Ensayo inmunoquímico validado para la determinación completa del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano liberado y unido a las células

Resumen

Presentamos un ensayo ELISA sándwich validado utilizando nuevos anticuerpos monoclonales anti-HER2. Este ensayo permite la cuantificación precisa de la proteína HER2 unida a las células y liberada a partir de células cultivadas in vitro y otras muestras, incluidas la sangre y los tejidos.

Resumen

El receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) es un marcador de cáncer bien establecido. Se convirtió en un objetivo diagnóstico y terapéutico muy exitoso, especialmente en el cáncer de mama y otros tipos de cáncer que expresan HER2. En la clínica, se utilizan los métodos de diagnóstico inmunohistoquímico de referencia que emplean los anticuerpos anti-HER2 específicos para medir el nivel de expresión del receptor unido a la membrana. El dominio extracelular soluble (ECD) de HER2 que se libera de las células que sobreexpresan circula en la sangre y puede reflejar la expresión tisular del receptor. Existe la necesidad de ensayos precisos y validados para correlacionar la concentración de la proteína HER2 circulante con las manifestaciones clínicas de la enfermedad.

Nuestro equipo ha desarrollado y validado el nuevo ensayo de inmunoadsorción enzimática en sándwich (ELISA) para la cuantificación del dominio ECD unido a la membrana y liberado de las células de HER2. El ensayo utiliza dos anticuerpos monoclonales únicos específicos para HER2 desarrollados anteriormente. El rango de cuantificación incluye una concentración de HER2 de 1,56 a 100 ng/mL, que se espera para las células cancerosas cultivadas in vitro y muestra una sensibilidad a nivel de 0,5 ng/mL. La satisfactoria precisión y exactitud del método dentro y entre ensayos lo hacen aplicable para la cuantificación de HER2 en varios tipos de muestras biológicas, incluidos medios de cultivo celular, suero y tejido tumoral sólido. Aquí, nos centramos en la determinación exhaustiva de las células cancerosas asociadas al receptor y secretadas por las células cancerosas cultivadas in vitro . El artículo presenta un protocolo paso a paso para la cuantificación de la proteína HER2 que se puede emplear para analizar una variedad de líneas celulares, sangre y tejidos.

Introducción

El éxito de la terapéutica moderna a menudo se relaciona con la medicina de precisión que se basa en la identificación precisa de los pacientes sensibles a la terapia¹. Entre estas terapias se encuentran los fármacos anti-HER2 dirigidos al receptor sobreexpresado en una variedad de tumores, incluidos los de mama, endometrio, estómago y pulmón, entre otros. Hay varios fármacos dirigidos a HER2 disponibles con beneficios confirmados en pacientes con cánceres HER2 positivos, incluido el tipo² con HER2 bajo. La confirmación del estado positivo para HER2 es fundamental para la identificación ....

Protocolo

1. Cultivo de células cancerosas humanas

1. Cultivo de las líneas MDA-MB-231, SK-BR-3 y SK-OV-3 en el medio Modified Eagle de Dulbecco que contiene 4,5 g/L de ᴅ-glucosa (DMEM-HG), suplementado con 2 mM de ʟ-glutamina y 10% (v/v) de FBS inactivado por calor. Incubar los cultivos a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO₂.
2. Cuando el cultivo alcance ~80% de confluencia, separe las células por tripsinización y recójalas en tubos cónicos separados de 15 mL.
3. Cuente las células con un contador automático de células y las células semilla para el experimento en placas de 12 pocillos a una densidad de 3 × 10⁵

Resultados

Validación ELISA sándwich
El ensayo recientemente desarrollado requiere un procedimiento de validación. Los parámetros de validación importantes incluyen linealidad, precisión y límites de detección, es decir, límite inferior de detección (LLOD) y límite superior de detección. En el artículo anterior, hemos realizado una validación exhaustiva del método. La linealidad del ELISA se probó utilizando las muestras simuladas para concentraciones bajas (2, 5, 10 ng/mL), medias-altas (30 ng/mL) y significati.......

Discusión

Entre los componentes críticos en la construcción de un ELISA sándwich, se encuentran los anticuerpos de captura que se inmovilizan en la placa y contribuyen a la especificidad y sensibilidad del ensayo. En el ensayo presentado, hemos empleado como anticuerpo capturador la nueva proteína monoclonal (HER2/70.27.58) generada y caracterizada internamente. El anticuerpo tenía una secuencia única de la CDR (región determinante de la complementariedad) y, en base a la afinidad, presentaba una .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de etiquetado de biotina-NH2	Abnova	KA0003
Grado de transferencia, leche en polvo, bajo en grasa	Roth	T145.1
Portaobjetos de recuento de células para contador de células TC10 / TC20, placas de	Bio-Rad	145-0011
	Biologix	07-6012
Raspadores de células	Biologix	70-1250
Centrifugadora	Ohaus	30130868
Clase II Gabinete de Seguridad Biológica - Telstar Bio II Advance 6	Telstar	/A
Placas transparentes de fondo plano de 96 pocillos	Thermo Fisher	442404
Incubadoras seguras para cultivos de CO2 - Touch 190S	Leec	N/A
Dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	D2650
DMEM - alto contenido de glucosa	Sigma Aldrich	D0822
Lector de placas ELISA	BioTek	800TSUVI
FBS Standard, suero fetal bovino	PAN Biotech	P30-19375
Secador de laboratorio de circulación forzada	BINDER	9090-0018
HRP-Avidin	Thermo Fisher	43-4423
Proteína humana Her2 / ErbB2, etiqueta Fc, grado premium	AcroBIOSYSTEMS	HER2-H5253
Lavadora de microplacas	Immunowash Bio-Rad	170-7009
Solución de L-glutamina	Sigma Aldrich	G7513
mAb a-HER2 (clon 70.21.73.67)	SDS Optic	BIO-ABH-2
mAb a-HER2 (clon 70.27.58)	SDS Optic	BIO-ABH-1
MDA-MB-231 Línea celular	ATCC	HTB-26
NaHCO3	POCH	810530115
NaOH	POCH	BA0981118
Cóctel inhibidor de la proteasa	Sigma Aldrich	P8340
RIPA Buffer	Sigma Aldrich	R0278
ROTI Fair PBS	Roth	1111.2
SK-BR-3 [SKBR3] Línea celular	ATCC	HTB-30
SK-OV-3 [SKOV-3; SKOV3] Línea celular	ATCC	HTB-77
Solución de parada 1x	Abcam	ab210900
TC20 Contador celular automatizado	Bio-rad	1450102
sustrato TMB 1x	Abcam	ab210902
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Vortex		Ohaus 30392117
Agitador de movimiento ondulatorio	Ohaus	30391968

cultivo celular de doble cámara N