Obtención rápida de imágenes de alta resolución de la vasculatura de animales pequeños para estudios cuantitativos

Daibo Zhang; Stephanie E. Lindsey

doi:10.3791/68206

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Artículo de método

Obtención rápida de imágenes de alta resolución de la vasculatura de animales pequeños para estudios cuantitativos

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DOI:

10.3791/68206

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23 de mayo de 2025

Daibo Zhang¹ , Stephanie E. Lindsey¹

¹Mechanical and Aerospace Engineering, University of California San Diego

En este artículo

Resumen

Este protocolo introduce un método rápido para la obtención de imágenes vasculares tridimensionales cuantitativas de montaje completo mediante microscopía de fluorescencia de lámina de luz. La eficacia del método se demuestra utilizando el sistema de arterias de arco faríngeo del modelo de embrión de pollo, con fuerzas hemodinámicas cuantificadas mediante dinámica de fluidos computacional.

Resumen

En modelos de desarrollo y enfermedades cardiovasculares de animales pequeños, las simulaciones computacionales del flujo sanguíneo específicas del sujeto permiten evaluaciones cuantitativas de métricas hemodinámicas que son difíciles de medir experimentalmente. Las simulaciones computacionales de dinámica de fluidos arrojan luz sobre el papel fundamental de la mecánica en la función cardiovascular y la progresión de la enfermedad. La adquisición de imágenes volumétricas de alta calidad de los recipientes de interés es fundamental para la precisión y la reproducibilidad de los resultados de la medición morfológica y la cuantificación del flujo. Este estudio propone un método rápido, rentable y accesible para obtener imágenes de alta resolución de la vasculatura de animales pequeños utilizando microscopía de fluorescencia de lámina de luz. El protocolo modificado de preparación de muestras de hoja ligera iDISCO+ (imágenes tridimensionales habilitadas para inmunoetiquetado de órganos aclarados con solvente) implica (1) etiquetar la vasculatura con un agente fluorescente, (2) preservar la muestra y (3) hacer que la muestra sea transparente. A diferencia del iDISCO+ clásico, que utiliza la tinción inmunohistoquímica, los autores etiquetan el endotelio vascular con poli-L-lisina marcada con FITC, un colorante fluorescente no específico asequible que es altamente resistente al fotoblanqueo, en un proceso denominado "endopintura". El etiquetado rápido reduce el tiempo de preparación de la muestra de aproximadamente cuatro semanas a menos de 3 días. Además, el uso de un disolvente mínimamente peligroso de cinamato de etilo (ECi) como agente de limpieza y solución de imagen hace que las muestras sean más seguras de manipular y cumplan con una gama más amplia de instalaciones de imagen. El protocolo propuesto se aplica para obtener pilas de imágenes de microscopía de fluorescencia de lámina de luz de alta resolución del sistema cardiovascular en embriones de pollo que van desde el día 3 (HH18) hasta el día 8 (HH34). Este estudio demuestra aún más la idoneidad de este método para la cuantificación vascular a través de la reconstrucción 3D y el modelado hemodinámico computacional de un embrión de pollo de día 5 (HH 26).

Introducción

Las imágenes volumétricas son necesarias para estudios precisos de la fisiología y las enfermedades cardiovasculares. Las imágenes cuantitativas producen pilas de imágenes de alta resolución con dimensiones volumétricas intactas. Las muestras deben conservarse para mantener su morfología in vivo y su volumen de lúmenes, así como obtener imágenes en una capacidad uniforme de alta resolución. A partir de pilas de imágenes de alta resolución, el usuario puede generar representaciones vasculares tridimensionales de alta fidelidad que permiten una visualización completa de las formas, la estructura y^{la conectivid....}