Preparación mitocondrial de la microglía para el análisis de glicanos

Resumen

Se desarrolló un protocolo para la preparación de mitocondrias purificadas a partir de células microgliales, el aislamiento de proteínas mitocondriales para la liberación de N-glicanos y la detección rápida de glicanos mitocondriales subcelulares mediante ionización por electrospray de desorción láser asistida por matriz infrarroja acoplada a espectrometría de masas de analizador de masas precisa de alta resolución.

Resumen

Comprender los patrones de glicosilación de las proteínas mitocondriales en la microglía es fundamental para determinar su papel en las enfermedades neurodegenerativas. Aquí, presentamos una metodología novedosa y de alto rendimiento para el análisis glicómico de proteínas mitocondriales aisladas de microglía cultivada. Este método implica el aislamiento de mitocondrias a partir de cultivos microgliales, la evaluación de la calidad de las muestras mitocondriales, seguida de una extracción optimizada de proteínas para maximizar la detección de glicanos, y la espectrometría de masas de alta resolución y precisión de masas (HRAM) de ionización por electrospray de desorción láser asistida por matriz infrarroja (IR-MALDESI) para proporcionar perfiles detallados de la glicosilación mitocondrial.

Este protocolo enfatiza la importancia de mantener la integridad mitocondrial durante el aislamiento y emplea un estricto control de calidad para garantizar la reproducibilidad, incluida la medición de la pureza mitocondrial después de la extracción. Este enfoque permite el perfil completo de los cambios de glicosilación en las mitocondrias microgliales bajo diversas condiciones experimentales in vitro, lo que ofrece información sobre los cambios mitocondriales asociados con las enfermedades neurodegenerativas. Este enfoque podría adaptarse a otros tratamientos in vitro , otros tipos de células cultivadas o células primarias. A través de este enfoque estandarizado, nuestro objetivo es avanzar en la comprensión de los glicanos mitocondriales microgliales, contribuyendo al campo más amplio de la investigación neurodegenerativa.

Introducción

La microglía son las células inmunitarias innatas residentes dominantes en el cerebro y representan el 10-15% de las células en el cerebro adulto ^1,2. Utilizan su repertorio de receptores para monitorizar dinámicamente el microambiente cerebral y regular la función cerebral normal para mantener la homeostasis cerebral^. La microglía es muy sensible a los cambios en su microambiente y sufre cambios en la morfología celular, el inmunofenotipo y la función con condiciones patológicas o diversos estímulos. Los estados de activación microglial están influenci....

Protocolo

1. Cultivo de líneas celulares microgliales BV2

1. Mantener las células BV-2 (células microgliales derivadas de ratones C57BL/6) en medios DMEM bajos en glucosa suplementados con un 10% de suero fetal bovino (FBS), un 1% de penicillium-estreptomicina (PenStrep) y un 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA).
2. Cultive las células en matraces T-175 y permita que alcancen un 70-80% de confluencia.
3. Dividir las células incubando con las enzimas de disociación celular durante 5 min a 37 °C en CO₂ al 5%, seguido de la inactivación de las enzimas con un volumen igual de medio celular y cent....

Resultados

La Figura 1 representa un esquema esquemático de los pasos involucrados en el aislamiento de mitocondrias de la línea celular microglial BV2 para el análisis de glicanos por espectrometría de masas. La reproducibilidad del aislamiento de proteínas mitocondriales entre diferentes preparaciones mitocondriales a partir de la misma densidad inicial de las células microgliales se representa en la Figura 2, que no muestra diferencias significativas entre la concentrac.......

Discusión

La microglía son las células inmunitarias residentes del cerebro, y las modificaciones de los glicanos modulan el inmunofenotipo y la función de la microglía. Estas funciones inmunitarias exigen una cantidad sustancial de energía celular, que es suministrada predominantemente por las mitocondrias. En particular, las proteínas mitocondriales también presentan modificaciones de glicanos, que han permanecido significativamente poco estudiadas debido a los desafíos tecnológicos en la investi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipment
Amersham 600 imager	Cytvia	29194217	Generador de imágenes de gel y membrana
Countess 3 contador de células automatizado	Fisher Scientific	X003SZ1LY9
Dry Bath Stdrd 4 blck 100-120V	Thermofisher scientific
i-Blot2 Dispositivo de transferencia de gel	Invitrogen	IB21001	Western blot sistema de transferencia
Microscopio invertido	Cell Treat	04355223EA
Lector		82050-760
Mini tanque de gel	Invitrogen	A25977
Balancín al aire libre	Fisher Marca	88861025
Niño de las pipetas	BioTek	229310
Mezclador de vórtice	Integra- VWR
Reactivos de aislamiento de mitocondrias  Kit de aislamiento mitocondrial
	Thermofisher scientific	89874
Inhibidor de la fosfotasa	Thermofisher scientific
Inhibidor de la proteasa	Thermofisher scientific	Aislamiento 1861281
N-glicano y reactivos IR-MALDESI
Ácido acético	Fisher Scientific	A11350	50% en disolvente ESI
Acetonitrilo	Sigma Aldrich	34851-4L	1 mM en disolvente ESI
Bicarbonato de amonio	Fisher	Scientific A643500	100 mM
	Thermofisher Scientific	A39239	Pierce FlexMix
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	AC426380100	1 M
Yodoacetamida	Sigma Aldrich	A322-10VL
Agua de grado LC/MS	Thermofisher Scientific	047146.M6
PNGase F	Bulldog Bio	NZPP010	75000 U/mL, enzima para la liberación de N-glicanos
<>N-glicano y consumibles IR-MALDESI
Amicon	Fisher Scientific	MWCO de 10 kDa	UFC501024
	Orbitrap Exploris 240
Mid-IR Laser	JGM Associates, Burlington, MA, USA
Portaobjetos de micropocillos de teflón	Prosolia, Indianápolis, IN, USA
strong>N-glicanos softwares
GlycoMod	Experiencia		https://web.expasy.org/glycomod/
GlyConnect	Expasy		https://glyconnect.expasy.org/
Consumibles de aislamiento de proteínas y Western blot
Basix puntas de carga de gel (10 µ L)	Basix	13-611-102
Puntas de carga de gel Basix (200 µ L)	Basix	13-611-116
Raspador de celdas	VWR labs	14-388-100
i-Blot NC pilas regulares	Invitrogen	IB23001
i-Blot2 PVDF Pilas regulares	Invitrogen	IB24001
10  µ L micropipeta	Fisher Scientific	FBE00010
20 µ L micropipeta	Invitrogen	FBE00020
200    µ Micropipeta L	Marca Fisher	FBE00200
1000 µ Micropipeta L	Fisher marca	FBE01000
10    µ Puntas de pipeta L	Laboratorios VWR	76322-528
20  µ Puntas de pipeta	L VWR labs	76322-134
200    µ Puntas de pipeta L	Laboratorios VWR	76322-150
1000  µ Puntas de pipeta L	VWR labs	76322-154
Placa de pocillos	Marca Fisher	14-388-100
Aislamiento de proteínas y reactivos de transferencia occidental
actina (huésped: Conejo)	Cell Signaling Technologies	8457T
Anti-Rabbit IgG HRP Linked	Cell Signaling Technologies	7074S
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus	Invitrogen	NW04120BOX
Bovine Serum Albumin	Fisher biorreactivos	BP9700-100
COXIV anticuerpo (Huésped: Conejo)	Cell Signaling Technologies	4844S
Anticuerpo GAPDH (Huésped: Conejo)	Cell Signaling Technologies	2118S
Kit de ensayo de proteínas MicroBCA	Thermofisher scientific	23235
Nupage MOPS SDS Runing Buffer [20x]	Thermofisher scientific	NP0001
PAGE Regla escalera de proteínas prefabricada	Thermofisher scientific	815-968-0747	Dilución= Uso 7  µ L para cargar en el primer pocillo
Solución salina tamponada con fosfato	Diagnóstico Aniara	A12-9423-5	Prepare 1x PBS a partir de 10x polvo
Sustrato Western Blot Pierce ECL	Thermofisher scientific	32106	Kit de sustrato quimioluminiscente
RIPA Buffer	Thermofisher scientific	89901
Tampón de muestra	Novex	B0007	El tampón de muestra LDS de perno se prepara en una proporción de 3:1 de tampón de muestra a muestra
Tween-20	MP Biomedicals	TWEEN201
Consumibles para cultivo de tejidos
Countess Slides	Avantor	229411
Tubos Eppendorf	Cell Treat	414004-265612-5884
Pipeta de aspiración de 2 mL	Vista lab	5090-0010E
Pipeta serológica de 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Pipeta serológica de 10 mL	Basix	13-678-11E
Pipeta serológica de 25 ml	Vista lab	FB012937
Pipeta serológica de 50 ml	Vista lab	14955233
Tubo cónico de 15 ml	Avantor	229225A
Tubo cónico de 50 ml	Tratamiento celular	4190-0050
T-75 cm2 Matraz de cultivo de tejidos	Fisher Scientific
Matraz de cultivo de tejidos T-180 cm2	Scientific	FB012939
Reactivos para cultivo de tejidos  Línea celular microglial
BV2	Bioarray creativo	CSC-I2227Z	Microglía de ratón inmortalizada (BV2) derivada de la microglía neonatal C57 / BL6
Enzimas de disociación celular	Thermofisher scientific	12563029	TrypLE
Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco para Baja Glucosa Media	Gibco	10567014
Suero fetal bovino	Cytiva	SH30071.03HI
Medio esencial mínimo (MEM) Aminoácidos no esenciales	Gibco	11140050
Penicillium Streptomycin	Cytivia	SV30010
solución salina tampón de fosfato	Corning	21-040-CV
Tinción azul de tripano 0,4%	Invitrogen	T10282

88870003 de microplacas 1861274Solución de calibración Filtros centrífugos Espectrómetro de masas <Anticuerpo de FB012937 Fisher