Artículo de método

Ensayo inmunoquímico validado para la determinación completa del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano liberado y unido a las células

DOI:

10.3791/68204

⸱

9 de mayo de 2025

 ,  ,  , 
1SDS Optic S.A.

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos un ensayo ELISA sándwich validado utilizando nuevos anticuerpos monoclonales anti-HER2. Este ensayo permite la cuantificación precisa de la proteína HER2 unida a las células y liberada a partir de células cultivadas in vitro y otras muestras, incluidas la sangre y los tejidos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) es un marcador de cáncer bien establecido. Se convirtió en un objetivo diagnóstico y terapéutico muy exitoso, especialmente en el cáncer de mama y otros tipos de cáncer que expresan HER2. En la clínica, se utilizan los métodos de diagnóstico inmunohistoquímico de referencia que emplean los anticuerpos anti-HER2 específicos para medir el nivel de expresión del receptor unido a la membrana. El dominio extracelular soluble (ECD) de HER2 que se libera de las células que sobreexpresan circula en la sangre y puede reflejar la expresión tisular del receptor. Existe la necesidad de ensayos precisos y validados para correlacionar la concentración de la proteína HER2 circulante con las manifestaciones clínicas de la enfermedad.

Nuestro equipo ha desarrollado y validado el nuevo ensayo de inmunoadsorción enzimática en sándwich (ELISA) para la cuantificación del dominio ECD unido a la membrana y liberado de las células de HER2. El ensayo utiliza dos anticuerpos monoclonales únicos específicos para HER2 desarrollados anteriormente. El rango de cuantificación incluye una concentración de HER2 de 1,56 a 100 ng/mL, que se espera para las células cancerosas cultivadas in vitro y muestra una sensibilidad a nivel de 0,5 ng/mL. La satisfactoria precisión y exactitud del método dentro y entre ensayos lo hacen aplicable para la cuantificación de HER2 en varios tipos de muestras biológicas, incluidos medios de cultivo celular, suero y tejido tumoral sólido. Aquí, nos centramos en la determinación exhaustiva de las células cancerosas asociadas al receptor y secretadas por las células cancerosas cultivadas in vitro . El artículo presenta un protocolo paso a paso para la cuantificación de la proteína HER2 que se puede emplear para analizar una variedad de líneas celulares, sangre y tejidos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El éxito de la terapéutica moderna a menudo se relaciona con la medicina de precisión que se basa en la identificación precisa de los pacientes sensibles a la terapia1. Entre estas terapias se encuentran los fármacos anti-HER2 dirigidos al receptor sobreexpresado en una variedad de tumores, incluidos los de mama, endometrio, estómago y pulmón, entre otros. Hay varios fármacos dirigidos a HER2 disponibles con beneficios confirmados en pacientes con cánceres HER2 positivos, incluido el tipo2 con HER2 bajo. La confirmación del estado positivo para HER2 es fundamental para la identificación de los posibles pacientes que responden; sin embargo, sigue siendo un desafío, especialmente en el grupo de HER2 bajo.

Los métodos de referencia en entornos clínicos, utilizados de forma rutinaria para las pruebas de HER2, incluyen la expresión de proteínas de inmunohistoquímica (IHQ) y la amplificación del gen HER2 mediante enfoques de hibridación fluorescente in situ (FISH). Además, el ensayo Oncotype DX se utiliza para la expresión de ARNm de HER2. La biopsia de tejido requerida para estos métodos hace que la determinación de la elegibilidad del paciente para el tratamiento adecuado y su posible respuesta a las terapias sea incierta. A pesar de las directrices actualizadas en 2018 de la Sociedad Americana de Oncología Clínica (ASCO) y el Colegio Americano de Patólogos (CAP) para reducir la variabilidad entre las unidades de prueba, la concordancia de HER2 sigue siendo un tema de mejora3.

HER2 es un protooncogén miembro de la familia de los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) cuya sobreexpresión y activación en los estados patológicos da lugar a un desenlace agresivo o contribuye a un mal pronóstico4. HER2 es una proteína modular de 185 kDa anclada en la membrana celular que contiene una tirosina quinasa citoplasmática y un dominio extracelular (ECD). El HER2 ECD puede desprenderse de las células para ser liberado en la matriz extracelular5 como la proteína libre de células, circulando aún más en la sangre. El aumento de la expresión de HER2 podría reflejarse en el mayor nivel de ECD circulante, presentando un valioso marcador predictivo y pronóstico 6,7, un marcador sustituto de la respuesta al tratamiento8, o como un método complementario a la IHQ para identificar pacientes elegibles para el tratamiento anti-HER29. Sin embargo, el reto sigue siendo establecer la correlación entre la expresión tumoral de HER2 y el nivel sistémico del receptor en sangre que podría tener un significado clínico.

La ECD de HER2 liberada se puede cuantificar mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)10. El ELISA sándwich es un enfoque que emplea dos anticuerpos específicos que se unen a diferentes epítopos en el mismo antígeno diana. Permite la medición precisa de proteínas solubilizadas en el material biológico de base sanguínea y líquida de fácil acceso (la llamada biopsia líquida). A pesar de la presencia de ensayos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), existe controversia sobre la utilidad de los diagnósticos de HER2 ECD5 y el valor de corte para un aumento del nivel de HER2 en la sangre. Se necesita más investigación con los métodos validados y los umbrales uniformemente aceptados para confirmar la aplicabilidad de los ensayos11.

Los componentes críticos de cualquier ELISA son la captura (inmovilizada en la placa y que define la especificidad y sensibilidad del ensayo) y la detección de anticuerpos (añadidos después de que se hayan aplicado las muestras) (Figura 1). En este reporte, presentamos el protocolo ELISA basado en los nuevos anticuerpos monoclonales (mAb) anti-HER2 ECD recientemente desarrollados que fueron generados, purificados en una columna de afinidad, caracterizados exhaustivamente y presentan secuencias únicas12. El ELISA desarrollado que emplea estos anticuerpos personalizados muestra su utilidad para la cuantificación precisa de la proteína HER2 asociada con la membrana celular y liberada en un medio de cultivo para una evaluación completa del estado del receptor. El ensayo se puede utilizar en pruebas preclínicas y para respaldar la investigación en curso. El rendimiento del ensayo se ha probado más a fondo en muestras biológicas de diferentes orígenes, incluidos homogeneizados de suero y tejido12, para mostrar potencial en el desarrollo de investigaciones, diagnósticos y nuevos tratamientos anti-HER2 en el futuro.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cultivo de células cancerosas humanas

  1. Cultivo de las líneas MDA-MB-231, SK-BR-3 y SK-OV-3 en el medio Modified Eagle de Dulbecco que contiene 4,5 g/L de ᴅ-glucosa (DMEM-HG), suplementado con 2 mM de ʟ-glutamina y 10% (v/v) de FBS inactivado por calor. Incubar los cultivos a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.
  2. Cuando el cultivo alcance ~80% de confluencia, separe las células por tripsinización y recójalas en tubos cónicos separados de 15 mL.
  3. Cuente las células con un contador automático de células y las células semilla para el experimento en placas de 12 pocillos a una densidad de 3 × 105 células/pocillo en 1 mL de medio de crecimiento. Incubar los cultivos a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.
    NOTA: Siembre un pocillo por cada punto de tiempo del experimento. Tanto el medio de postcultivo como los lisados celulares se utilizarán en análisis posteriores.

2. Recogida y preparación de muestras

  1. A partir del cultivo de 24 h, recoja el medio de cultivo de un pocillo de cada línea celular en un tubo de 1,5 mL.
  2. Centrifugar las muestras recogidas a 10 000 × g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y guárdelo a -20 °C para determinar aún más el nivel de ECD HER2 secretado.
  3. Lave las células restantes de la placa con 1 ml de PBS frío, aspire suavemente y deseche el PBS.
  4. Añadir 200 μL de tampón RIPA (suplementado con un 1% de inhibidor de la proteasa) en cada pocillo e incubar durante 5 min. Raspar las células con el raspador de células y mezclar pipeteando varias veces para homogeneizar el lisado.
  5. Recoja las células lisadas en un tubo nuevo y aspire lentamente en una jeringa de 2 ml con una aguja (G21 / 0,8 mm × 40 mm). Repita el paso de aspiración de 5 a 10 veces para desintegrar aún más las células.
  6. Centrifugar las muestras recogidas a 10 000 x g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y guárdelo a -20 °C para una mayor determinación de la fracción de la proteína HER2 unida a la célula.
  7. Repita la recolección del medio de cultivo y los materiales celulares, siguiendo los pasos de preparación para los puntos de tiempo restantes: 48 h y 72 h de cultivo.

3. Realización de un ELISA sándwich para la determinación de HER2

  1. Prepare los tampones.
    1. Tampón de recubrimiento: Prepare una solución de NaHCO3 de 0,1 M disolviendo 0,42 g de NaHCO3 en 50 ml de agua destilada y mezcle bien. Ajuste el pH a 9,6 con 3 M de NaOH.
    2. Tampón de bloqueo: Prepare leche de vaca descremada al 5% (NFDM) en PBS agregando 0,5 g de leche secante en polvo a 10 ml de PBS y mezcle bien.
    3. Tampón de lavado: Prepare solución salina tamponada con fosfato con Tween 20 (PBST) agregando 0,5 mL de 0,05% Tween-20 a 1000 mL de PBS y mezcle (evite la formación excesiva de espuma).
  2. Biotinilato el anticuerpo detectador.
    1. Biotinilato 50-200 μg de anticuerpo anti-HER2 detector (clon 70.21.73.67) utilizando un kit comercial de etiquetado de biotina según las instrucciones del fabricante.
      NOTA: La fiabilidad y la repetibilidad del proceso de biotinilación se basan en la medición de la concentración final de proteínas del anticuerpo resultante y en la comparación entre lotes del producto.
  3. Cubre el plato.
    1. Diluir el anticuerpo capturador anti-HER2 (clon 70.27.58) hasta una concentración de 1 μg/mL en el tampón de recubrimiento. Para recubrir una placa, use 6,5 mL de la solución de anticuerpos capturadores.
    2. Con una pipeta multicanal, agregue 100 μL de la solución de anticuerpos capturadores (preparada en el paso 3.3.1) a cada pocillo en una placa ELISA de 96 pocillos.
      NOTA: Evite los pozos más exteriores de la placa (por ejemplo, A1, H12) para reducir la variabilidad causada por el efecto de borde. Los pozos más exteriores deben llenarse con agua destilada para garantizar condiciones de reacción estables.
    3. Cubra la placa con una película de sellado.
    4. Incubar la placa durante la noche (O/N) a 4 °C.
    5. Después de la incubación O/N, coloque la placa a temperatura ambiente (RT) en un agitador de microplacas horizontal (20-30 rpm con un ángulo de inclinación de 4°-6°) durante 1 h.
    6. Con una lavadora de microplacas, aspire la solución de recubrimiento y lave la placa tres veces con un tampón de lavado (3 x 300 μL de PBST por pocillo).
  4. Bloquee la placa.
    1. Con una pipeta multicanal, añada 100 μL de tampón de bloqueo (5% de NFDM en PBS) a cada pocillo recubierto para bloquear los sitios de unión no específicos.
    2. Cubra la placa con una película de sellado.
    3. Incubar la placa durante 1 h a 37 °C en una cámara de humedad.
    4. Con una lavadora de microplacas, aspire la solución de recubrimiento y lave la placa tres veces con un tampón de lavado (3 x 300 μL de PBST por pocillo).
  5. Prepare una curva de calibración y control positivo (Figura 2).
    1. Prepare la solución estándar de trabajo del antígeno HER2 añadiendo 2 μL de 1 mg/mL de solución madre a 1998 μL de PBS para obtener una concentración de HER2 de 0,001 mg/mL (1000 ng/mL).
    2. Diluir la solución estándar de trabajo (WSS) añadiendo 200 μL de la solución a 1800 μL de PBS para obtener la solución estándar 1 (STD 1).
    3. Prepare los seis patrones subsiguientes (STD 2-STD 7) mediante diluciones seriadas de STD 1 en PBS (Figura 2).
      1. STD 2: Agregue 500 μL de STD 1 a 500 μL de PBS y mezcle bien para preparar 50 ng/mL.
      2. STD 3: Agregue 500 μL de STD 2 a 500 μL de PBS y mezcle bien para preparar 25 ng/mL.
      3. STD 4: Agregue 500 μL de STD 3 a 500 μL de PBS y mezcle bien para preparar 12.5 ng/mL.
      4. STD 5: Agregue 500 μL de STD 4 a 500 μL de PBS y mezcle bien para preparar 6.25 ng/mL.
      5. STD 6: Agregue 500 μL de STD 5 a 500 μL de PBS y mezcle bien para preparar 3.125 ng/mL.
      6. STD 7: Agregue 500 μL de STD 6 a 500 μL de PBS y mezcle bien para preparar 1.5625 ng/mL.
      7. STD 8: Agregue 500 μL de PBS para preparar 0 ng/mL.
    4. Control positivo: Diluir STD 1 añadiendo 100 μL de la solución STD 1 a 900 μL de PBS para obtener una solución de HER2 a una concentración de proteína de 10 ng/mL.
  6. Prepare muestras para experimentos de picos y recuperación.
    1. Prepare las muestras de la matriz (PBS, lisados celulares y medio de cultivo) enriquecidas con la concentración conocida de la proteína HER2. Diluir los lisados celulares 1:2000 añadiendo 2,5 μL de lisado celular apropiado a 5 mL de PBS para adquirir una matriz de muestra con un nivel de HER2 por debajo del LOD del método.
    2. Utilice WSS (1000 ng/mL) y STD1 (100 ng/mL) para aumentar las muestras de la matriz.
    3. Para cada matriz, prepare 6 muestras con concentraciones de 0, 2, 5, 10, 30 y 50 ng/mL.
    4. Para preparar 0 ng/mL, añadir 400 μL de PBS/medio de cultivo/lisado celular.
    5. Para preparar 2 ng/mL, agregue 8 μL de STD1 a 392 μL de PBS/medio de cultivo/lisado celular y mezcle bien.
    6. Para preparar 5 ng/mL, agregue 20 μL de STD1 a 380 μL de PBS/medio de cultivo/lisado celular y mezcle bien.
    7. Para preparar 10 ng/mL, añadir 4 μL de WSS a 396 μL de PBS/medio de cultivo/lisado celular y mezclar bien.
    8. Para preparar 30 ng/mL, agregue 12 μL de WSS a 388 μL de PBS/medio de cultivo/lisado celular y mezcle bien.
    9. Para preparar 50 ng/mL, agregue 20 μL de WSS a 380 μL de PBS/medio de cultivo/lisado celular y mezcle bien.
  7. Agregue la muestra, el espacio en blanco y el estándar.
    1. Con una pipeta de un solo canal, agregue 100 μL de muestras estándar, en blanco (PBS) y analizadas (lisados celulares y medio de cultivo) a los pocillos apropiados.
      NOTA: Se recomienda ejecutar cada muestra por triplicado.
    2. Cubra la placa con una película de sellado.
    3. Incubar la placa durante 1 h a 37 °C en una cámara de humedad.
    4. Con una lavadora de microplacas, aspire la solución de recubrimiento y lave la placa tres veces con un tampón de lavado (3 x 300 μL de PBST por pocillo).
  8. Detectar la unión de anticuerpos.
    1. Diluir el anticuerpo detector biotinilado (clon 70.21.73.67) en PBS hasta una concentración de trabajo de 1 μg/mL. Para una placa, use 6.5 mL de solución de trabajo de anticuerpos de detección.
    2. Con una pipeta multicanal, añada 100 μL de la solución de trabajo de anticuerpos de detección a cada pocillo.
    3. Cubra la placa con una película de sellado.
    4. Incubar la placa durante 1 h a 37 °C en una cámara de humedad.
    5. Con una lavadora de microplacas, aspire la solución de recubrimiento y lave la placa tres veces con un tampón de lavado (3 x 300 μL PBST por pocillo).
  9. Añadir conjugado Avidin-HRP.
    1. Diluir el conjugado Avidin-HRP disponible en el mercado 1:40.000 añadiendo 1 μL de conjugado enzimático a 40 mL de PBST.
    2. Con una pipeta multicanal, añada 100 μL del conjugado diluido a cada pocillo.
    3. Cubra la placa con una película de sellado.
    4. Incubar la placa durante 1 h a 37 °C en una cámara de humedad.
    5. Con una lavadora de microplacas, aspire la solución de recubrimiento y lave la placa tres veces con un tampón de lavado (3 x 300 μL de PBST por pocillo).
  10. Reacción colorimétrica
    1. Con una pipeta multicanal, agregue 100 μL de sustrato de 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina (TMB) a cada pocillo.
    2. Cubra la placa con una película de sellado.
    3. Incubar la placa durante 1-5 min a 37 °C lejos de la luz y controlar el desarrollo del color.
    4. Cuando el color alcance el nivel esperado, agregue 100 μL de solución de parada para terminar la reacción.
      NOTA: El nivel esperado corresponde a un color azul intenso en pocillos que contienen muestras con una alta concentración del analito.
  11. Adquirir y analizar datos.
    1. Mida la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
    2. Usando una curva de calibración de 4 parámetros, calcule la concentración de la muestra en función de la ecuación de la curva.

figure-protocol-1
Figura 1: Diagrama esquemático del flujo de trabajo ELISA sándwich anti-HER2 desarrollado. Resumen de los pasos clave en el procedimiento ELISA sándwich. Estos incluyen los pasos críticos (resaltados con un marco rojo) como el recubrimiento de la placa con el anticuerpo anti-HER2 de captura 70.27.58, la adición de muestras (patrones de curva, blanco, muestras experimentales de los lisados celulares o medio de cultivo) y la unión del anticuerpo anti-HER2 de detección 70.21.73.67. El ensayo concluye con la detección de señales y el análisis de datos, donde la señal colorimétrica se cuantifica utilizando un lector de microplacas para determinar la concentración del antígeno objetivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-2
Figura 2: Esquema que presenta la preparación de las soluciones patrón de la curva de calibración. Las diluciones seriadas de la proteína recombinante HER2 se preparan para generar una curva de calibración en un rango de concentración de 1,56-100 ng/mL (viales STD 1-STD 7). Además, se incluye la muestra de control negativa sin la proteína HER2 (STD 8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

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Validación ELISA sándwich
El ensayo recientemente desarrollado requiere un procedimiento de validación. Los parámetros de validación importantes incluyen linealidad, precisión y límites de detección, es decir, límite inferior de detección (LLOD) y límite superior de detección. En el artículo anterior, hemos realizado una validación exhaustiva del método. La linealidad del ELISA se probó utilizando las muestras simuladas para concentraciones bajas (2, 5, 10 ng/mL), medias-altas (30 ng/mL) y significati...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Entre los componentes críticos en la construcción de un ELISA sándwich, se encuentran los anticuerpos de captura que se inmovilizan en la placa y contribuyen a la especificidad y sensibilidad del ensayo. En el ensayo presentado, hemos empleado como anticuerpo capturador la nueva proteína monoclonal (HER2/70.27.58) generada y caracterizada internamente. El anticuerpo tenía una secuencia única de la CDR (región determinante de la complementariedad) y, en base a la afinidad, presentaba una ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.L., A.A., A.M., M.S. declaran apoyo financiero de SDS Optic S.A.; A.A., A.M., M.S. declaran la propiedad de las acciones de SDS Optic S.A.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El estudio contó con el apoyo de fondos de la subvención del Centro Nacional de Investigación y Desarrollo STRATEGMEDII/269364/5/NCBR/2015 y la subvención n.º 783818 del Instrumento PYME de la UE, Horizonte 2020.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de etiquetado de biotina-NH2AbnovaKA0003
Grado de transferencia, leche en polvo, bajo en grasaRothT145.1
Portaobjetos de recuento de células para contador de células TC10 / TC20, placas deBio-Rad145-0011
Biologix07-6012
Raspadores de célulasBiologix70-1250
CentrifugadoraOhaus30130868
Clase II Gabinete de Seguridad Biológica - Telstar Bio II Advance 6Telstar/A
Placas transparentes de fondo plano de 96 pocillosThermo Fisher442404
Incubadoras seguras para cultivos de CO2 - Touch 190SLeecN/A
Dimethyl sulfoxide Sigma AldrichD2650
DMEM - alto contenido de glucosaSigma AldrichD0822
Lector de placas ELISABioTek800TSUVI
FBS Standard, suero fetal bovinoPAN BiotechP30-19375
Secador de laboratorio de circulación forzadaBINDER9090-0018
HRP-AvidinThermo Fisher43-4423
Proteína humana Her2 / ErbB2, etiqueta Fc, grado premiumAcroBIOSYSTEMSHER2-H5253
Lavadora de microplacasImmunowash Bio-Rad170-7009
Solución de L-glutaminaSigma AldrichG7513
mAb a-HER2 (clon 70.21.73.67)SDS OpticBIO-ABH-2
mAb a-HER2 (clon 70.27.58)SDS OpticBIO-ABH-1
MDA-MB-231 Línea celularATCCHTB-26
NaHCO3POCH810530115
NaOHPOCHBA0981118
Cóctel inhibidor de la proteasaSigma AldrichP8340
RIPA BufferSigma AldrichR0278
ROTI Fair PBSRoth1111.2
SK-BR-3 [SKBR3] Línea celularATCCHTB-30
SK-OV-3 [SKOV-3; SKOV3] Línea celularATCCHTB-77
Solución de parada 1xAbcamab210900
TC20 Contador celular automatizadoBio-rad1450102
sustrato TMB 1xAbcamab210902
Tween-20Sigma AldrichP9416
VortexOhaus 30392117
Agitador de movimiento ondulatorioOhaus30391968
cultivo celular de doble cámara N

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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