Análisis multimodal de microplásticos en agua potable mediante una tubería de análisis de nanomembranas de silicio

Summary

Aquí, presentamos un protocolo que muestra un sustrato ópticamente transparente y plano para la captura y el análisis optimizados de partículas contaminantes en el agua potable. Aquí se presenta el Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP): un canal flexible para la captura, cuantificación e identificación de partículas en medios líquidos.

Abstract

El impacto biológico de la contaminación por microplásticos en los alimentos humanos y las fuentes de agua es en gran medida desconocido, y las fuentes de agua potable no están exentas de esta contaminación por microplásticos. Aquí, demostramos un enfoque simplificado para capturar, cuantificar e identificar microplásticos en el agua potable. Presentamos un flujo de trabajo analítico denominado Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP) que aprovecha las nuevas nanomembranas de nitruro de silicio que permiten un "factor de concentración" significativo, que consolida las partículas suspendidas en un área de observación planarizada para el análisis de partículas individualizadas, cuantificables y multimodales en el mismo sustrato. Las principales ventajas de SNAP se derivan de su uso de membranas ultradelgadas a base de nitruro de silicio alojadas en discos de filtro de tamaño convencional, lo que permite la captura y el análisis directos de MP poliméricos sobre un fondo no polimérico. Las muestras de agua potable obtenidas en la región de Rochester, Nueva York, se recolectaron de fuentes de grifos residenciales y se analizaron utilizando SNAP. Las partículas de cada muestra se caracterizaron mediante microscopía óptica y electrónica de barrido (SEM), espectroscopía Raman y espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDX), y se cuantificaron varios componentes identificados en proporción al total de partículas capturadas.

Introduction

Los microplásticos se definen como polímeros sintéticos que miden menos de cinco milímetros de tamaño ^1,2. La contaminación por microplásticos (MP) es una preocupación creciente para la salud humana, el medio ambiente y el medio ambiente. Se ha encontrado contaminación por MP en fuentes de agua de todo tipo; agua dulce, océanos e incluso fuentes de agua potable³. Los MP se generan a partir de la descomposición de las fuentes primarias de plástico⁴, así como de los textiles sintéticos ^5,6,7. Los MP son ubicuos y se han encontrado en tejidos humanos, como la placenta, las heces y la sangre humanas ^8,9,10. Existe un creciente interés en la investigación de los MP, como lo demuestran las más de 4.100 y 4.600 publicaciones en 2023 y 2024, respectivamente (datos de PubMed; palabra clave "microplásticos"), así como una creciente preocupación pública con respecto a la exposición humana a los MP. En respuesta a una creciente preocupación pública, varios organismos reguladores gubernamentales, como el Estado de California¹¹ y varios países de la UE¹², han estado (o estarán) implementando regulaciones sobre los niveles de MP en el agua potable. Teniendo en cuenta todo lo anterior, la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. ha anunciado recientemente que los parlamentarios son un nuevo contaminante de preocupación. Sin embargo, la evaluación del riesgo humano se ve gravemente obstaculizada por la falta de métodos para la detección fiable y reproducible de los MP.

La caracterización de los MP se basa en métodos analíticos como la microscopía óptica y electrónica¹³, y las técnicas espectroscópicas y espectrométricas ^1,14,15 para comprender las características visuales de los MP⁷ y su composición, respectivamente. Las muestras que contienen MP deben incluir múltiples análisis para caracterizar, identificar y cuantificar los MP, y al menos requieren espectroscopía/espectrometría (es decir, espectroscopia Raman, espectroscopia infrarroja o cromatografía de gases-espectrometría de masas por pirólisis, etc.) según los requisitos mínimos de algunas revistas para la medición de plásticos en muestras ambientales, como Science of the Total Environment¹⁶. La espectroscopia Raman es más versátil que la espectroscopia infrarroja (IR), especialmente con respecto a la identificación de materiales en muestras biológicas. La espectroscopia Raman es una técnica de dispersión de luz, lo que le permite analizar partículas más pequeñas más fácilmente que IR, una técnica de absorción de luz que requiere partículas más grandes y tiene más restricciones en la colocación de muestras¹⁷. Se ha sugerido previamente que los sustratos para la espectroscopia Raman que comprenden silicio u óxido de silicio pueden producir resultados fiables con un ruido de fondo mínimo¹⁸.

Los sustratos para ciertas técnicas analíticas que suelen ser compatibles con un tipo de análisis (es decir, los sustratos recubiertos de oro necesarios para la espectroscopia IR) no suelen ser compatibles con la microscopía óptica de transmisión y/o reflectancia. Posteriormente, el submuestreo replicado es popular entre los investigadores para producir muestras apropiadas para cada análisis por separado, pero el submuestreo requiere mucho tiempo y podría excluir partículas de baja abundancia ^1,2,6. Por lo general, las transferencias manuales de partículas de un sustrato a otro son necesarias para analizar la misma partícula para su caracterización e identificación mediante diferentes modalidades analíticas, pero estas transferencias manuales lentas aumentan la probabilidad de sesgo, contaminación y pérdida, además de limitar el análisis de MP solo a las partículas de mayor tamaño que se pueden manipular manualmente¹³. Estos flujos de trabajo subóptimos presentan numerosos desafíos y problemas de confiabilidad, lo que contribuye a la variabilidad significativa en la cuantificación de MP reportada en la literatura ^3,7.

Aquí, presentamos un flujo de trabajo analítico que llamamos Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP) para capturar, caracterizar, identificar y cuantificar MPs, y demostrar la utilidad de SNAP mediante el análisis de muestras de agua potable procedentes de la región de Rochester, Nueva York. El SNAP es posible gracias a discos filtrantes de 25 mm de diámetro de tamaño convencional con nanomembranas de silicio integradas (véase la Tabla Suplementaria S1 para conocer las propiedades de la membrana), que ofrecen un sustrato uniforme para concentrar y analizar los MP del agua potable utilizando múltiples técnicas^15,19. Después de concentrar y capturar secuencialmente MP en nanomembranas con tamaños de corte decrecientes (nitruro de silicio microporoso (MPSN) de 20 μm con poros cilíndricos y nitruro de silicio microrrendido (MSSN) de 8,0 μm con poros de prisma rectangulares), SNAP facilita tres pasos analíticos consecutivos: 1) tinción de muestras, microscopía óptica y cuantificación de MP, 2) identificación de partículas mediante espectroscopía Raman, seguida de 3) caracterización de partículas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), lo que permite múltiples análisis de las mismas partículas capturadas en un sustrato de nanomembrana.

Demostramos múltiples tuberías de SNAP utilizando discos de filtro de nanomembrana de silicio (SiN) sin recubrimiento y discos de filtro de nanomembrana de silicio (Au-SiN) recubiertos de oro: Tubería A) SNAP realizado en SiN y caracterizando secuencialmente los mismos MP a través de múltiples técnicas analíticas; Pipeline B) SNAP realizado en Au-SiN con espectroscopía Raman; y Pipeline C) SNAP realizado en Au-SiN con SEM equipado con espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDX) (Figura 1). Por lo tanto, las variaciones SNAP son flujos de trabajo analíticos flexibles y optimizados que se pueden utilizar para varios tipos de muestras y técnicas analíticas. A diferencia de los métodos publicados anteriormente que se basan en membranas poliméricas¹¹, las ventajas de SNAP se derivan de su uso de nanomembranas de silicio, donde los MP de polímeros sintéticos se capturan en una membrana no polimérica basada en silicio, lo que permite la identificación de la composición de los MP en un fondo no polimérico. Además, las nanomembranas de silicio ofrecen planos focales uniformes a diferencia de las membranas poliméricas, que tienden a arrugarse, lo que permite múltiples técnicas automatizadas de microscopía y espectroscopía.

Previamente caracterizamos el uso de nanomembranas de silicio para análisis de MP mediante modelado analítico, desafíos de partículas modelo y muestras de agua potable y aire^19,20, así como comparando sus propiedades de filtración y microscopía óptica utilizando partículas modelo contra cuatro membranas ampliamente utilizadas¹⁵. En este protocolo, demostramos heurísticamente la utilidad de SNAP para el análisis de MPs en cuatro muestras de agua potable. Las muestras se recolectaron de cuatro fuentes de agua distintas alrededor del área metropolitana de Rochester, Nueva York. Cada muestra incluida en este estudio se originó a partir de una fuente de agua superficial distinta, como el lago Ontario, el lago Hemlock, una mezcla de Hemlock y Ontario, y el lago Canandaigua (Figura 2). Las partículas capturadas de estas fuentes de agua potable incluían plásticos generalizados como el poliestireno (PS) y el polietileno (PE), metales pesados como hierro, sílice y partículas no sintéticas.

Protocol

1. Procedimientos de control de calidad y preparaciones de soluciones ultrapuras

1. Limpieza de capuchas y guantes de flujo laminar
   1. Don EPI (equipo de protección individual): bata de laboratorio 100% algodón y guantes de nitrilo.
      NOTA: El EPP es continuo durante todo el protocolo.
   2. Rocíe los guantes de nitrilo con alcohol isopropílico (IPA) al 99%. Frótese las manos y luego enjuague con ~18 MΩ, 0,22 μm de agua filtrada. Haga esto 3 veces para quitar el agente desmoldante de los guantes.
   3. Dobla una toallita de fibra natural en cuartos, luego rocía con 70% de IPA. Limpie la superficie del capó de atrás hacia adelante con movimientos largos, volviendo a doblar la toallita de trabajo delicada a una superficie no utilizada cada dos pasadas. Continúe limpiando la campana hasta que se hayan limpiado todas las superficies, reemplazando la toallita por una nueva una vez que se haya ensuciado.
   4. Destape la alfombrilla de silicona con rodillo y ruede por la superficie de la cubierta para recoger las partículas restantes. Para limpiar el rodillo de silicona, rocíe con IPA al 99% y frote con una mano enguantada, luego enjuague con agua filtrada de 18 MΩ y 0,22 μm. Repita 3 veces, luego deje secar al aire en el capó.
   5. Vuelva a enjuagar los guantes como en el paso 1.1.2.
2. Generación de agua ultrapura e IPA.
   1. Llene un vaso de precipitados de 1 L con 18 MΩ de agua y colóquelo en la campana.
   2. Prepare una jeringa de 60 mL y un filtro de jeringa de corte de 0,22 μm filtrado al menos 200 mL de agua de 18 MΩ a través de la jeringa y el filtro adjunto.
      NOTA: Una bomba de jeringa ahorrará tiempo, pero no es un requisito para llevar a cabo el protocolo descrito.
   3. Enjuague un recipiente de vidrio con tapón de rosca 3 veces con 18 MΩ, 0,22 μm de agua filtrada. Llene con 0,22 μm de agua filtrada por jeringa de 18 MΩ.
   4. Repita los pasos 1.2.1-1.2.3 con la concentración deseada de % de IPA en lugar de 18 MΩ, 0,22 μm de agua filtrada para generar IPA ultrapuro.

2. Captura de partículas a partir de muestras líquidas mediante filtración

NOTA: El protocolo a continuación se puede utilizar con muestras líquidas que no sean agua. Los métodos validados de recolección de muestras deben dejarse a discreción del investigador en función de las necesidades de su estudio y de la muestra.

1. Póngase el EPP.
   NOTA: Asegúrese de que los guantes y las superficies de la capucha se limpien de acuerdo con los pasos 1.1.2-1.1.5.
2. Rocíe una junta de silicona con Ultrapure 99% IPA, frote con los dedos enguantados y luego enjuague con agua ultrapura. Repita esto 3 veces para cada junta.
   NOTA: El número de juntas que se utilizarán en la filtración es igual al número de discos de filtro que se utilizarán, más 1. Consulte la Figura 1B para ver el gráfico de ensamblaje visual.
3. Utilizando la jeringa cebada en el paso 1.1.2, enjuague el interior de la jeringa de 60 ml con agua ultrapura tomando 30 ml de agua ultrapura y 30 ml de aire en la jeringa. Enrosque un filtro de jeringa, luego agite vigorosamente y dispense. Repita esto 3 veces.
   NOTA: Se puede utilizar cualquier tamaño de jeringa según sea necesario según el volumen de la muestra.
4. Ensamble el aparato de filtración como se muestra en el gráfico de ensamblaje visual en la Figura 1B.
   NOTA: Utilice pinzas limpias para manipular los discos de filtro y las juntas durante el montaje y desmontaje.
   1. Para filtraciones secuenciales, asegúrese de que haya una junta entre el disco y la frita de soporte, una junta entre cada disco y una junta entre el disco y el embudo de filtración.
   2. Asegúrese de que los discos estén ordenados con el filtro de corte más grande en la parte superior de la pila y el filtro de corte más pequeño en la parte inferior.
5. Encienda la aspiradora en el aparato para que haya un flujo negativo a través de la pila de discos del filtro.
6. Medición de la contaminación de fondo
   NOTA: El siguiente proceso permite una evaluación de la limpieza de la jeringa y la generación de medios ultrapuros, y una determinación de las partículas de fondo aportadas por los componentes del sistema.
   1. Con la jeringa enjuagada, dispense 50 ml de agua ultrapura lentamente sobre la nanomembrana en el centro del disco superior para asegurarse de que se filtre todo el líquido dispensado.
      NOTA: Si filtra volúmenes de muestra más grandes (es decir, >50 mL), se sugiere un embudo de filtración de vidrio. Limpie el embudo de filtración de vidrio como en el paso 2.3. El material de laboratorio adicional puede incurrir en un riesgo adicional de contaminación por partículas. Mantenga la diligencia con los procedimientos de limpieza y siempre confirme la limpieza con filtraciones en blanco antes de usar las muestras de interés.
   2. Deja que el agua ultrapura se filtre. Mantenga la aspiradora encendida durante un minuto adicional después de la filtración. Una vez que la muestra esté completamente seca, apague la aspiradora.
   3. Retire con cuidado los discos del filtro de las juntas con pinzas limpias y coloque los discos en el recipiente limpio y etiquetado adecuado para su almacenamiento, como una placa de Petri de vidrio o una caja oscurecida.
   4. Visualice los discos de filtro bajo microscopía para análisis óptico, conteo de partículas, etc.
7. Para muestras líquidas, limpie una junta adicional como en el paso 2.2. Obtenga una jeringa nueva para cada muestra única de medio líquido y repita el paso 2.3.
8. Tome la cantidad deseada de muestra y dispense la muestra lentamente sobre la nanomembrana en el centro del disco superior.
9. Una vez completada la filtración de la muestra, realice enjuagues 3 veces con 1 ml de agua ultrapura para asegurarse de que todas las partículas de la muestra se hayan enjuagado lo suficiente de todas las superficies sobre la membrana en el centro del disco de filtro.
10. Mantenga la aspiradora encendida durante un minuto adicional para secar completamente la muestra enjuagada 3 veces, luego apague la aspiradora.
    1. Repita los pasos 2.7 a 2.10. para cada réplica a realizar de la muestra de interés.

3. Preparación y tinción de tintes fluorescentes

NOTA: La tinción fluorescente con rojo del Nilo y/o azul de tripano puede interferir con los láseres de espectroscopia Raman de interés.

1. Tinción con rojo del Nilo (NR)
   1. Póngase el EPP.
   2. Limpie los guantes y la capucha como en los pasos 1.1.2-1.1.5.
   3. Complete la filtración de la muestra como se describe en los pasos 2.7-2.10.
   4. Enjuague dos recipientes de vidrio con tapón de rosca con agua ultrapura 3 veces.
   5. Prepare una solución de 0,1 mg/ml de NR en Ultrapure 99% IPA en un recipiente de vidrio limpio.
   6. Invierta suavemente 10x para mezclar.
   7. Filtre la solución NR con un filtro de jeringa de 0,22 μm en el segundo recipiente de vidrio con tapón de rosca.
      NOTA: El filtro utilizado para prefiltrar el NR debe tener un corte más pequeño que el filtro utilizado para filtrar las muestras.
   8. Coloque el disco filtrante que se va a teñir sobre la frita de soporte del matraz de recolección de vacío.
   9. Pipetear 20 μL de la solución de NR de 0,1 mg/mL en la nanomembrana en el centro del disco filtrante.
      NOTA: El tinte debe cubrir completamente la superficie porosa de la nanomembrana. Si 20 μL no son suficientes, agregue tinte adicional hasta que todas las áreas porosas de la nanomembrana estén adecuadamente cubiertas de tinte.
   10. Incuba la mancha durante 5 min.
   11. Filtra la mancha al vacío una vez que se complete la incubación.
   12. Enjuague 3 veces con 1 ml de Ultrapure 99% IPA para eliminar cualquier mancha de NR excesiva.
       NOTA: Proceda a la sección de tinción de azul de tripano a continuación después de este paso si se va a realizar la contratinción.
   13. Deje que el disco del filtro se asiente sobre la frita de soporte con la aspiradora encendida durante 2 minutos para filtrar y secar cualquier líquido residual. Si no está seco después de 2 minutos, transfiera el disco del filtro con una placa de Petri de vidrio limpio a un horno a 70 °C durante 2-5 minutos.
   14. Una vez seco, realice la microscopía de fluorescencia como se describe en el paso 2.6.4 y continúe con la sección 4.
2. Tinción con azul de tripán (TB)
   1. Póngase el EPP.
   2. Limpie los guantes y la capucha como se indica en los pasos 1.1.2-1.1.5.
   3. Complete la filtración de muestras de los pasos 2.7-2.10 o comience con el paso 3.2.4.
   4. Enjuague dos recipientes de vidrio con tapón de rosca con agua ultrapura 3 veces.
   5. Prepare la tinción de TB al 0,4% en un recipiente.
      NOTA: El filtro utilizado para prefiltrar el TB debe tener un límite más pequeño que el filtro utilizado para filtrar las muestras.
   6. Invierta suavemente 10x para mezclar.
   7. Filtre la solución para la tinción de TB con un filtro de jeringa de 0,22 μm en el segundo recipiente de vidrio con tapón de rosca.
      NOTA: El filtro utilizado para prefiltrar el TB debe tener un límite más pequeño que el filtro utilizado para filtrar las muestras.
   8. Coloque el disco filtrante que se va a teñir sobre la frita de soporte del matraz de recolección de vacío.
   9. Pipetear 20 μL de la tinción de TB al 0,4% en la nanomembrana en el centro del disco filtrante.
      NOTA: El tinte debe cubrir completamente la superficie porosa de la nanomembrana. Si 20 μL no son suficientes, agregue tinte adicional gota a gota hasta que todas las áreas porosas de la nanomembrana estén adecuadamente cubiertas por la mancha.
   10. Incuba la mancha durante 5 min.
   11. Filtra al vacío la mancha después de incubar durante 5 min.
   12. Enjuague con volúmenes de 1 mL de agua ultrapura 3 veces.
   13. Deje que el disco del filtro se asiente sobre la frita de soporte con la aspiradora encendida durante 2 minutos para filtrar y secar cualquier líquido residual. Si no está seco después de 2 minutos, transfiera el disco del filtro con una placa de Petri de vidrio limpio a un horno a 70 °C durante 2-5 minutos.
   14. Una vez seco, realice la microscopía de fluorescencia como se describe en el paso 2.6.4 y continúe con la sección 4.

4. Cuantificación de partículas mediante microscopía de fluorescencia

1. Captura de imágenes de microscopía óptica
   1. Inmovilice el disco de filtro en un portaobjetos de microscopio con una junta de silicona, o utilice un portaobjetos de alineación específico para el uso del disco de filtro con una platina de microscopio. Mueva el disco de filtro que se va a fotografiar a la etapa del microscopio.
   2. Obtenga una imagen de la nanomembrana utilizando iluminación de campo claro para que los recuentos máximos detectados sean ~ 90% del rango máximo de la cámara detectora.
      NOTA: Este valor del 90% es ~59.000 para un detector de 16 bits con niveles de blanco de 65.535.
   3. Visualice la nanomembrana utilizando iluminación fluorescente para que las intensidades máximas de píxeles sean de alrededor de ~ 25% del alcance máximo de la cámara detectora.
   4. Guarde la imagen en un formato TIFF compuesto de 16 bits.
2. Cuantificación de partículas mediante microscopía de fluorescencia
   1. Utilizando la plataforma de análisis de imágenes, separe los canales fluorescentes del TIFF compuesto generado en 4.1.4 del canal de campo claro utilizando la función Split-Channels .
   2. Umbral de las intensidades de píxel mediante la función Umbral a un valor de 10.000.
      NOTA: Si hay floración en las partículas, el umbral es demasiado bajo y debe aumentarse.
   3. Guarde una imagen separada en formato PNG.
   4. Desmota la imagen para eliminar los píxeles de ruido con la función Despeckle .
   5. Cuenca hidrográfica de la imagen mediante la función Cuenca hidrográfica .
      NOTA: Esta función separa las partículas adyacentes de un tamaño similar, a costa de romper las partículas contiguas grandes en pedazos más pequeños. Como a menudo hay muchas más partículas pequeñas que partículas grandes, esto puede ser una buena compensación, pero puede tener efectos no deseados, como romper fibras largas en hebras de partículas pequeñas. Inspeccione los resultados de la imagen antes de aceptar los datos.
   6. Establezca la escala de las imágenes fluorescentes con umbral midiendo el ancho de un poro en la imagen de campo claro. Utilice el ancho de poro medido para establecer la escala en píxeles/μm.
      NOTA: Para poros rectangulares, el ancho más pequeño coincidirá con la etiqueta del producto. En el caso de los poros circulares, el diámetro coincidirá con la etiqueta del producto que especifica el tamaño de poro (es decir, el corte) de la nanomembrana.
   7. Aplique la función Contar partículas de la plataforma de análisis de imágenes a la imagen fluorescente con umbral, evaluando el área, el mín. y el máx.
   8. Procese las imágenes fluorescentes y de campo claro para crear compuestos que visualicen los dominios fluorescentes.
   9. Umbral de la imagen fluorescente utilizando el mismo valor que en el paso 4.2.2.
   10. Fusionar canales utilizando la plataforma de análisis de imágenes. Asigne el canal fluorescente al canal rojo y la imagen de campo claro al canal grises .
   11. Guarde la composición como un archivo PNG.

5. Espectroscopía Raman

1. Encienda el instrumento Raman y su computadora asociada, permitiendo que cada uno se inicie.
2. Abra el software en la computadora conectada al instrumento Raman.
3. Cuando se inicialice el software, asegúrese de que la actividad actual del sistema y el estado del detector en la cinta inferior de la pantalla del programa sean Listo y de color verde, respectivamente.
4. Si el botón de autocalibración (AC) en la parte inferior de la pantalla está rojo, ejecute la autocalibración deseada y deje que finalice antes de continuar.
5. Si solo utiliza un láser y una rejilla:
   1. Haga clic en Salir en la pantalla Autocalibración, luego seleccione el láser y la rejilla deseados de sus respectivas listas desplegables en Configuración del instrumento en la pestaña Adquisición .
   2. Regrese al botón rojo AC en la parte inferior de la pantalla y haga clic en Láser / Rejilla actual y permita que se ejecute la rutina de calibración.
6. Si utiliza todos los láseres y rejillas, simplemente seleccione Todos los láseres y rejillas y deje que el sistema funcione.
7. Si utiliza más de un láser y/o rejilla, seleccione los láseres/rejillas personalizados y seleccione todas las configuraciones deseadas. A continuación, permita que se ejecute la calibración.
8. Seleccione el objetivo de distancia de trabajo larga (LWD) de 20x en la torreta del instrumento y, dentro del software, en Configuración del instrumento en la pestaña Adquisición .
9. Si este objetivo no está disponible, utilice un objetivo alternativo de bajo aumento (por ejemplo, 5x o 10x) con una distancia de trabajo que se adapte a la altura del disco de filtro.
   NOTA: Comience con un objetivo de aumento más bajo para facilitar la navegación inicial a través de la nanomembrana del disco de filtro.
10. Coloque el disco de filtro en la platina del microscopio de modo que quede dentro de la trayectoria óptica.
11. Haga clic en Adquisición de vídeo en la cinta superior para activar la óptica de visualización.
12. Utilice las ruedas de enfoque grueso y fino del instrumento para enfocar la nanomembrana del disco de filtro.
13. Cuadra aproximadamente los poros con las líneas del cursor de puntos en la pantalla de la computadora.
14. Gire suavemente el disco de filtro en la platina para lograr esta alineación cuadrada, o utilice un portaobjetos de alineación específico para el uso del disco de filtro en una etapa de microscopio.
15. En la pestaña Adquisición en la parte superior derecha, asegúrese de que el modo de iluminador seleccionado sea Campo oscuro para obtener mejores resultados.
16. Para adquirir una imagen unida, vaya a la pestaña Vídeo de la cinta Pestañas de datos.
17. Navegue hasta el primer campo de visión deseado, luego haga clic en el botón Mosaico en la parte superior derecha de la ventana de video y agregue al mapa. Navegue hasta la esquina exterior opuesta del área deseada con el joystick del instrumento y agréguelo al mapa.
18. Ejecute la adquisición de mosaicos con ViewSharp para asegurarse de que todas las áreas estén correctamente enfocadas en la imagen final.
    NOTA: Los objetivos de mayor aumento tardarán menos tiempo en adquirir el mosaico de imágenes, mientras que los objetivos de mayor aumento tardarán más.
19. Una vez que se haya creado el mosaico de imágenes, haga clic con el botón derecho en la imagen y presione Enviar a ParticleFinder.
20. Vaya a la pestaña ParticleFinder en la cinta superior derecha para interactuar con la configuración de umbrales.
21. Para asegurarse de que se seleccionan las partículas adecuadas, haga clic con el botón izquierdo en Imagen en la pestaña de datos de ParticleFinder para marcar las casillas Centro, Partícula y Transparencia . Establece el control deslizante de transparencia en 50% y el tamaño de píxel de Centro en 2px.
    NOTA : La selección Centro colocará un punto en el centro de cada partícula, y la selección de Partícula colocará una superposición sobre cada área que se determine como partícula, con una transparencia del 50%. Estos ajustes localizarán cada partícula y definirán los bordes de cada partícula.
22. Si es necesario, edite los parámetros de umbral de partículas y selección de morfología/tamaño en la pestaña ParticleFinder en el lado derecho del programa para asegurarse de que todas las partículas y sus parámetros de tamaño/forma se identifiquen correctamente. Consulte la Tabla complementaria S2 para ver un ejemplo de cómo se pueden aplicar los parámetros morfológicos.
    1. Si la detección automática de partículas no es suficiente, cambie a manual y ajuste gradualmente los valores de umbral hasta que la mayoría de los objetos correctos se identifiquen como partículas.
    2. Si la morfología de las partículas detectadas necesita un mayor refinamiento, marque la casilla situada junto a Aplicar filtros morfológicos. Seleccione los parámetros adecuados y sus intensidades en los menús desplegables resultantes.
       NOTA: El orden en el que se seleccionan los parámetros puede afectar a la salida.
23. Si el tamaño, la forma u otras cualidades morfológicas de las partículas son factores críticos, marque la casilla situada junto a Aplicar prefiltro de partículas y, a continuación, seleccione y edite los parámetros según sea necesario.
24. Una vez que se hayan identificado las partículas y sus formas/bordes seleccionados sean aceptables, navegue por la lista de vista previa desplazable de imágenes de partículas en la sección Resultados . Seleccione la(s) partícula(s) de interés haciendo clic en la imagen de partícula asociada.
25. Encienda la vista en vivo con el botón de la cámara de video en la parte superior de la pantalla.
26. Cambie al objetivo LWD de 50x haciendo clic en el número de aumento y seleccionando el objetivo correspondiente en el menú desplegable, dentro de la aplicación en la cinta inferior.
27. Vuelva a enfocar la(s) partícula(s) con la perilla de ajuste fino, si es necesario.
28. Capture imágenes de partículas individuales para analizarlas con espectroscopía Raman y guarde las imágenes como archivos separados con los nombres apropiados.
29. Asegúrese de que el área deseada de la partícula que se va a analizar con espectroscopia Raman esté colocada correctamente debajo de la ubicación del rayo láser.
30. Una vez que se selecciona el área adecuada de la partícula para el análisis, presione el botón DETENER TODO en la parte superior de la ventana para desactivar la óptica de visualización.
31. Ajuste el láser a 532 nm, al 1% de potencia para partículas no teñidas, y a 785 nm u 830 nm para partículas teñidas con fluorescente.
32. Establezca el tiempo de adquisición en 10 s y las acumulaciones en 5.
33. Seleccione la pestaña Espectros en el menú de pestañas de datos, luego presione el botón de reproducción para iniciar la visualización en tiempo real (RTD).
    NOTA: Utilice la información obtenida durante RTD para optimizar la configuración.
34. Una vez que esté satisfecho con la configuración y los resultados, presione DETENER TODO para detener el RTD.
35. La adquisición final ahora se puede recoger pulsando el botón circular de Adquisición de Espectro junto al botón RTD.
36. Guarde los espectros recopilados como archivos separados con los nombres apropiados.
37. Repita los pasos 5.28 a 5.36. por cada partícula de interés.
38. Cuando termine con la muestra, retire el disco de filtro y devuelva el objetivo al 20X LWD tanto manualmente en el visor como dentro del software.
39. Repita los pasos 5.10-5.37 para las muestras nuevas.

6. Identificación espectral

1. Si no está disponible una base de datos espectral Raman comprada o construida por uno mismo, navegue a la biblioteca de espectroscopia de código abierto en: https://www.openanalysis.org/openspecy/
   NOTA: OpenSpecy es una base de datos de espectroscopía Raman e IR de código abierto que incluye 636 espectros de tres bibliotecas diferentes de 276 polímeros y materiales aplicables a la identificación de MP y fibras ambientales²¹. Los datos espectrales preprocesados y posprocesados son igualmente viables para su uso con este recurso.
2. Guarde los espectros Raman como archivos .csv individuales.
   1. Etiquete la columna A como número de onda seguido de los números de onda de los espectros, y la columna B debe etiquetarse como Intensidad seguida de los valores de intensidad máxima por número de onda.
3. Abra los espectros arrastrando y soltando el archivo .csv en la barra de exploración en la parte superior izquierda.
4. Activa el preprocesamiento y la identificación.
5. En Preprocesamiento, active Ruido de señal de umbral, Normalización mín.-máx., Suavizado/Derivado, Números de onda conformes y Corrección de línea base.
   NOTA: Los ajustes específicos pueden ajustarse en función de las características individuales de los espectros que se están analizando.
6. En Identificación, seleccione Raman como tipo de espectro y Derivado como Transformación de biblioteca.
   NOTA: Esta biblioteca también se puede utilizar para espectroscopia IR. La ventana de análisis mostrará un espectro blanco, el espectro cargado para el análisis, y un espectro rojo, la coincidencia de identificación sospechosa.
7. Con cualquier espectro que no devuelva una coincidencia r > 0,70, o correlaciones razonables de forma de pico, utilice los 5 primeros resultados sugeridos como un lugar para comenzar a investigar posibles coincidencias según prefiera.
8. Asegúrese de que los valores de pico medidos estén dentro de los números de onda de ±10 de un pico correspondiente en los espectros de referencia seleccionados antes de confirmar una coincidencia para ese pico.
9. Registre las correlaciones espectrales, sus valores de correlación y la base de datos de la que se origina la coincidencia sospechosa.
10. Descargue los archivos según las necesidades individuales.

7. Microscopía electrónica de barrido

NOTA: Si no hay un recubrimiento metálico del disco del filtro antes del análisis SEM, pase a la sección 7.2.

1. Recubrimiento metálico de muestras para SEM
   1. Monte el disco del filtro en un trozo de acero SEM con cinta de carbón.
   2. Insértelo en un pulverizador catódico y bombee la cámara hasta 50 mTorr.
   3. Abra la válvula de aislamiento de Ar (argón) por pulverización catódica.
   4. Purgue el sistema introduciendo Ar en la cámara a través de una válvula de aguja a una presión de 300 mTorr, luego evacúe la cámara hasta 50 mTorr. Repita 3 veces.
   5. Ajuste la presión final a 100 mTorr a través de una válvula de aguja.
   6. Usando un objetivo de Au, deposite Au en el disco de filtro a través de la pulverización catódica.
      NOTA: Alternativamente, se pueden utilizar otras fuentes objetivo (por ejemplo, Pt, Ir, Si, etc.) en lugar de Au; La corriente de 20 mA produce 0,1 Angstroms/s de deposición a 100 mTorr.
   7. Ventile el sistema y retire el disco del filtro. Mantenga el disco del filtro adherido al trozo de acero inoxidable.
2. Captura de imágenes SEM
   1. Fije el muñón al soporte Zeiss Auriga de varias etapas con un tornillo de fijación.
   2. Encienda el SEM y los equipos que lo ejecutan, y permita que cada uno se inicie.
   3. Abra el software adjunto al SEM.
   4. Verifique que el sistema esté bajo vacío (5e-6 Torr).
   5. Ventile el bloqueo de carga presionando Vent en el cuerpo principal de la cámara del bloqueo de carga y abra el bloqueo de carga.
   6. Monte el soporte de varias etapas en la plantilla de inserción recubierta de teflón y fije el brazo de transferencia con la placa de tornillo adjunta.
   7. Cierre el bloqueo de carga y bombee hacia abajo el bloqueo de carga presionando Almacenar en el cuerpo principal de la cámara de bloqueo de carga.
      NOTA: La finalización se produce cuando las luces verdes dejan de parpadear en el botón Tienda .
   8. Cargue el soporte multietapa en la platina de la cámara de observación principal abriendo la puerta de transferencia.
   9. Presione Transferir en el cuerpo principal del bloqueo de carga. La puerta caerá y expondrá la cámara interior.
   10. Inserte el brazo de bloqueo de carga (atornillado en el soporte multietapa) y fije el soporte multietapa a la plataforma.
   11. Desatornille el brazo de transferencia de bloqueo de carga y retraiga el brazo completamente para que resida en el bloqueo de carga.
   12. Cierre la puerta de transferencia pulsando Transferir.
   13. Abra la válvula de aislamiento pulsando EHT en la esquina inferior derecha del software.
   14. Ajuste la distancia de trabajo para que sea de 5 mm en la zona de datos del software y el voltaje de aceleración para que sea de 20 kV.
   15. Localice la membrana del disco filtrante con los joysticks XY y Z.
   16. Levante el escenario con el joystick Z hasta que la imagen quede enfocada.
   17. Corrija el astigmatismo ajustando las perillas del estigma XY y la rueda de enfoque en la consola central.
   18. Visualice las partículas de muestra con el aumento deseado ajustando la rueda de aumento en la consola central, capturando imágenes con una resolución de 2.048 x 1.536 en formato tiff de 8 o 16 bits.
3. Análisis de partículas EDX
   1. Apague el CCD de ChamberScope en el escritorio de la computadora SEM.
      NOTA: Si este paso no se completa, el detector EDX se verá abrumado por la señal y no se registrarán datos.
   2. Enfríe el detector EDX abriendo el software APEX EDX en la computadora EDX, encendiendo el detector en el menú de la esquina superior derecha.
   3. Capture una imagen SEM de baja resolución que se pueda utilizar para el mapeo, haciendo clic en Capturar imagen.
   4. Abra el menú de la pestaña Mapeo en la parte superior de la pantalla del software.
   5. En Configuración, ajuste la resolución (256 x 256) y el tiempo de permanencia de píxeles (0,16 μs) y el número de fotogramas (32-64) para proporcionar un tiempo estimado de captura que debe ser de ~5 minutos de duración.
   6. Haga clic en Crear mapa en la esquina superior izquierda del menú.
   7. Seleccione Confirmar vista previa de elementos para ajustar manualmente la búsqueda de elementos, o confíe en los picos identificados automáticamente del software.
   8. Genere un informe utilizando la función AutoReport en la sección superior derecha del software de mapeo al finalizar.

Results

Piezas en bruto de proceso y contaminación de fondo
Un resultado aceptable en blanco es aquel que no contiene partículas o contiene tan pocas partículas que la contaminación de fondo (es decir, del proceso) (si la hay) no tiene una alta probabilidad de confundir o interrumpir los resultados del experimento. Un resultado en blanco subóptimo es aquel que contiene muchas partículas que las partículas de interés serán difíciles de distinguir de la contaminación de fondo.

El nivel aceptable de contaminación del proceso debe ser igual o lo más cercano posible a cero, pero si no se puede lograr cero, entonces la consistencia en el número de partículas de fondo observadas es clave. Ejecute varias muestras en blanco para determinar la coherencia de los resultados. La diligencia en los protocolos de control de calidad (consulte la Sección 1), la mitigación de la contaminación y las condiciones ambientales adecuadas durante el procesamiento son primordiales para mantener bajos niveles de contaminación de fondo. Los resultados de contaminación de fondo y la aceptabilidad también pueden depender en gran medida del corte de las nanomembranas que se utilicen y de la limpieza general de las condiciones de laboratorio. Tenga en cuenta que cuando se analizan partículas más pequeñas con membranas de corte más bajas (por ejemplo, < 8 μm), la abundancia relativa de las partículas de interés y los contaminantes de fondo de tamaño similar aumentarán exponencialmente, lo que requerirá la aplicación de niveles más estrictos de control de calidad²². Si bien cualquier nivel de contaminación no es aceptable, siempre que las condiciones estén estrictamente controladas y se logre un alto grado de consistencia, aún se pueden realizar buenos análisis de microplásticos ambientales o análisis de interés.

Filtración de muestras
Se necesita una filtración de muestra ideal para generar un análisis multimodal fiel, como se muestra con la cascada de datos de ejemplo en la Figura 3. Dicha filtración de muestras dará como resultado partículas bien dispersas a través de la superficie de la nanomembrana (por ejemplo, con aproximadamente un tercio de la cobertura del área de superficie de la membrana). Las partículas mal dispersas, como el caso de la agregación de partículas (grandes grupos de partículas superpuestas), confundirán los métodos de recuento de partículas manuales y automatizados, ya que las partículas superpuestas no se diferencian fácilmente con confianza. Por lo general, estos datos se excluyen del análisis, lo que puede llevar a la pérdida de información valiosa de interés. Las partículas bien dispersas, como se muestra en la Figura 4A, B, garantizan que cualquier análisis espectroscópico o de cuantificación no se complique por partículas apiladas o superpuestas de diferentes composiciones, que podrían arrojar resultados que son más difíciles de interpretar, identificar y cuantificar con precisión.

Tinción de rojo del Nilo y azul de tripán
En la Figura 3B se muestran imágenes representativas de instancias óptimas de tinción de partículas fluorescentes en un disco de filtro de SiN cortado de 20 μm. El enjuague insuficiente de la tinción NR o TB de la superficie de la nanomembrana puede crear resultados falsos positivos. Las partículas residuales que se componen de cualquiera de las manchas retenidas en la superficie de la membrana debido a un enjuague insuficiente pueden interpretarse erróneamente como partículas manchadas. Una señal de que se ha producido un enjuague insuficiente es si las áreas de la nanomembrana sin partículas o películas/residuos residuales detectables de la muestra filtrada están fluorescentes durante la observación, como se muestra en la Figura 5A. Después de la toma de imágenes, siempre que el disco del filtro se haya mantenido en condiciones limpias, se puede realizar un nuevo enjuague colocando el disco del filtro de nanomembrana individual nuevamente en el aparato de filtración al vacío (menos las juntas), encendiendo el vacío y filtrando otro volumen de IPA ultrapuro al 99% (para NR) o agua ultrapura (para TB) en la nanomembrana del disco de filtro. Registre el volumen total de los medios de enjuague adicionales utilizados. Para obtener los mejores resultados, tome imágenes de microscopía de toda la superficie de la nanomembrana antes de volver a enjuagar para tener en cuenta cualquier contaminación en la que pueda incurrir el paso de reenjuague.

Espectroscopía Raman
La espectroscopia Raman realizada en SiN no recubierto puede producir un pico prominente dependiendo de la longitud de onda del láser, y este pico puede enmascarar señales de baja abundancia aproximadamente dentro de la región²³ del número de onda de 520 ^cm-1. Si los espectros Raman de interés están suficientemente separados del pico de fondo de silicio o nitruro de silicio, el uso de discos de filtro de SiN no recubiertos debería producir resultados adecuados de espectroscopia Raman. En este informe, las canalizaciones B y C usaban discos de filtro Au-SiN. El recubrimiento de oro de Au-SiN enmascara el pico de Si inherente, lo que permite que los espectros de baja abundancia se recojan de manera más confiable cerca o a números de onda de 520 ^cm-1. Además, el Au-SiN se puede utilizar con espectroscopia IR si no se dispone de Raman. Comience siempre con los ajustes de potencia más bajos (es decir, la intensidad del láser) en el instrumento y luego aumente gradualmente, ya que algunas partículas de interés pueden ser frágiles, como las partículas oxidadas, y pueden ser dañadas o destruidas por el láser.

Al analizar partículas elegidas con espectroscopia Raman, es crucial determinar la fiabilidad de un espectro devuelto. Algunas partículas pueden autofluorescencia, y esta fluorescencia agregará ruido a la medición espectral que puede enmascarar o complicar la interpretación de la señal de partículas. Este ruido tomará la forma de una banda de alta intensidad que abarca una amplia gama de números de onda, combinando los datos subyacentes. Los espectros adecuados, demostrados en la Figura 3C y la Figura 4C,D, incluso antes de la corrección de la línea de base, tendrán picos claramente definidos en intervalos más cortos de números de onda. Si no surgen picos que sean al menos tres veces más grandes que cualquiera de las señales circundantes, entonces es probable que los espectros recopilados sean ruido de fondo o que se requieran diferentes configuraciones de instrumentos para analizar la partícula en cuestión. Asegúrese de seleccionar la longitud de onda láser adecuada para cada muestra. Los láseres de longitud de onda más baja, como un láser de 532 nm, no pueden manejar suficientemente la señal generada por la fluorescencia. Un láser de longitud de onda más alta, como un láser de 782 nm o 830 nm, puede ignorar suficientemente la fluorescencia para devolver un espectro. Dependiendo del tipo de muestra, diferentes láseres serán adecuados para diferentes tipos de partículas y, si es posible, pueden intercambiarse durante la recopilación de datos en un solo disco de filtro.

Para determinar la composición de las partículas, sus espectros recogidos se comparan con los de una base de datos de espectros de referencia. La identificación fiable de un espectro de partículas dado producirá un coeficiente de Pearson (r) superior al 70% (r > 0,70). Los datos Raman subóptimos se muestran en la Figura 5B, donde se < 0,70. Los resultados de la identificación de MP son útiles para determinar las fuentes potenciales de contaminación por MP. Para mostrar los resultados de la identificación de partículas, se puede mostrar una imagen y espectros de la partícula analizada como en la Figura 3C y la Figura 4C.

Microscopía electrónica de barrido
Tanto los discos filtrantes de SiN como de Au-SiN son compatibles con SEM inmediatamente después de la captura de partículas por filtración. Si los discos de filtro de SiN no están recubiertos con Au o Pt antes del SEM y después de la captura de partículas, algunas partículas pueden ser más fácilmente "cargadas" por el haz de ionización del SEM, lo que puede hacer que la partícula brille o parezca muy brillante en las imágenes. Este brillo/resplandor puede causar problemas con la visualización debido a un contraste deficiente, como enmascarar la morfología de la partícula. Para mitigar, realice microscopía óptica/fluorescencia y espectroscopía Raman antes de SEM para marcar cualquier partícula pequeña o difícil de analizar de interés para un análisis SEM/EDX posterior, luego cubra la nanomembrana con Au o Pt como se describe en la sección 7 del protocolo, y realice SEM/EDX.

El recubrimiento de SiN o Au-SiN con Au o Pt después de la captura de partículas y antes del análisis SEM ayuda a prevenir este efecto de carga durante la obtención de imágenes, ya que las partículas ya no son susceptibles a la ionización debajo de la capa de metal eliminada. Este recubrimiento mejora el contraste y la resolución, por lo que se puede obtener una mayor comprensión morfológica de una partícula determinada, como se ve en la Figura 3D (fibra vs fragmento) o morfologías superficiales, como hoyos y fisuras en partículas oxidadas. Las partículas de recubrimiento metálico antes del análisis SEM impedirán permanentemente que se analicen más con espectroscopia o imágenes de fluorescencia, lo que hace que solo sean posibles los análisis SEM/EDX. Por lo tanto, el recubrimiento de las partículas y la realización de SEM/EDX deben ser los pasos finales de cualquier proceso si se pretende.

Las mediciones de EDX se pueden realizar en partículas capturadas tanto antes como después del recubrimiento metálico. EDX puede revelar la composición elemental específica de una partícula o área determinada, que se combina bien con cualquier partícula que sea más pequeña que el límite de tamaño de detección para el análisis Raman, o composiciones elementales que pueden ser difíciles de analizar con ciertas longitudes de onda de láser Raman, como metal, aleaciones, partículas saturadas de agua y partículas que emiten una fuerte fluorescencia cuando se exponen a los rayos láser Raman disponibles para su uso. En este estudio, las partículas se recubrieron con una capa de Au de 6 nm de espesor. Las imágenes SEM se realizaron con un aumento de 200x-3.000x con una potencia de haz de 20 kV y una distancia focal de 5 mm. Las respectivas imágenes SEM de las partículas seleccionadas se muestran en la Figura 3D.

Los resultados representativos de EDX se muestran en la Figura 3F. Los elementos detectados con un peso porcentual inferior al 1% pueden considerarse traza o poco fiables en función de la sensibilidad del instrumento; Por lo tanto, establecemos un umbral del 1%. Si se recubrieron las partículas seleccionadas para el análisis EDX, una cantidad detectable del recubrimiento estará presente en el informe de datos elementales. Si se utilizan discos de filtro de SiN sin recubrimiento, se observarán señales de Si y N, como se muestra en la Figura 3F. Desafortunadamente, la mayoría de las partículas de polímeros sintéticos también contendrán los elementos C, H y O, ya que la mayoría de las partículas no sintéticas de fuentes biológicas también están hechas de los mismos elementos, pero las partículas no sintéticas también podrían incluir elementos como el S, como en el caso de las proteínas. Esta similitud en la composición es la razón por la que el método de contratinción con rojo del Nilo y azul de tripán es útil para diferenciar entre partículas sintéticas y no sintéticas, pero no es una herramienta de identificación exhaustiva, ya que el rojo del Nilo también es capaz de teñir partículas no sintéticas en ciertos casos. Se deben utilizar parámetros de análisis adicionales como los sugeridos anteriormente junto con cualquier procedimiento de tinción para confirmar los resultados. Además, EDX puede ser una herramienta útil para identificar potencialmente partículas que están fuera del límite de tamaño de detección para la espectroscopia Raman (es decir, nanoplásticos que miden < 1 μm).

Figura 1: Tuberías de SNAP. (A) Esquemas de tuberías de SNAP, caracterizando las mismas partículas en la misma nanomembrana a través de una serie de técnicas analíticas diferentes. Oleoducto A) demuestra 1) Las partículas de interés capturadas de las muestras de agua potable a través de la filtración al vacío se tiñen con rojo del Nilo y azul de tripano para diferenciar las partículas poliméricas sintéticas frente a las no sintéticas, respectivamente, seguidas de 3) la identificación de partículas mediante espectroscopia Raman, y 4) SEM/EDX para caracterizar la morfología de las partículas y la identificación elemental. Oleoducto B) demuestra 1) Captura de partículas en Au-SiN seguido de 2) Espectroscopía Raman. Oleoducto C) demuestra 1) Captura de partículas en Au-SiN seguido de SEM/EDX. (B) Esquema del disco de filtro y la junta de silicona en la configuración de filtración en el aparato de vacío, que representa la filtración secuencial a través de una nanomembrana MPSN de 20 μm, luego MSSN de 8.0 μm, separada por juntas de silicona. Abreviaturas: SNAP = Línea de análisis de nanomembranas de silicio; SEM = microscopía electrónica de barrido; EDX = espectroscopía de rayos X de dispersión de energía; MPSN = nitruro de silicio microporoso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Fuentes de recolección de muestras de agua potable. Un mapa regional publicado por la Autoridad del Agua del Condado de Monroe que muestra los lugares de los que se recolectaron cada una de las cuatro muestras de agua potable en la región de Greater Rochester, NY. Las muestras se originaron en diferentes fuentes de agua superficial: el lago Ontario (azul), el lago Hemlock (verde), el lago Hemlock y el lago Ontario (amarillo) y el lago Canandaigua (púrpura). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Resumen de los análisis de la tubería A de SNAP realizados en partículas capturadas de muestras de agua potable. (A) Imagen en escala de grises de partículas capturadas de una muestra representativa de agua potable en un SiN de corte de 20 μm. (B) Imagen de superposición de color falso de partículas contramanchadas para representar el Rojo del Nilo (partículas rojas de color falso) y el Azul de Tripán (partículas azules de color falso). (C) Espectros Raman de referencia (rojo) y recopilados (blanco) que identifican una partícula teñida de rojo del Nilo como polietileno con un valor r de Pearson de 0,97, con imagen representativa de la partícula analizada. (D) Micrografía electrónica de dos tipos diferentes de partículas que demuestra el análisis de la morfología de partículas de una fibra (panel superior) y un fragmento (panel inferior), ambos absorbiendo la tinción de azul de tripano. (E) Cuantificación de partículas teñidas de rojo del Nilo capturadas secuencialmente en nanomembranas de corte de 20 μm y 8 μm. (F) Análisis elemental EDX resumido de un fragmento seleccionado al azar y detalles analíticos de los resultados con imagen SEM representativa de la partícula analizada. Abreviaturas: SNAP = Línea de análisis de nanomembranas de silicio; SEM = microscopía electrónica de barrido; EDX = espectroscopía de rayos X de dispersión de energía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Resumen de los análisis del Gasoducto B de SNAP realizados en partículas capturadas de muestras de agua potable. Análisis espectral Raman de tres partículas aleatorias de cuatro muestras de agua potable doméstica capturadas en discos de filtro de Au-SiN MPSN de 20 μm y MSSN de 8,0 μm. En A y B se muestran imágenes representativas del área total de la membrana activa para el Au-SiN de 20 μm y 8 μm, respectivamente. Las partículas aparecen amarillas en este modo de imagen mientras que el fondo permanece oscuro, lo que facilita el recuento automatizado de partículas. Espectros Raman representativos de partículas sintéticas y no sintéticas en (C) 20 μm y (D) 8,0 μm de Au-SiN. Los recuentos totales de partículas para (E) 20 μm y (F) 8.0 μm de Au-SiN se agrupan por rangos de tamaño determinados por el software automatizado de búsqueda de partículas. Abreviaturas: SNAP = Línea de análisis de nanomembranas de silicio; SEM = microscopía electrónica de barrido; EDX = espectroscopía de rayos X de dispersión de energía; MPSN = nitruro de silicio microporoso; MSSN = nitruro de silicio microrrendija. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Resultados de imágenes de fluorescencia subóptima y espectroscopia Raman. (A) Una imagen de fluorescencia subóptima de partículas teñidas (panel izquierdo), donde la membrana retuvo la tinción de rojo del Nilo, probablemente por enjuague insuficiente. Dos partículas, una fibra teñida con azul tripán y un fragmento teñido con rojo del Nilo (panel derecho), fueron seleccionadas para la espectroscopia Raman. (B) Resultados de espectroscopia Raman subóptimos donde el coeficiente de Pearson (r) es inferior al 70 % (r < 0,70). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla suplementaria S1: Propiedades de las nanomembranas de silicio dentro de los discos filtrantes. En esta tabla se muestran las propiedades de las membranas dentro de los discos de filtro de SiN, incluido el tamaño mínimo de poro, el porcentaje de porosidad, el grosor de las membranas con y sin recubrimiento de Au, el área activa de la membrana y la permeabilidad del gas a través de la membrana con presión positiva aplicada a una presión constante establecida. El corte (es decir, el tamaño de los poros), la porosidad, el grosor y el área de la membrana se determinan midiendo las características de las imágenes SEM. Los datos de permeabilidad al gas se informan como media ± desviación estándar (n = 10) para la presión positiva de N 2 aplicada a 103,42 kPa. Abreviaturas: Au = Oro; Si_x N_y = Nitruro de silicio no estequiométrico. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria S2: Recuentos de partículas y parámetros de ParticleFinder. Se tomaron mosaicos de imágenes de área de membrana completa de cada muestra, y cada mosaico de imágenes se analizó para recopilar los recuentos totales de partículas. En esta tabla se muestran los parámetros utilizados y en qué orden para determinar los recuentos totales de partículas para cada imagen de muestra, y los recuentos de partículas en fracciones de tamaño dados. Los parámetros varían de una muestra a otra según el tipo, la cantidad y la forma de las partículas, así como la reflectividad específica de cada membrana durante la obtención de imágenes. Los datos de esta tabla se visualizan en la Figura 4. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

La mitigación de la contaminación por microplásticos es un tema de creciente preocupación; Y el primer paso de la mitigación es identificar la presencia de contaminación. Un método optimizado de captura y análisis inmediato es crucial para ahorrar tiempo a los investigadores y preservar las métricas confidenciales de las muestras. Este informe describe flujos de trabajo flexibles basados en variaciones de nuestros métodos SNAP desarrollados para el análisis de dichos MP en muestras líquidas, utilizando un solo sustrato para todos los análisis realizados. La muestra debe filtrarse al vacío de modo que las partículas se capturen y aíslen en una nanomembrana de silicio alojada dentro de un disco de filtro. La mitigación suficiente de la contaminación de fondo es fundamental para obtener resultados significativos. Cualquier partícula contaminante en la jeringa dispensadora o en el embudo de vacío de vidrio durante la filtración puede contaminar la muestra y ser capturada simultáneamente, por lo que seguir diligentemente los protocolos de control de calidad de la Sección 1 es crucial para obtener resultados precisos. Se recomiendan controles solo de medios para informar a los investigadores de la contaminación de fondo específica de los procesos individuales y las condiciones del laboratorio. El protocolo descrito en este documento se basa en la filtración al vacío de una muestra líquida, así como en la captura y el aislamiento de partículas de la muestra en dos discos de filtro de SiN cortados diferentes. Para todas las tuberías, la captura y el aislamiento de partículas deben preceder a otros métodos, pero todos los demás métodos de identificación se pueden realizar en el orden más adecuado para el investigador.

Para este estudio se utilizaron dos microscopios fluorescentes con el fin de demostrar la repetibilidad de los resultados en todos los instrumentos. Los pasos instructivos detallan específicamente el uso de una Olympus BX61 para microscopía fluorescente debido al predominio de su uso y se operó según las instrucciones del instrumento utilizando campo claro para imágenes en escala de grises, canal TRITC (Ej. ~ 543 nm; Em. ~593 nm) para la obtención de imágenes de partículas teñidas con NR y el canal Cy5 (Ej. ~649 nm; Em. ~667 nm) para la obtención de imágenes de partículas teñidas de TB, según corresponda. Para mostrar los resultados de la tinción, recomendamos construir una superposición de las imágenes del canal (utilizamos FIJI/ImageJ para el procesamiento de imágenes, posteriormente denominada plataforma de análisis de imágenes), a una resolución de 2.048 x 2.040 píxeles y una profundidad de 16 bits. Las imágenes completas de nanomembranas se pueden mostrar como en la Figura 4A, B o como regiones seleccionadas de interés como se muestra en la Figura 3A, B.

El rojo del Nilo se usa comúnmente para teñir polímeros sintéticos MP, pero puede teñir polímeros no sintéticos de fuentes biológicas debido a su naturaleza lipofílica e hidrofóbica, lo que puede introducir falsos positivos que distorsionan los resultados de la cuantificación de MP 24,25,26. Se recomienda un paso de contratinción con Trypan Blue, como se describe en la sección 3 del protocolo, para ayudar en la diferenciación de eventos falsos positivos, pero no es una solución exhaustiva y debe combinarse con métricas de análisis adicionales para confirmar los resultados. La fluorescencia de las partículas de rojo del Nilo es una preocupación con el análisis de espectroscopia Raman, ya que puede aumentar significativamente la señal de fondo. En este estudio, sin embargo, contratiñimos polímeros con rojo de Nilo y azul de tripán antes de la espectroscopia Raman con un láser de 830 nm, y se observó poco ruido, como se muestra en la Figura 3.

Algunas longitudes de onda de láseres adecuadas para la espectroscopia Raman no son capaces de ignorar la fluorescencia de las partículas teñidas, como un láser de 532 nm, y por lo tanto pueden presentar dificultades significativas para estimar correctamente la composición de la partícula de interés. El recubrimiento metálico de las partículas después de la captura es útil para mejorar el contraste durante la obtención de imágenes SEM, pero es incompatible con cualquier análisis espectroscópico o fluorescente posterior. Tome nota de todas las mediciones deseadas antes de la configuración experimental para asegurarse de que el flujo del proceso y los tipos de recubrimiento se tengan en cuenta correctamente. Los discos de filtro Au-SiN se pueden utilizar para todos los análisis mencionados en los que la microscopía de transmisión no es crucial para el flujo de trabajo, o cuando se utiliza la espectroscopia Raman o IR.

Los métodos que se muestran aquí, así como las nanomembranas utilizadas para capturar y aislar partículas de interés, pueden modificarse para adaptarse a las necesidades individuales de los investigadores. Las nanomembranas son adecuadas para una serie de análisis espectroscópicos, y el investigador puede cambiar el medio que se está filtrando por otro medio de muestra de interés, incluidos, entre otros, tejidos animales digeridos²⁷, productos farmacéuticos inyectables y muestras de aceite. Para este estudio se utilizaron dos instrumentos de espectroscopia Raman, y los pasos instructivos detallan específicamente el uso de un instrumento Raman Horiba XploRA Plus, que recopiló y procesó todos los datos que se muestran en la Figura 4. También es importante reconocer el límite de tamaño de detección para cada microscopio Raman, para garantizar que las partículas de interés se puedan analizar adecuadamente con el tamaño del punto de los láseres del instrumento. Para mostrar los resultados de la identificación de partículas con Raman, los espectros de referencia y de muestra, además de una imagen de la partícula analizada, se pueden mostrar como en la Figura 3C y la Figura 4C.

En la sección 6 del protocolo se detallan las instrucciones para la identificación de partículas mediante una biblioteca espectral de código abierto. La captura planarizada de partículas en una membrana uniformemente plana, así como la matriz regular de poros de la membrana, permite obtener imágenes predecibles y automatizadas. Tanto los espesores de 400 nm o 1.000 nm del SiN como su composición de nitruro de silicio les confieren una excelente transparencia óptica, pero también pueden devolver un pico intenso de silicio en algunos parámetros de los instrumentos espectroscópicos. Se debe tener cuidado al utilizar SiN desnudo, sin recubrimiento metálico con análisis Raman. El pico de Si puede funcionar como una señal de calibración, pero la intensidad del pico también puede enmascarar las señales de espectros de menor intensidad en la misma región de número de onda que la señal de Si. Tales picos de Si no se observaron cuando se utilizó el láser de 830 nm en este estudio.

La naturaleza ultrafina del SiN (400 nm o 1.000 nm de espesor) y el Au-SiN (520 nm o 1.120 nm de espesor) utilizados aquí los dotó de sus excelentes propiedades de filtración, ópticas y espectroscópicas. Sin embargo, estas membranas deben protegerse de daños físicos, como por una presión diferencial excesiva (es decir, ≥-206 kPa), el contacto directo con pinzas o dedos, o por la colocación incorrecta de la junta. El disco filtrante que aloja las membranas las protege y facilita su manejo en condiciones normales de uso. Al manipular los discos de filtro, toque solo el anillo exterior negro y nunca el área activa de la membrana. Aunque no se informa cuantitativamente aquí, la recolección de partículas capturadas en una pequeña cantidad de superficie de membrana (3 x 3 mm para membranas de corte de 20 μm y 3 x 0,7 x 3 mm para membranas de corte de 8,0 μm, respectivamente) potencialmente reduce el tiempo total de análisis de muestras, al reducir el tiempo necesario para encontrar y analizar partículas de interés. Este "factor de concentración" es digno de exploración futura y puede ofrecer un beneficio único de los discos de filtro de SiN para los investigadores. En combinación con sus caudales normalizados de área superficial más altos en comparación con otras membranas ampliamente utilizadas para la caracterización de MP¹⁵, las rutinas automatizadas de imágenes de partículas que solo necesitan obtener imágenes de un área relativamente más pequeña de SiN uniformemente plana y enfocada pueden reducir aún más los tiempos totales de análisis. Sin embargo, cualquier beneficio relacionado con el factor de concentración hipotético aún debe demostrarse empíricamente comparando los tiempos totales de procesamiento (desde la filtración hasta el análisis de imágenes) en discos de filtro convencionales y de SiN.

Demostramos heurísticamente la utilidad de las variaciones de SNAP en muestras locales de agua del grifo. El protocolo descrito aquí se centra en la captura de MP de las fuentes de agua potable alrededor de Rochester, Nueva York. La recolección de muestras se llevó a cabo de la siguiente manera: para cada recolección de muestras, al menos un litro de agua pasó por el grifo antes de comenzar la recolección. Las botellas nuevas de polipropileno selladas se llevaban al grifo abierto y se abrían directamente antes de la recogida. Las botellas no se enjuagaron con agua potable antes de proceder a la recolección. Cada muestra consistió en dos frascos de 500 mL recogidos, uno directamente después del otro. Cada muestra de agua procedía del sistema de tuberías de un hogar distinto, y el material de la tubería no era consistente durante todo el muestreo. En este estudio no se pudieron controlar variables como la cantidad de consumo reciente de agua, el momento de la recolección, la antigüedad de las tuberías y la antigüedad de la casa de la que procedía la muestra. Este no fue un protocolo de recolección de muestras validado. Cada investigador debe desarrollar y validar sus propios procedimientos de recolección. Sin embargo, en aras de la divulgación completa de los métodos, se incluye la descripción anterior. Los discos de filtro permiten el análisis repetido en el mismo sustrato para una serie de métodos analíticos. No se necesitan submuestreos ni muestras múltiples fuera de las réplicas de ensayo estándar. La eliminación de la necesidad de submuestreo y muestras múltiples aumenta la confianza en la captura de información sobre objetivos de baja abundancia. Además de permitir métodos de análisis multimodales, los discos de filtro de SiN proporcionan una ventaja distintiva sobre otros medios de filtración análogos debido a la calidad de ahorro de tiempo de una tasa de filtración más rápida por unidad de área¹⁵.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Vaso de precipitados de vidrio	Pyrex	1000-1L
L Matraz de recogida de vidrio al vacío	Millipore Sigma	Z290459-1EA
laboratorio	Landau	LA-3172
100 mL embudo de filtración de vidrio	Advantec	311000	https://www.sterlitech.com/glass-filter-holder-311000.html
alcohol isopropílico al 99%	Fisher Scientific	A416-20
APEX EDS	EDX		software utilizado para realizar análisis EDX en partículas capturadas.
Sistema de pulverización catódica Denton Prep	Denton Vacuum	DESK II :	293618089 Sistema de recubrimiento de oro
FIJI, plataforma de análisis de imágenes	ImageJ	V 1.54F	FIJI (FIJI es solo ImageJ) - una distribución de ImageJ
Botella de vidrio con tapón de rosca	Corning	1395-250
Kimwipes	Kimtech	06-666-11C
LabSpec6	Horiba Scientific		Horiba Raman software que contiene ParticleFinder y ViewSharp
Campana de flujo laminar	Air Science	VLF-72A
Microscopio	Olympus  / Nikon	BX61 / Ti2e	Cualquier microscopio con fluorescencia adecuada puede ser utilizado para microscopía óptica.
Filtros MPSN SiN	SiMPore Inc.	FD25-8.0-Au; FD25-8.0-NC FD25-20.0-Au, FD25-20.0-NC
Jeringas monoyeces de 60 ml	Coviden	8881560265
polvo rojo del Nilo	TCI	N0659
Guantes de nitrilo	Ansell Microflex	19-167-17
OpenSpecy	openanalysis.org		Biblioteca espectral de código abierto
Horno	VWR	1310	Gravity Horno utilitario de convección
P20 Pipeta	Brandtech	705872
Punta de pipeta	Viales premium	GS 151140R
Fritas de soporte vertido	Advantec	311000	Parte del paquete
instrumentos Raman	Horiba	Xplora PLUS
Tapón de goma	Advantec	311000	Parte del paquete
de instrumentos SEM	Ziess	Auriga	Auriga Series, estación de trabajo modular de viga transversal
Juntas de silicona	SiMPore	GASKET-25-R	Juntas PDMS transparentes, 0,8 mm de espesor
Rodillo de silicona	Sanyue	( ASIN: B07XDTNPS3)	Rodillo de silicona -  8 x 5 x 2 pulgadas
SmartSEM	Zeiss	V8	SEM software utilizado para operar la botella de spray Zeiss Auriga
	Uline	S-7273
Filtros de jeringa	Thermo Scientific	CH2225-PES	0,22 µ Filtros de jeringa M Luer Lock, 25 mm
Bomba de jeringa	New Era Pump Systems, Inc.	NE-1000	Opcional, pero recomendado
Trypan Blue - 0.4%	Millipore Sigma	T8154-20ML
Pinzas	SiMPore	K6TWZR
Bomba de vacío	Welch	847-676-8800
Tubo de vacío	Grainger	ZUSA-HT-4037