En este estudio, describimos un protocolo paso a paso y enfatizamos los detalles clave para determinar las características morfológicas de las mitocondrias en células vivas, incluida la preparación de la muestra, la adquisición de imágenes y el análisis de datos. Este método se usa comúnmente para examinar la morfología mitocondrial para estudiar diversas afecciones.
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Artículo de método
Determinación de la morfología mitocondrial en células vivas mediante microscopía confocal
En este artículo
Resumen
Resumen
El equilibrio dinámico de la fusión y fisión mitocondrial contribuye directamente a la homeostasis mitocondrial, que influye en numerosas funciones celulares además de la homeostasis del trifosfato de adenosina (ATP). Por lo tanto, la evaluación de la morfología mitocondrial en condiciones de estrés es esencial para la investigación mecanicista. Este estudio describe un protocolo detallado para analizar la morfología mitocondrial, que abarca la preparación de una solución MitoTracker, la tinción de las mitocondrias, la optimización de los parámetros de imagen y la detección de características morfológicas. Los MitoTrackers son colorantes específicos de mitocondrias rentables y de uso común. Sin embargo, pueden ocurrir algunos cambios en la morfología mitocondrial debido a un manejo inadecuado, que puede ser imperceptible y no reflejar el verdadero estado de las mitocondrias. Por lo tanto, es necesario comprender cómo analizar los cambios en la morfología mitocondrial utilizando MitoTrackers. El protocolo utilizó células SH-SY5Y estimuladas con yoduro de 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP+) para ilustrar el protocolo de análisis morfológico mitocondrial. En comparación con las células de control, las células estimuladas por MPP+ exhibieron mitocondrias más pequeñas y fragmentadas, con parámetros morfológicos que indican una disminución de la huella mitocondrial. Estos resultados sugieren que la tinción con MitoTracker es un método eficaz y factible para el análisis morfológico mitocondrial que (con pequeñas modificaciones) puede aplicarse para estudiar diversas afecciones.
Introducción
La morfología mitocondrial se mantiene por el equilibrio dinámico de la fusión y fisión mitocondrial y, por lo tanto, afecta la homeostasis energética y muchas otras funciones celulares, lo que conduce a diversas patologías como enfermedades neurodegenerativas, cáncer e inflamación 1,2,3,4,5 . Para observar la morfología mitocondrial, se han desarrollado varias tinciones selectivas de mitocondrias, incluyendo sondas y anticuerpos, para su uso con un microscopio confocal. Al....
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Protocolo
1. Preparación
- Disuelva MPP+ con dimetilsulfóxido (DMSO) para hacer una solución madre de 1 mM y almacene a -30 °C en la oscuridad (consulte la tabla de materiales).
- Disuelva 50 μg de MitoTracker (MitoTracker Red CMXRos) en 94 μL de DMSO para hacer una solución madre de 1 mM. Alicuente la solución madre en varios tubos de microcentrífuga y guárdela protegida de la luz a -30 °C hasta su uso posterior.
- Incubar las células SH-SY5Y en matraces con medio Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 de Dulbecco suplementado con un 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS) e....
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Resultados
Este protocolo describe un procedimiento detallado, paso a paso, para el análisis morfológico mitocondrial a través de tres módulos de optimización interdependientes: estandarización de los protocolos de preparación de muestras, optimización sistemática de los parámetros ópticos para la obtención de imágenes de microscopía confocal y directrices de procesamiento de imágenes computacionales. Un protocolo óptimo de preparación de muestras es fundamental para obtener datos fiables de imágenes mitocondriales. La evaluación s.......
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Discusión
El presente estudio establece una metodología sistemática para analizar la morfología mitocondrial en células vivas en condiciones de estrés. Los pasos cruciales del procedimiento en la obtención de imágenes mitocondriales incluyen: una concentración adecuada de sondas MitoTracker, el lavado minucioso de las placas confocales antes de la adquisición de imágenes, la minimización de las perturbaciones en el estado celular y el establecimiento de parámetros de imagen adecuados.
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81974501).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Yoduro de 1-metil-4-fenilpiritinio (MPP+) | Macklin | M875357 | Se utiliza para inducir estrés oxidativo |
| Plato confocal | NIDO | 801001 | Se utiliza para cultivar las células |
| Microscopio confocal | Nikon | C2 | Se utiliza para capturar imágenes |
| Mezcla de medios/nutrientes Eagle modificado de Dulbecco F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | Se utiliza para proporcionar nutrición a las células |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Tiempo de beyo. | ST038 | Se utiliza para disolver la sonda mitotracker |
| Suero fetal bovino (FBS) | ThermoFisher Scientific | A3161001C | Se utiliza para proporcionar nutrición a las células |
| ImagenJ | Institutos Nacionales de Salud | ImagenJ | Se utiliza para analizar la morfología mitocondrial |
| MitoTracker Red CMXRos | ThermoFisher Scientific | M7512 | Se utiliza para visualizar mitocondrias |
| Solución salina tampón de fosfato (PBS) | ThermoFisher Scientific | C10010500BT | Se utiliza para lavar las células en platos confocales |
| Célula SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Se utiliza para demostrar el flujo de trabajo de análisis de la morfología mitocondrial |
| Adaptador de platina TI-SH-U | Nikon | MEC59110 | Se utiliza para asegurar muestras |
Referencias
- von der Malsburg, A., et al. Structural mechanism of mitochondrial membrane remodelling by human OPA1. Nature. 620 (7976), 1101-1108 (2023).
- Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol
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Reimpresiones y permisos
