Determinación de la morfología mitocondrial en células vivas mediante microscopía confocal

Resumen

En este estudio, describimos un protocolo paso a paso y enfatizamos los detalles clave para determinar las características morfológicas de las mitocondrias en células vivas, incluida la preparación de la muestra, la adquisición de imágenes y el análisis de datos. Este método se usa comúnmente para examinar la morfología mitocondrial para estudiar diversas afecciones.

Resumen

El equilibrio dinámico de la fusión y fisión mitocondrial contribuye directamente a la homeostasis mitocondrial, que influye en numerosas funciones celulares además de la homeostasis del trifosfato de adenosina (ATP). Por lo tanto, la evaluación de la morfología mitocondrial en condiciones de estrés es esencial para la investigación mecanicista. Este estudio describe un protocolo detallado para analizar la morfología mitocondrial, que abarca la preparación de una solución MitoTracker, la tinción de las mitocondrias, la optimización de los parámetros de imagen y la detección de características morfológicas. Los MitoTrackers son colorantes específicos de mitocondrias rentables y de uso común. Sin embargo, pueden ocurrir algunos cambios en la morfología mitocondrial debido a un manejo inadecuado, que puede ser imperceptible y no reflejar el verdadero estado de las mitocondrias. Por lo tanto, es necesario comprender cómo analizar los cambios en la morfología mitocondrial utilizando MitoTrackers. El protocolo utilizó células SH-SY5Y estimuladas con yoduro de 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP⁺) para ilustrar el protocolo de análisis morfológico mitocondrial. En comparación con las células de control, las células estimuladas por MPP⁺ exhibieron mitocondrias más pequeñas y fragmentadas, con parámetros morfológicos que indican una disminución de la huella mitocondrial. Estos resultados sugieren que la tinción con MitoTracker es un método eficaz y factible para el análisis morfológico mitocondrial que (con pequeñas modificaciones) puede aplicarse para estudiar diversas afecciones.

Introducción

La morfología mitocondrial se mantiene por el equilibrio dinámico de la fusión y fisión mitocondrial y, por lo tanto, afecta la homeostasis energética y muchas otras funciones celulares, lo que conduce a diversas patologías como enfermedades neurodegenerativas, cáncer e inflamación 1,2,3,4,5 . Para observar la morfología mitocondrial, se han desarrollado varias tinciones selectivas de mitocondrias, incluyendo sondas y anticuerpos, para su uso con un microscopio confocal. Algunas sondas específicas de mitocondrias, como la tetrametilrosamina y la rodamina 123, funcionan en función del potencial de membrana mitocondrial (MMP), lo que limita su aplicabilidad en estudios de condiciones de alteración de MMP ^6,7. Por el contrario, la tinción de anticuerpos proporciona una evaluación morfológica independiente de MMP para examinar la morfología mitocondrial en células fijas. Aunque una tinción adecuada permite evaluar la morfología mitocondrial en células fijas, el examen de la morfología mitocondrial en células vivas afectadas por algunos inductores sigue siendo un desafío. MitoTracker, una sonda fluorescente catiónica permeable a las células y específica de las mitocondrias, ofrece una solución a este desafío, permitiendo la tinción tanto de células vivas como fijas. Esta sonda ha sido ampliamente utilizada para examinar la morfología mitocondrial en estudios de diversas enfermedades 8,9,10,11. Sin embargo, algunos estudios han informado de problemas como una señal de fondo alta y un enlace no específico, incluso cuando la sonda se utiliza en estricta conformidad con las directrices proporcionadas por el fabricante. Estas observaciones resaltan la importancia de una comprensión profunda de la preparación de muestras y la adquisición de imágenes para el análisis exitoso de la morfología mitocondrial.

Para facilitar el análisis de la morfología mitocondrial, se han desarrollado diversos programas y algoritmos de procesamiento de imágenes 12,13,14,15,16. En este estudio, empleamos la macro herramienta Análisis de Redes Mitocondriales (MiNA) en ImageJ para analizar la morfología mitocondrial¹³. Esta herramienta identifica y caracteriza eficazmente las características morfológicas de las redes mitocondriales mediante el cálculo de nueve parámetros descriptivos, incluido el número de individuos (estructuras sin ramificaciones), el número de redes (número de objetos con al menos un píxel de unión), la longitud media (longitud promedio de todos los bastones y ramas), la longitud mediana (longitud mediana de todos los bastones y ramas), la desviación estándar de la longitud (desviación estándar de las longitudes individuales), el tamaño medio de la red (el número promedio de sucursales por red), el tamaño de la red mediano (el valor medio del número de sucursales por red), la desviación estándar del tamaño de la red (desviación estándar del número de sucursales por red) y la huella mitocondrial (área total de la señal después de la separación de fondo). En este protocolo se seleccionó la huella mitocondrial como parámetro representativo.

El objetivo de este estudio es proporcionar un protocolo paso a paso para el análisis morfológico mitocondrial, centrándose en los detalles clave. Utilizamos células SH-SY5Y inducidas por MPP⁺ para demostrar este protocolo. MPP⁺ inhibe el complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial en las neuronas dopaminérgicas, lo que resulta en daño a la morfología y función mitocondrial ^8,17. El protocolo de análisis morfológico descrito en este estudio permite la adquisición de imágenes de alta resolución y la evaluación de parámetros relevantes para definir las características morfológicas de las redes mitocondriales.

Protocolo

1. Preparación

1. Disuelva MPP⁺ con dimetilsulfóxido (DMSO) para hacer una solución madre de 1 mM y almacene a -30 °C en la oscuridad (consulte la tabla de materiales).
2. Disuelva 50 μg de MitoTracker (MitoTracker Red CMXRos) en 94 μL de DMSO para hacer una solución madre de 1 mM. Alicuente la solución madre en varios tubos de microcentrífuga y guárdela protegida de la luz a -30 °C hasta su uso posterior.
3. Incubar las células SH-SY5Y en matraces con medio Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 de Dulbecco suplementado con un 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS) en un ambiente humidificado con 5% de CO₂ y 95% de aire a 37 °C. Para el paso, separe las celdas con una solución de tripsina al 0,05% durante 1 min y centrifugue a 100 × g durante 3 min.

2. MPP⁺ estimulación

1. Siembre las células SH-SY5Y en placas confocales con fondo de vidrio y manténgalas en medio DMEM/F12 suplementado con 1% (v/v) de FBS durante la noche.
2. Reemplace el medio de cultivo, luego incube las células con o sin MPP⁺ durante 24 h.

3. Tinción de MitoTracker

1. Precaliente DMEM/F12, luego diluya la solución madre de MitoTracker con DMEM/F12 para obtener una solución de trabajo de 50 nM. Mantenga la solución protegida de la luz durante todo el procedimiento.
2. Retire el medio de cultivo celular y lave las placas confocales 2 veces con DMEM/F12 fresco.
3. Incubar las células en cada placa con 1 mL de la solución de trabajo MitoTracker durante 15 min a 37 °C en la oscuridad.
4. Retire la solución de trabajo MitoTracker y lave 2 veces con DMEM/F12.
5. Agregue 1 mL de DMEM/F12 a cada placa e incube en la incubadora de células antes de la toma de imágenes.

4. Parámetros de imagen para microscopio confocal

1. Preequilibre el microscopio para operaciones posteriores. En el panel de adquisición, ajuste los parámetros relacionados con la trayectoria de la luz configurando las longitudes de onda de excitación y emisión.
2. Configure los parámetros de la siguiente manera: tamaño del agujero de alfiler, 1,2 UA; tamaño de escaneo de píxeles, 1.024 x 1.024; tiempo de permanencia de píxeles, 2,4 μs (promedio 2x)  (manténgalo consistente para fines de calibración).

5. Optimización de los parámetros de imagen

PRECAUCIÓN: Evite la exposición ocular a la radiación directa y dispersa de un láser visible y/o invisible.

1. Utilice la luz halógena para enfocar las células utilizando una lente objetivo apocromática plana de 60x (1,4 NA) para evitar la fototoxicidad.
2. Ajuste la potencia del láser y el alto voltaje (HV) justo por debajo del nivel de saturación, establezca el factor de zoom en 3 y luego capture las imágenes.
3. Mueva la región de interés y enfoque en las celdas para capturar imágenes sin cambiar ninguna configuración.

6. Análisis de datos

NOTA: Los datos se analizaron utilizando ImageJ preinstalado con el plug-in MiNA¹³. Para obtener mediciones precisas y relevantes, las imágenes deben capturar mitocondrias resueltas de forma independiente con tinción limpia y brillante.

1. Para mejorar la calidad de la imagen antes de la transformación binaria y la esqueletización, abra la imagen y realice el procesamiento preliminar. Utilice la herramienta ROI para seleccionar el área de una sola celda. Aplicar el proceso | Filtros | Máscara de enfoque para mejorar la nitidez y utilizar el Proceso | Función de mejora del contraste para reducir la sobreamplificación de ruido. Para eliminar específicamente el ruido de la sal y la pimienta, utilice el Proceso | Filtros | Función mediana (véase la figura complementaria S1).
2. Para construir un modelo morfológico simplificado para calcular parámetros descriptivos, convierta la imagen a binaria mediante umbrales (haga clic en Proceso | Binario | Make Binary), y luego esqueletiza la imagen binaria usando la función Skeletonize (haga clic en Procesar | Binario | Esqueletizar) (ver Figura Suplementaria S2).
3. Agrupe todos los píxeles dentro del esqueleto usando el comando Analizar | Esqueleto | Función Analizar esqueleto (2D/3D). Simplifique el análisis utilizando la herramienta MiNA para calcular nueve parámetros descriptivos en la imagen esqueletizada (consulte la figura complementaria S3).

Resultados

Este protocolo describe un procedimiento detallado, paso a paso, para el análisis morfológico mitocondrial a través de tres módulos de optimización interdependientes: estandarización de los protocolos de preparación de muestras, optimización sistemática de los parámetros ópticos para la obtención de imágenes de microscopía confocal y directrices de procesamiento de imágenes computacionales. Un protocolo óptimo de preparación de muestras es fundamental para obtener datos fiables de imágenes mitocondriales. La evaluación s...

Discusión

El presente estudio establece una metodología sistemática para analizar la morfología mitocondrial en células vivas en condiciones de estrés. Los pasos cruciales del procedimiento en la obtención de imágenes mitocondriales incluyen: una concentración adecuada de sondas MitoTracker, el lavado minucioso de las placas confocales antes de la adquisición de imágenes, la minimización de las perturbaciones en el estado celular y el establecimiento de parámetros de imagen adecuados.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Yoduro de 1-metil-4-fenilpiritinio (MPP+)	Macklin	M875357	Se utiliza para inducir estrés oxidativo
Plato confocal	NIDO	801001	Se utiliza para cultivar las células
Microscopio confocal	Nikon	C2	Se utiliza para capturar imágenes
Mezcla de medios/nutrientes Eagle modificado de Dulbecco F-12	ThermoFisher Scientific	11320033	Se utiliza para proporcionar nutrición a las células
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Tiempo de beyo.	ST038	Se utiliza para disolver la sonda mitotracker
Suero fetal bovino (FBS)	ThermoFisher Scientific	A3161001C	Se utiliza para proporcionar nutrición a las células
ImagenJ	Institutos Nacionales de Salud	ImagenJ	Se utiliza para analizar la morfología mitocondrial
MitoTracker Red CMXRos	ThermoFisher Scientific	M7512	Se utiliza para visualizar mitocondrias
Solución salina tampón de fosfato (PBS)	ThermoFisher Scientific	C10010500BT	Se utiliza para lavar las células en platos confocales
Célula SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266	Se utiliza para demostrar el flujo de trabajo de análisis de la morfología mitocondrial
Adaptador de platina TI-SH-U	Nikon	MEC59110	Se utiliza para asegurar muestras