelular, lo que conduce a glomeruloesclerosis y deterioro de la función renal ^4,5. Por lo tanto, comprender las funciones y los mecanismos reguladores de las células mesangiales es esencial para desarrollar estrategias terapéuticas para las enfermedades renales.

Las células mesangiales murinas permiten a los investigadores modelar y explorar los procesos moleculares y celulares implicados en enfermedades como la nefropatía IgA⁶, la nefropatía diabética⁷ y la glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GEFS)^8,9. Dado su papel en la fibrosis renal y la inflamación, los MC glomerulares murinos se utilizan con frecuencia en estudios clínicos para evaluar la eficacia de los compuestos terapéuticos ^9,10. Además, las células mesangiales murinas son una herramienta importante para estudiar los efectos de varias vías de señalización sobre la función renal, incluida la vía RhoA/ROCK¹¹ y la vía¹² del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β). Estos estudios ayudan a dilucidar cómo estas moléculas de señalización contribuyen a la progresión de la enfermedad renal. Ya sea que se utilicen para el modelado de enfermedades, el desarrollo terapéutico o la investigación de transducción de señales, los MC murinos continúan sirviendo como un recurso crucial para avanzar en nuestra comprensión de la salud y la enfermedad renal.

Mackay et al. establecieron un método para adquirir líneas celulares ex vivo de células epiteliales glomerulares, mesangiales y endoteliales de ratones transgénicos en 1988¹³. Wilson y Stewart desarrollaron un método para aislar y purificar los MC primarios del tejido renal del paciente, que implica tres rondas de tamizado y lavado extenso con medios¹⁴. Menè y Stoppacciaro también propusieron un método para aislar los MC primarios del tejido renal de pacientes o ratas. Esta técnica implica dos rondas de tamizado, dos empujes con aguja y digestión de la colagenasa. Las células obtenidas de 4-8 riñones de rata se colocan en una placa de seis pocillos, aunque el rendimiento es relativamente bajo¹⁵. Estos métodos requieren la disección de los riñones en pedazos pequeños antes de procesarlos. Además, estos enfoques tardan aproximadamente 3-4 semanas en producir MC purificados.

Los ratones son los modelos animales experimentales más empleados en la investigación de enfermedades renales. Sin embargo, todavía no existe un método sistemático para aislar los MC murinos. En este estudio, desarrollamos un protocolo optimizado para el aislamiento de MCs murinos y el cultivo celular ex vivo . Este método se puede emplear cuando se utilizan MC de riñón murino primario para la investigación experimental. En comparación con los métodos anteriores, este enfoque elimina la necesidad de cortar y tamizar el tejido antes de la digestión. En cambio, todo el riñón del ratón se muele con un molinillo de células y se digiere directamente con colagenasa. A continuación, la solución de digestión se tamiza dos veces, con todas las células recogidas en el segundo tamiz y se vuelven a suspender. Este método permite que dos riñones de ratón produzcan suficientes células para sembrar de dos a tres placas de cultivo de 100 mm en 10 días. Los MC purificados se obtienen posteriormente a través del cultivo y la purificación utilizando un medio especializado que contiene D-valina. Estas células pueden pasar varias veces, congelarse, revivirse y cultivarse sin comprometer el crecimiento celular o la expresión de proteínas. El equipo necesario para estos procedimientos está fácilmente disponible para los laboratorios biomédicos básicos, y todo el proceso tarda solo 2-3 semanas en obtener las células objetivo. Este método es adecuado para estudios que involucran MC murinos para investigar enfermedades o mecanismos relacionados con el riñón, ya que es eficiente y ahorra tiempo.

Protocol

Los experimentos con animales cumplieron con las directrices ARRIVE, y todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación nacional y la Directiva de la Comisión Europea (2010/63/UE). Los ratones fueron alojados y mantenidos en condiciones libres de patógenos, de acuerdo con los requisitos de los Comités de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan. Todos los estudios experimentales en animales fueron aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan. En este ensayo se utilizaron ratones machos C57BL/6JGpt de ocho semanas de edad para el aislamiento de células mesangiales. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales. La Figura 1 ilustra los procedimientos para aislar y purificar las células mesangiales glomerulares murinas.

1. Preparación de reactivos para el aislamiento de MCs murinos

NOTA: Asegúrese de que todos los reactivos y equipos estén estériles.

1. Colagenasa tipo I (750 U/mL): Pesar el polvo y disolverlo poco antes de usar en RPMI 1640.
2. Medio de cultivo celular mesangial 1: Mezclar RPMI 1640 con 2 mM de glutamina, 17% de FBS, antibióticos (100 unidades/mL de penicilina más 10.000 μg/mL de estreptomicina) y 0,1 U/mL de insulina.
3. Medio de cultivo celular mesangial 2: Combine RPMI 1640 (D-valina) con 2 mM de glutamina, FBS al 10%, antibióticos (100 unidades/mL de penicilina más 10,000 μg/mL de estreptomicina), ITS-G (insulina, transferrina, solución de selenio 100x) y 0.1 U/mL de insulina. Almacene los medios de cultivo de células mesangiales a 4 °C y utilícelos dentro de 1 mes después de la preparación.
4. Medios de criopreservación celular: Prepare una mezcla de medio RPMI 1640, suero y DMSO en una proporción de 7:2:1.

2. Aislamiento de MCs murinos

1. Sacrificio humanitario de ratones mediante asfixia con CO₂ seguida de luxación cervical (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Sumerja los cadáveres en un vaso de precipitados que contenga un 75% de alcohol para su esterilización, luego transfiera el animal a una superficie de trabajo aséptica.
2. Extraiga asépticamente los riñones del ratón con tijeras y pinzas, colóquelos en una placa de Petri, enjuague con EBSS (solución salina equilibrada de Earle), luego retire con cuidado el tejido conectivo y la cápsula renal con pinzas.
3. Corta el riñón por la mitad verticalmente, agrega 3-4 mL de solución de colagenasa I y muele con un mortero de celdas de plástico.
4. Pipetee todos los tejidos y la solución de la placa de Petri en un tubo de centrífuga de 15 mL. Enjuague la placa de Petri con 1-2 ml de solución de colagenasa I para asegurarse de que se transfiera todo el tejido. Coloque la solución en el agitador a 37 °C, agitando a 120 rpm durante 30 min. A continuación, añada un volumen igual de solución de parada (medio de cultivo 1).
5. Pipetear la solución del tubo de centrífuga de 15 mL, pasarla a través de un filtro de celdas de 100 μm y recoger el filtrado en un tubo de centrífuga de 50 mL.
6. Pase el líquido del paso 2.5 a través de un filtro de células de 40 μm, reteniendo solo las células en el filtro de células de 40 μm. Enjuague el colador repetidamente con el medio de cultivo 1 para asegurar la recolección de tantas células como sea posible en el colador. Transfiera las células recolectadas del filtro a un nuevo tubo de centrífuga de 50 mL.
7. Centrifugar la suspensión a 600 x g durante 5 min (a temperatura ambiente), luego resuspender las células en una placa de cultivo celular de acuerdo con la densidad celular. Generalmente, resuspender las células de dos riñones en dos o tres placas de cultivo de 100 mm (10 mL de medio de cultivo, placa de 1/100 mm). Coloque las placas en una incubadora de celdas a 37 °C con 95% de aire/5% de CO₂.
8. Examinar la morfología celular y la adherencia bajo un microscopio (40×) al día siguiente. Si hay células muertas flotantes en el medio de cultivo, utilice una pipeta para retirar el medio del fondo de la placa de cultivo, teniendo cuidado de no alterar las células adheridas.
9. Agregue 1-2 mL de PBS a lo largo del borde interior de la placa de cultivo para enjuagar las células. Utilice una pipeta para eliminar todo el PBS del fondo de la placa de cultivo y, por último, añada 10 ml de medio de cultivo 1 a lo largo del borde interior de la placa de cultivo.

3. Purificación de MCs murinos

1. Un día después de la separación, retire las células no adherentes lavando suavemente y reemplazando el medio de cultivo con un medio de cultivo fresco 1 como se describe en el paso 2.8. Observar las células del glomérulo bajo un microscopio de contraste de fase (40×).
   NOTA: Las formas esféricas brillantes representan el glomérulo, mientras que las células circundantes exhiben rasgos similares a los adoquines, característicos de las células epiteliales (Figura 2A).
2. Observe la morfología celular después de 1-3 días (Figura 2B-C). Aparecerán células en forma de estrella y de huso alrededor de las células de adoquín, como se muestra en la Figura 2D.
3. Cuando las células alcancen el 80% de confluencia (generalmente dentro de los 7-10 días), lave las células dos veces con PBS estéril, luego tripsinícelas con una solución de tripsina al 0,25% (2 mL de solución de tripsina al 0,25% por plato de 100 mm).
4. El proceso inicial de tripsinización celular puede durar aproximadamente 20 minutos. Después de agregar tripsina, coloque la placa en una incubadora a 37 °C. Observar el proceso en tiempo real bajo un microscopio de contraste de fase (40×) para evaluar la tripsinización de las células.
5. Finalice el proceso de tripsinización agregando un volumen igual de medio 2 cuando la mayoría de las células exhiban una morfología redondeada y se desprendan de la superficie de la placa.
6. Centrifugar las células a 600 × g durante 5 min (a temperatura ambiente) y, a continuación, volver a suspenderlas en el medio 2. Generalmente, vuelva a suspender las células de una placa de 100 mm en dos placas de cultivo de 100 mm (medio de cultivo de 10 mL, placa de 2/100 mm).
7. Cambie el medio de cultivo 2 al día siguiente. Observe numerosas células suspendidas y fragmentos de células bajo el microscopio (40×), ya que solo las MC pueden sobrevivir y proliferar en el medio de D-valina¹⁶. Cambie el medio cada 1 o 2 días para eliminar las células muertas. Las células adherentes en el cultivo son MCs (Figura 3A-D). Determine la tasa de crecimiento de los MC aislados (Figura 3E).
8. Una vez que las células alcanzan el 80% de confluencia, se tripsinizan y se pasan. Los MC suelen tardar aproximadamente 5-10 minutos en tripsinizarse.

4. Conservación a largo plazo de los MC murinos

NOTA: Dado que las células primarias pueden diferenciarse y mutar con el tiempo y múltiples pasajes, congele y almacene los MC después de la purificación celular para su conservación a largo plazo.

1. Retire con cuidado el sobrenadante a lo largo del borde inferior de la placa con una pipeta, lave las células dos veces con PBS estéril y luego tripsinícelas con una solución de tripsina al 0,25% (2 ml de solución de tripsina al 0,25% por placa de 100 mm). Siga los pasos de tripsinización como se describe en los pasos 3.3-3.8.
2. Después de la tripsinización, agregue un volumen igual de medio 2 para finalizar el proceso y transfiera todo el líquido a un tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar las células a 600 × g durante 5 min (a temperatura ambiente), desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 mL de PBS para contar las células.
3. Utilice un contador automático de celdas para contar las celdas. Tome 20 μL de 1 mL de solución de células resuspendidas y añádalas a una placa de recuento de células dedicada para determinar el número total de células. En función del recuento de células, vuelva a suspenderlas en un medio de criopreservación celular (1 ml de medio de criopreservación celular por cada 10^{a 6} células).
4. Transfiera la solución celular a tubos de criopreservación (1 mL de medio de criopreservación celular por tubo de criopreservación de 2 mL) y realice una congelación lenta a -80 °C antes de transferirla a nitrógeno líquido para su preservación.
   NOTA: Vuelva a suspender y siembra las células en placas de cultivo celular para su amplificación según sea necesario. Las celdas deben usarse entre los pasajes 3 y 8 después de haber sido completamente caracterizadas¹⁷.

5. Identificación de MCs murinos

NOTA: Después de que las células hayan pasado dos veces, identifique los MC murinos utilizando las siguientes técnicas.

1. Mancha occidental de MCs murinos
   NOTA: Los reactivos necesarios para el procedimiento se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1.
   1. Tripsinizar las células siguiendo los mismos pasos que en 3.3-3.8 y paso 4.1.
   2. Después de recolectar las células, lise las células para extraer proteínas y medir la concentración de proteínas.
   3. Tome una cantidad adecuada de muestra (generalmente 20 ng), agregue tampón de carga y desnaturalice a 100 °C durante 5 min.
   4. Resuelva la proteína (20 ng) con un gel SDS-PAGE al 10% o un gel SDS-PAGE al 7,5%, luego transfiérala a una membrana de celulosa a un voltaje constante.
   5. Bloquee la membrana con leche descremada al 5%, luego incube con el anticuerpo primario a 4 °C en un agitador durante la noche.
   6. Incubar con el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 h después de lavar con TBST (Tris Buffered Saline with Tween 20) tres veces.
   7. Detecte señales con el sistema de imágenes.
      NOTA: Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio incluyeron anti-αSMA de ratón (1:500), anti-vimentina de conejo (1:2000), anti-fibronectina de conejo (1:2000) y anti-GAPDH de ratón (1:50000). Los anticuerpos secundarios utilizados en este estudio fueron la IgG (H + L) (1:5000) conjugada con peroxidasa y la IgG (H + L) (1:5000) conjugada con peroxidasa para ratones.
2. Tinción de inmunofluorescencia de MCs murinos
   NOTA: Los reactivos necesarios para el procedimiento se proporcionan en la Tabla Suplementaria 2.
   1. Tripsinice las células siguiendo los mismos pasos que en los pasos 3.3-3.8 y 4.1.
   2. Vuelva a suspender las células y cuéntelas. Tome 1 x 10⁵ células y añádalas a la placa de cultivo celular con fondo de vidrio de 15 mm (1 ml de medio de cultivo, 2 por cada 15 mm de fondo de vidrio).
   3. Fije los MC con paraformaldehído al 4% durante 15 min (1 mL de paraformaldehído al 4% por fondo de vidrio de 15 mm), luego lave tres veces con PBS.
   4. Tratar los MCs con Triton X-100 al 0,1% durante 10 min para permeabilizar las membranas celulares.
   5. Después de tres lavados más con PBS, bloquee las celdas a temperatura ambiente con una solución de PBS BSA al 3% durante 30 minutos.
   6. Lavar las células e incubarlas con anticuerpos primarios anti-ratón αSMA y anti-conejo Vimentina a 4 °C durante la noche.
   7. Incubar durante 1 h con IgG secundaria anti-ratón de burro conjugada con Alexa 594 roja e IgG anti-conejo de burro conjugada con FITC verde a temperatura ambiente.
   8. Utilice DAPI para la contratinción nuclear durante 1 min a temperatura ambiente.
   9. Agregue el medio de montaje fluorado y cúbralo con un portaobjetos de vidrio. Analice las células con un microscopio confocal.
      NOTA: Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio incluyeron anti-αSMA de ratón (1:200) y anti-vimentina de conejo (1:200). Los anticuerpos secundarios utilizados en este estudio incluyeron IgG anti-ratón de burro conjugado con Alexa 594 rojo (1:400), IgG anti-conejo de burro conjugado con FITC verde (1:400) y DAPI (1:1000).
3. Citometría de flujo de MCs murinos
   1. Tripsinice las células siguiendo los mismos pasos que en los pasos 3.3-3.8 y 4.1.
   2. Vuelva a suspender las células y cuéntelas. Tome 5 x 10⁵ celdas y lávelas una vez con 3 mL de PBS.
   3. Vuelva a suspender las células con 100 μL de PBS en un tubo de flujo, luego agregue 1-2 μL de anticuerpo anti-ratón PDGFRB (CD140b).
   4. Incubar las células en hielo durante 30 minutos en la oscuridad, luego analizarlas mediante citometría de flujo.

Results

Este estudio desarrolló un protocolo optimizado para el aislamiento de MCs murinos y el cultivo celular ex vivo. Hasta donde sabemos, no existe un método estándar para validar los MC primarios ex vivo. De acuerdo con publicaciones previas, las MCs se caracterizan por la expresión de αSMA, Vimentina y Fibronectina ^3,14,15. Se utilizó el análisis de Western blot para detectar los niveles de expresión de MCs. Los ...

Discussion

Las enfermedades relacionadas con los riñones son muy prevalentes, y los ratones se utilizan ampliamente como modelo animal principal para estudiar estas afecciones debido a su similitud genética con los humanos y a la disponibilidad de modelos de enfermedades bien establecidos. Las células mesangiales desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la estructura y función normales del glomérulo al proporcionar soporte estructural, regular la filtración glomerular y participar en las ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 y micro; m Filtro de células	Biosharp	BS-100-CS
100 mm Placa de Petri	Sorfa	230301
15 mL Tubo de centrífuga	Sorfa	411000
15 mm placa de cultivo celular con fondo de vidrio	Sorfa	201200
180 kDa Plus Marcador de proteínas preteñido	Vazyme	MP201-01
2 mM L-glutamina	BasalMedia	S210JV
4% Paraformaldehído	Biosharp	BL539A
40 µ m Filtro de células	Biosharp	BS-40-XBS
50 mL Tubo de centrífuga	Sorfa	41000
60 mm Placa de Petri	Sorfa	230201
75% de alcohol	Knowles	64-17-5
96 Placas de cultivo celular de pocillos, tratadas con TC	Servicebio	CCP-96H
Antibióticos (10 μ g/mL de ceftriaxona más 100 μ g/mL gentamicina)	NCM	C100C5
BCA (ácido bicincónico) Kit de ensayo de proteínas	CWBIO	CW0014S
Kit de recuento de células-8	Microscopio	CB101
	FV-3000	Olympus
DMSO	Sigma	D2650
DMSO	Sigma	D2650
Earle's Solución salina equilibrada (1x EBSS)	Beyotime	C0213
Suero fetal bovino (FBS)	Excell	FSP500
Analizador de células fluorescentes	Mira FL	Medios Countstar
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01
Insulina, Transferrina, Selenio Solución 100x (ITS -G)	Gibco	41400045
Microscopio de fluorescencia invertida	Olympus	IX83
Tampón de lisis	Adilab	PP1101
Kit de preparación PAGE de un solo paso (10%)	Oriscience	PB102
Kit de preparación PAGE de un solo paso (7.5%)	Oriscience	PB101
PE anti-ratón CD140b Anticuerpo Biolegend		323605
solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Servicebio	G4202
Plastic Cell Pestle	Biofil	CC-4090
Cóctel de inhibidores de proteinasa	Roche	4693159001
Membrana de PVDF	Vazyme	E802-01
Insulina humana recombinante	Solarbio	11061-68-0
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medio	Corning	10-040-CV SDS-PAGE
Tampón de carga de muestras (5x)	Servicebio	G2013
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium (D-valina en lugar de L-valina)	Procell	WH3923U222
TBS (Tris Buffered Saline)	Servicebio	G0001-2L
Triton X-100	Biosharp	BS084
Tripsina-EDTA (0.25%)	Gibco	25200072
Tween 20	Biosharp	BS100
Tipo I colagenasa	Solarbio	CB140