Artículo de método

Nuevo modelo de islotes para el estudio 3D de las interacciones endoteliales y celulares β: relevancia para el cribado de agentes citoprotectores

DOI:

10.3791/68220

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17 de abril de 2026

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1Regenerative Nanomedicine (RNM), UMR 1260, INSERM (French National Institute of Health and Medical Research), University of Strasbourg, 2Department of Emergency, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Research Center, CHU de Québec -Laval University, 4Department of Microbiology-Infectiology and Immunology, Faculty of Medicine, Laval University, 5Department of Diabetes and Nutrition Endocrinology, University Hospital of Strasbourg, 6Faculty of Medicine, University of Strasbourg, 7Faculty of Pharmacy, University of Strasbourg

En este artículo

Resumen

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Este protocolo proporciona un procedimiento detallado para generar esferoides estables de islotes pancreáticos murinos, y métodos detallados para la tinción, limpieza y montaje en 3D, adaptados a su pequeño tamaño.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalla un método optimizado para la producción de pequeños esferoides estables, su cultivo e imagen 3D, para el estudio de las interacciones endoteliales y de células β productoras de insulina en un modelo 3D de islotes pancreáticos. Los esferoides de 150-200 μm, reflejando el rango más bajo de tamaños de islotes, se prepararon a partir de una proporción seleccionada que combinaba 1 célula endoteliala intra-islote (células MS-1) a 20 células secretoras de insulina (β-TC-6). Se detallan los retos de tinción, limpieza y montaje de pequeños esferoides y su tackling mediante el uso de agarosa de bajo punto de fusión y la técnica de limpieza CUBIC, así como puntos clave para un análisis eficiente de la estructura 3D con diferentes sondas. Los datos indican que la NTPDASE-ectonucleotidasa 3 no colocaliza con la insulina en el modelo esferoide, lo que sugiere niveles variables de madurez y funcionalidad de β-TC6, y que el procedimiento completo también puede aplicarse a islotes pancreáticos aislados, con una clara sondeación de vasos intra-islotes. Estos hallazgos subrayan la eficacia del protocolo de imagen 3D para revelar la organización y las interacciones complejas de las células pancreáticas dentro del modelo de islotes.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El trasplante de islotes pancreáticos suele complicarse por una reacción inflamatoria instantánea mediada por sangre (IBMIR), que daña significativamente las células endoteliales intra-islotes (CEI), afectando a la perfusión y función del injerto. A largo plazo, se describe en pacientes una reducción de la masa de islotes funcionales y la pérdida de independencia de la insulina en los pacientes, 4 años después deltrasplante 1. Aunque se han desarrollado modelos de trasplante de islotes en ratones o ratones, faltan modelos estandarizados para investigar objetivos farmacológicos para el preacondicionamiento de islotes, especialmente relevantes en el contexto del daño por injertos inducido por citocinas inducido por elIBMIR. De hecho, un constructo esferoideo es especialmente adecuado para la identificación de nuevos objetivos farmacológicos y la evaluación de moléculas citoprotectoras frente a disfunción celular inducida por citocinas. Además, ofrece un enfoque alternativo para limitar el uso de modelos animales de diabetes tipo 1 y trasplante de islotes.

Sigue siendo un reto encontrar la tinción adecuada, el despeje óptico y las condiciones de montaje para pequeños esferoides de un rango de tamaño de islote. En la literatura, muy pocos estudios describen el manejo de pequeños esferoides y sus características estructurales clave. La dificultad también surge de la necesidad de equilibrar la penetración de tejidos, la preservación de la señal y la integridad estructural, manteniendo al mismo tiempo la delicadeza de estas estructuras celulares 3D en miniatura. Además, los métodos convencionales de tinción suelen tener dificultades para lograr un etiquetado uniforme de los esferoides. Este problema se agrava por la densa organización celular, que puede dificultar la difusión de los reactivos debido a la limitada penetración de anticuerpos ycolorantes 3,4. Finalmente, el proceso de limpieza óptica, crucial para reducir el fondo de dispersión de luz y mejorar la profundidad de imagen, debe optimizarse cuidadosamente para evitar alterar la estructura del esferoide o alterar propiedadesbiológicas 5.

Montar pequeños esferoides para microscopía 3D supone otro desafío. Los medios de montaje tradicionales pueden no proporcionar un soporte adecuado para estas delicadas estructuras, lo que podría provocar su deformación o colapso durante la imagen. Además, la adaptación del índice de refracción necesaria para una calidad óptima de imagen debe controlarse con precisión para garantizar una visualización exactitud a lo largo de toda la profundidad delesferoide 6,7. El desarrollo de protocolos adaptados a pequeños esferoides se complica aún más por la diversidad de tipos celulares y condiciones experimentales utilizadas en cultivosesferoides 3. Por último, la necesidad de enfoques especializados para mantener la integridad de múltiples poblaciones celulares a lo largo de los procesos de tinción y eliminación es fundamental para la evaluación de las respuestas celulares.

Para abordar los desafíos específicos del estudio del estrés mediado por islotes por IBMIR, se diseñó un modelo esferoide de 2000 células, que combinaba IEC murino y células β secretadoras de insulina, con una proporción de 1:20 de IEC a β células similar a la observada en un islote pancreático. Además, experimentos previos establecieron que la estructura mantiene la viabilidad durante 96 horas, proporcionando así un modelo 3D fisiológicamente relevante para la observación de respuestas celulares inducidas por estrés cortas (horarios) o más largas (días) y su modulación farmacológica. El modelo esferoide está compuesto por células endoteliales intra-islotes murinas MS-1, características de la microvasculatura del islote y células constitutivas secretadoras de insulina β, β-TC-68. Fue diseñado para imitar de cerca el rango dimensional más pequeño de los islotes pancreáticos (50-200 μm de diámetro) y su número mediode celda 9.

Se ha informado de una novedosa metodología de cosecha y tinción específicamente optimizada para el manejo de pequeños esferoides (150-200 μm de diámetro), que permite una penetración óptima de tintes fluorescentes y anticuerpos a lo largo de la estructura esferoide y un fondo mínimo. El protocolo incorpora un procedimiento de montaje que utiliza agarosa de bajo punto de fusión (LMPA) para proporcionar un soporte estructural suave a esferoides delicados, permitiendo al mismo tiempo una adaptación óptima del índice de refracción. LMPA es una forma modificada de agarosa con reducción de gelificación (unos 27 °C) y temperatura de fusión (unos 65 °C) que preserva la integridad de la muestra durante la incrustación y crea una matriz ópticamente clara con una autofluorescenciamínima 4,6. Finalmente, se emplea el método de imágenes claras, sin obstrucciones, y análisis computacional (CUBIC)10 para el aclaramiento óptico, con el fin de permitir la máxima visualización de estructuras internas y la preservación de la integridad de las delicadas interaccionescélula-célula 5,6,10.

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Protocolo

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El uso de tejido pancreático humano y todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Ministerio de Educación Superior e Investigación del gobierno francés (Dirección General de Investigación e Innovación, Unidad de Bioética) y registrados con el número DC-2019-3439. Se obtuvo el consentimiento informado de los tutores legales de todos los sujetos.

1. Preparación de los esferoides

NOTA: La línea IEC murina MS-1 y la línea celular β-pancreática murina β-TC6 se cultivaron simultáneamente para obtener una cantidad celular suficiente para el cultivo de esferoides. Los MS-1 se cultivaron en frascos de células adherentes T75 en un medio de alta glucosa DMEM que contenía 4,5 g/L de glucosa, con un 5% de suero fetal bovino y 1% de penicilina/estreptomicina, en una atmósfera húmeda a 37 °C. Los pasos se realizaron en confluencia (2 días de cultivo) tras el desprendimiento usando tripsina EDTA 1x y tres lavados en solución Hank Balanced (HBSS). β-TC6 se cultivaron en T75 para células adherentes difíciles en un medio de alta glucosa DMEM que contenía 4,5 g/L de glucosa, con un 15% de suero bovino fetal y un 1% de penicilina/estreptomicina en una atmósfera húmeda a 37 °C. Los pases se realizaron en la confluencia β-TC6 (cultivo de 10 días) tras el desprendimiento mediante lavados de tripsina EDTA 1x y 3 en solución equilibrada Hank (HBSS).

  1. Prepara la placa de cultivo esferoide
  2. Lava la placa con 500 μL de solución antiadherente proporcionada por el fabricante para evitar la adhesión celular y promover la formación de esferoides.
  3. Centrifuga la placa a 1.300 x g durante 5 minutos en un rotor de cubo giratorio equipado con portaplacas a temperatura ambiente.
  4. Observa la placa bajo un microscopio óptico para asegurarte de que no quedan burbujas en los micropozos. Si es así, centrifuga una segunda vez a 1.300 x g durante 5 minutos.
  5. Descarta el enjuague antiadherente y lava el pozo 3 veces con 1 mL de HBSS tibio.
  6. Descarte el HBSS y reemplace por 500 μL de medio esferoide tibio: DMEM Glucosa Alta que contiene 4,5 g/L de glucosa, suero bovino fetal al 10% y 1% penicilina/estreptomicina.
  7. Mantén la placa a 37 °C en una atmósfera húmeda mientras preparas la suspensión esferoide.
  8. Incubar MS-1 y β-TC6 simultáneamente con solución de tripsina y contar las células vivas de cada linaje.
    NOTA: Al sembrar, los esferoides se forman usando la proporción de 1 IEC a 20 células β típica de los islotes pancreáticos. Utiliza una placa de cultivo esferoide de 24 pozos, con cada pozo conteniendo 300 micropozos que podrían albergar un esferoide compuesto por 2000 células, para un total de 600.000 células por pozo. En la presente investigación, las mediciones revelaron volúmenes esferoides idénticos ocupados por las líneas celulares seleccionadas de β-TC6 y MS1 tras el cultivo esferoide de 48 horas.
  9. Mezclar las dos líneas celulares para corresponder a la proporción 1 a 20 para 24 pozos y luego suspenderlas en 24 mL de medio esferoide.
    NOTA: Utiliza una pipeta de 10 mL o 25 mL en movimiento de succión-flujo para homogeneizar la suspensión.
  10. Pipetear 1 mL para cada pozo y proceder en un movimiento de succión-flujo para distribuir la suspensión de la celda de manera uniforme en el pozo.
  11. Centrifuga la placa a 130 x g durante 5 minutos en un rotor de cubo giratorio equipado con portaplacas a temperatura ambiente.
  12. Observa la placa bajo un microscopio para asegurarte de que las células se distribuyen de forma equitativa entre los micropozos.
    NOTA: Durante este paso de centrifugación, utilice altas tasas de aceleración y desaceleración (70%-90% de las escalas de aceleración y desaceleración), o los agrupamientos celulares se desplazarán hacia el lateral del micropozo.
  13. Incubar la placa a 37 °C, 5% de CO2.
  14. Monitoriza la formación y crecimiento de los esferoides usando un microscopio óptico.
    NOTA: Los esferoides β-TC6 / MS-1 deberían comenzar a formarse tras 24 horas de cultivo, alcanzando una forma esférica tras 48 horas. La viabilidad puede monitorizarse mediante azul de tripán tras la interrupción de la esferoide por tripsina en muestras duplicadas y se mantuvo durante 96 horas (80%-90%).

2. Cosecha y tinción de esferoides

  1. Resuspende los esferoides suavemente con una pipeta P1000 en su medio.
  2. Expulsa los esferoides en pequeños volúmenes en un Falcon de 15 mL y centrifuga a 130 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente
  3. Aspira suavemente el medio evitando el pellet que contiene los esferoides.
  4. Lava el pellet dos veces con 2 mL de HBSS, suavemente, para evitar la disociación de los esferoides, y centrifuga a 130 x g durante 5 minutos.
  5. Bajo una capucha química, descarta el HBSS y vuelve a suspender los esferoides en 1 mL de solución de PFA al 4% durante la noche a 4 °C para fijarlos.
  6. Centrifuga el tubo a 130 x g durante 5 minutos, descarta la solución de PFA al 4% y lávalo 3 veces con 2 mL de PBS 1x (preparado en agua ultrapura de grado laboratorio).
  7. Resuspende en 2,5 mL de HBSS.
  8. Distribuye la suspensión esferoide en una placa de 6 pozos.
  9. Bajo una lupa binocular, selecciona manualmente entre 20 y 30 esferoides con una pipeta P200 y colócalos en un tubo de 1,5 mL.
    NOTA: Cada tubo de 1,5 mL es una condición de tinción que contiene entre 20 y 30 esferoides. Por debajo de 20 esferoides cosechados, resulta difícil verlos cuando se vuelven a suspender.
  10. Equilibrar los volúmenes de los tubos de 1,5 mL y centrifugar a 800 x g durante 5 minutos.
    NOTA: A partir de este momento, todos los pasos de aspiración de la solución se realizan con la ayuda de una lupa. Es muy difícil ver esferoides bajo luz artificial. Realiza siempre los siguientes pasos durante el día, manteniendo los tubos protegidos de la luz del día. Todas las soluciones se aspiran con una punta P1000 coronada por una punta P10 en su extremo.
  11. Quita la mayor cantidad posible de HBSS sin volver a suspender los esferoides.
  12. Resuspender los esferoides en 400 μL de solución de temple (0,5 M glicina en 1x PBS (pH 7-7,4)) para evitar cualquier ruido de fondo futuro causado por aldehídos restantes de la fijación de PFA. Incuba a 37 °C durante 2 horas.
  13. Centrifuga a 800 x g durante 5 minutos y pipeta con la solución de temple.
  14. Resuspender en 400 μL de tampón de penetración (0,2% Triton X-100, 0,3 M glicina, 20% DMSO en 1x PBS). Esto ayudará a mejorar la penetración de anticuerpos y sondas nucleares. Incuba a 37 °C durante 2 horas.
    NOTA: A partir de esta etapa, los esferoides se asientan por sí solos y ya no se aferran a la pared del tubo. La centrifugación ya no es necesaria si los volúmenes se aspiran suavemente sin alterar el pellet esferoide. Si es necesario, centrifuga a 800 x g durante 5 minutos.
  15. Desechar el tampón de penetración e incubar 400 μL de tampón bloqueante (0,2% Triton X-100, 1% BSA, 10% DMSO, 5% suero de cabra en 1x PBS) durante la noche a 37 °C.
  16. Desechar el tampón bloqueante e incubar durante la noche a 37 °C en 300 μL de solución primaria de anticuerpos (0,2% Tween 20, 1% BSA, 5% DMSO, 5% suero de cabra en 1x PBS).
    NOTA: Los anticuerpos primarios utilizados son: anti-CD31 (concentración final de 2,2 μg/mL), antiintegrina β1 (1,43 μg/mL), antiinsulina (0,66 μg/mL) y anti-ratónNTPDasa3 11 (dilución 1:1000) (véase Tabla de Materiales). Las IgG de control de los respectivos isotipos idénticos deben validarse en la misma estructura para determinar el marcaje positivo mediante microscopía fluorescente.
  17. Descarta la solución primaria de anticuerpos y lava 3 veces con 400 μL de tampón de lavado (0,2% Tween 20, 1% BSA en 1x PBS). Sacúdelo durante 5 minutos entre lavados.
  18. Incubar 300 μL de la solución secundaria de anticuerpos (DAPI (2 μg/mL), 0,2% Tween 20, 1% BSA, 5% DMSO, 5% Suero de cabra en 1x PBS) durante la noche a 37 °C. Protege los tubos con papel de aluminio.
    NOTA: El DAPI siempre debe añadirse a las condiciones de tinción, ya que facilita la localización de esferoides durante la microscopía y ayuda a evitar blanquear los diferentes fluoróforos/colorantes. Todos los anticuerpos secundarios tienen una concentración final de 2 μg/mL (véase la Tabla de Materiales).
  19. Descartar la solución secundaria de anticuerpos y lavar 3 veces con 400 μL de un segundo tampón de lavado: 0,2% Tween 20, 1% BSA en 1x PBS. Mantén el último lavado y guarda los tubos a 37 °C hasta montarlos el mismo día.

3. Preparación de la solución

  1. Preparación de la solución de despeje óptico
    NOTA: La solución de eliminación óptica sigue el procedimiento CUBIC10 y fue preparada según lo propuesto por Gunasingh etal 4. Las proporciones de los componentes se dan en porcentajes del peso final de la solución (p/p), porque la etilendiamina Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis(2-hidroxipropilo) es demasiado viscosa para ser pipeteada y debe pesarse.
    1. En una botella de cristal, pesa el 9% (p/p) de N,N,N′,N′-Tetrakis (2-Hidroxipropilo) etilendiamina, el 22% (p/p) de urea, el 44% (p/p) de sacarosa, 0,1% (p/p) de Triton X-100 y el 24,9% (p/p) de agua ultrapura de grado laboratorio.
      NOTA: Se necesitan unos 60 g de solución para limpiar una placa de 24 pozos.
    2. Añade una barra magnética adaptada al diámetro de la botella.
    3. Calienta y remueve la solución a 56 °C. Mantén una botella de cristal de control llena de agua en la misma placa para monitorizar el aumento de temperatura.
    4. Controla la velocidad de agitación para mantener un vórtice líquido suave y remueve la solución hasta que todos los compuestos estén completamente disueltos. La solución debe ser completamente líquida y transparente. Esto puede tardar hasta 1 hora.
    5. Mantenlo a temperatura ambiente, protegido de la luz.
      NOTA: La solución de aclaración debe prepararse al menos 24 horas antes del despeje óptico, para permitir que la solución se desgasifice y elimine cualquier burbuja que pueda contener. Para evitar introducir burbujas, no vuelvas a agitar la solución. Nunca se guarde en almacenamiento en frío.
  2. Preparación de la solución LMPA al 2%
    1. Pesa 0,5 g de LMPA en una balanza de precisión y colócala en un matraz Erlenmeyer de 100 mL.
      PRECAUCIÓN: No tomes un Erlenmeyer de menor volumen, ya que existe riesgo de quemaduras si se desborda.
    2. Disuelve en 25 mL de 1x PBS a temperatura ambiente.
    3. Incorpora bien el polvo en el PBS 1x removiendo suavemente el matraz de Erlenmeyer.
      PRECAUCIÓN: Para el siguiente paso, es esencial usar equipo de protección: guantes y mascarilla para los ojos y la cara, para protegerse de salpicaduras y quemaduras.
    4. Calienta el termo Erlenmeyer en el microondas.
    5. Observa cuando la solución empieza a hervir (presencia de burbujas en el líquido) y retira inmediatamente antes de que se desborde.
    6. Remueve suavemente el Erlenmeyer para incorporar el polvo.
      PRECAUCIÓN: No removas con demasiada fuerza, ya que el líquido puede desbordarse, hervir y salpicar.
    7. Devuelve el Erlenmeyer al microondas y repite hasta que la LMPA esté completamente disuelta.
    8. Retira el Erlenmeyer y, antes de que la LMPA se solidifique, añade rápidamente 1 mL de solución LMPA al 2% en tubos de 1,5 mL. Guárdalo a temperatura ambiente.
      NOTA: El proceso lleva mucho tiempo. Prepara la solución con antelación y guárdala para usarla más adelante.

4. Montaje y despeje óptico

  1. Precalienta la centrífuga de la placa a 40 °C, realizando un ciclo largo para preparar la placa de muestra.
    NOTA: Geles LMPA a 30 °C. No dejes la centrífuga por debajo de 40 °C. Si la centrífuga lo permite, aumenta a 50 °C.
  2. Licua alicuotas de LMPA al 2% en un baño maría o calentador de tubo a 70 °C durante 5 a 10 minutos.
  3. Baja y mantiene la temperatura del LMPA al 2% en 55 °C.
  4. Coloca la placa de imagen suavemente sobre el calentador de placas precalentado a 50 °C.
    NOTA: Ten cuidado de no romper ni arañar el frágil polímero que se utiliza como base para los pozos.
  5. Ten cuidado de que la placa esté caliente antes de añadir el LMPA al 2%. No debe encajar en esta etapa.
  6. Pipetear 200 μL de LMPA al 2% en cada pozo. Cubre toda la parte inferior del soporte para obtener una primera base líquida, lo que permite una distribución más fluida de los esferoides.
  7. Descarta el buffer de lavado de los tubos, vuelve a suspender los esferoides a 300 μL de LMPA al 2% y pipetearlos directamente en su pozo. Realiza siempre una resuspensión suave para evitar burbujas.
  8. Cubre la placa con papel de aluminio para proteger los fluoróforos.
  9. Pesa rápidamente la placa sin el papel de aluminio y devuélvela al calentador de placas.
  10. Prepara una placa de 24 pozos, añadiendo agua para equilibrar.
  11. Retira rápidamente la placa con papel de aluminio del calentador para proteger los fluoróforos acoplados a los anticuerpos secundarios. Mantén la mano y no la coloques sobre una superficie fría.
  12. Quita el papel de aluminio y colócalo en la centrífuga de placas.
  13. Centrifugar a 1000 x g durante 15 minutos a 40 °C. Comprueba la temperatura del rotor, que debería estar a temperatura ambiente.
  14. Durante la centrifugación, prepara una bandeja para hielo: aplana el hielo para que la placa pueda colocarse sobre una superficie plana.
  15. Quita el plato y colócalo sobre el hielo, cubriendo la bandeja o plato con papel de aluminio. Deja el plato en hielo durante 10 minutos.
  16. Retira la placa del hielo y déjala en el aluminio para estabilizar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
  17. Pipetear de 1 a 1,5 mL de la solución de limpieza por pozo, cubrir con papel de aluminio y dejar que se despeje ópticamente a temperatura ambiente, protegido de la luz, durante al menos 48 horas.
    NOTA: Nunca guardes la placa a 4 °C. La LMPA puede contraerse, desprenderse del fondo del pozo y flotar en la solución de despeje. Imagen dentro de una semana tras el despejado.

5. Imagen

  1. Usa un microscopio de disco giratorio confocal, elige (como mínimo) el objetivo 30x.
  2. Mantén las soluciones de clearing, ya que sirven para homogeneizar los índices de refracción y facilitan la obtención de imágenes 3D.
  3. Encuentra los esferoides seleccionando el canal DAPI para evitar blanquear a los otros fluoróforos.
  4. Adquiere imágenes usando la función Z-stack. Selecciona la parte superior e inferior del esferoide y espacia los cortes ópticos a 10 μm de distancia.
    NOTA: La adquisición y análisis de imágenes se realizaron en la Plataforma de Imagen del CRBS, PIC-STRA UMS 38, Inserm, Unistra.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para evaluar la efectividad del marcado y el aclaramiento óptico, varios modelos fueron sometidos al mismo protocolo y posteriormente fijados (Figura 1). Se cultivaron esferoides con proporciones de 1 IEC a 20 β-celdas y 1 IEC a 50 β-celdas según el método descrito anteriormente. Cabe destacar que la proporción de 1 IEC por 20 β células se aproxima a la de un islote pancreático humano. El uso de azul de tripán para teñir esferoides alterados ha confirmado qu...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se ha desarrollado un modelo esferoide que incorpora la IEC murina MS-1 y células β murinas β-TC6 que imita la estructura tridimensional de los islotes pancreáticos. Este modelo es adecuado para el análisis de la disfunción IEC inducida por estrés durante 72 horas y su impacto en la viabilidad y función de las células β, con relevancia para la investigación en trasplantes de islotes. Es importante destacar que el esferoide compuesto por células murinas era homogéneo por naturaleza y con ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores están en deuda con Pascal Kessler, de la plataforma de imagen PICSTRA, por su asistencia experta en la microscopía de discos giratorios y la extracción de los datos de etiquetado en bruto de la pila Z. Los autores desean reconocer el generoso regalo de islotes humanos purificados por el Dr. W. Bietiger, el Dr. A. Langlois y el Dr. K. Bouzakri del Centro Europeo para el Estudio de la Diabetes (CEED, Estrasburgo, Francia)

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
µ-placa de 24 pozos Black ID 14 mm IBIDI82426
AggreWell 800 (24 pozos)StemCell34815
Solución de enjuague antiadherencia StemCell7010
Anticuerpo anti-CD31 [P2B1]ABCAMab24590Concentración final 2.2 y micro; g/mL
Antiintegrina y beta; 1 Anticuerpo, clon MB1.2MerckMAB1997 Concentración final 1,43 y micro; g/mL
Matraz de cultivo celular, T-75, superficie, superficie  : Célula+, tapa filtranteSarstedt83.3911.302β-TC6 cultura
Matraz de cultivo celular, T-75, superficie: estándar, tapa de rosca de 2 posicionesSarstedt83.3911.02Cultura MS-1
Dihidrocloruro DAPIThermofisher,D1306Concentración final 2 y micro; g/mL
Dimetilsulfóxido  SigmaD8418-250ML
DMEM, glucosa alta, GlutaMax y comercio; Suplemento, piruvatoThermofischer Scientific31966047
Dulaglutida
DulaglutidaLilyBolígrafo Trulicity 1,5 mg
Suero fetal bovinoBiowestS1810-500
GlicinaSigmaG7126-1KG
Anti-conejillo de cabra IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor & trade; 555ThermofischerA21435Concentración final 2 y micro; g/mL
Anticuerpo secundario anti-ratón (H+L) de cabra altamente adsorbido cruzadamente, Alexa Fluor & trade; 488Thermofischer  A-11029Concentración final 2 y micro; g/mL
Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado por IgG anticonejo de cabra (H+L), Alexa Fluor & trade; 633ThermofischerA-21071Concentración final 2 y micro; g/mL
Anticuerpo secundario adsorbido cruzado anti-ratas (H+L) para cabras, Alexa Fluor & trade; 555ThermofischerA21434Concentración final 2 y micro; g/mL
Suero de cabraSigmaS26-100ML
HBSS sin calcio ni sin calcio; magnesio y nbsp; & Rojo fenolCorning21-022-CV
Insulina (C27C9) MAb de conejoSeñalización celular3014SConcentración final 0,66 y micro; g/mL
Islote pancreático humano aislado Centro Europé en d'Étude du Diabete (CeeD)Un amable regalo del Dr. Karim Bouzakri. Grado clínico, aislado según las directrices.
Baja temperatura de gelado AgaroseMerckA9414-10G
Celdas MS-1ATCCCRL-2279
Solución de paraformaldehído, 4% en PBS 1xFischer Scientific15670799
PBS 10xEuromedexET330-ADiluido 1x en agua ultrapura de grado de laboratorio
Penicilina-estreptomicinaPAN BiotecnologíaP06-07100
Anticuerpos anti-NTPDasa3 de conejillo de indias policlonal en el ratón mN3-1CI4; mN3-2C (I4,I5); mN3-3C(I4,I5) https://ectonucleotidases-ab.com/Antibodies.phpDilución 1:1000
Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis(2-hidroxipropilo) etilenodiamina Sigma122262-1L
Disco giratorio Olympus IXplore SPIN Olympus Scientific Solutions
Sacarosa para biología molecularSigmaS0389-1KG 
Triton X-100 Grado de Laboratorio de BiocalidadEuromedex2000-A
Tripsina/EDTA (10 veces)PAN BiotecnologíaP10-025100
Preadolescente-20Euromedex//
UreaSigmaU-5128
Celdas β-TC6ATCCCRL-11506

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langlois, A., Pinget, M., Kessler, L., Bouzakri, K. Islet transplantation: Current limitations and challenges for successful outcomes. Cells. 13 (21), 1783(2024).
  2. Li, X., Meng, Q., Zhang, L. The fate of allogeneic pancreatic islets following intraportal transplantation: Challenges and solutions. J Immunol Res. 2018, 1-13 (2018).
  3. Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Front Mol Biosci. 7, 20(2020).
  4. Gunasingh, G., Browning, A. P., Haass, N. K. Rapid optical clearing for semi-high-throughput analysis of tumor spheroids. J Vis Exp. 2022 (186), e64103(2022).
  5. Paysan, J. The art of tissue clearing. , John Wiley & Sons Ltd. West Sussex. (2021).
  6. Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnol Bioeng. 116 (10), 2742-2763 (2019).
  7. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369(2021).
  8. Poitout, V., et al. Morphological and functional characterization of βTC-6 cells: An insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
  9. Ionescu-Tirgoviste, C., et al. A 3D map of the islet routes throughout the healthy human pancreas. Sci Rep. 5 (1), 14634(2015).
  10. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  11. Munkonda, M. N., et al. Characterization of a monoclonal antibody as the first specific inhibitor of human NTP diphosphohydrolase-3: partial characterization of the inhibitory epitope and potential applications. FEBS J. 276 (2), 479-496 (2009).
  12. Sbat, N. Study of the endothelial-to-mesenchymal transition of intra-islet endothelial cells in mice and its pharmacological modulation: Relevance for pancreatic islet transplantation. , Université Paris Cité. https://theses.hal.science/tel-03873595 (2021).
  13. Barillaro, M., Schuurman, M., Wang, R. β1-integrin: A key player in controlling pancreatic beta-cell insulin secretion via interplay with SNARE proteins. Endocrinology. 164 (1), bqac179(2023).
  14. Lavoie, E. G., et al. Identification of the ectonucleotidases expressed in mouse, rat, and human Langerhans islets: potential role of NTPDase3 in insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 299 (4), E647-E656 (2010).
  15. Giuliani, A. L., Sarti, A. C., Di Virgilio, F. Ectonucleotidases in acute and chronic inflammation. Front Pharmacol. 11, 619458(2021).
  16. Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-3 antibody targets adult human pancreatic β cells for in vitro and in vivo analysis. Cell Metab. 29 (3), 745-754.e4 (2019).
  17. Syed, S. K., et al. Ectonucleotidase NTPDase3 is abundant in pancreatic β-cells and regulates glucose-induced insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (10), E1319-E1326 (2013).
  18. Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868(2012).
  19. Rane, T. D., Armani, A. M. Two-photon microscopy analysis of gold nanoparticle uptake in 3D cell spheroids. PLoS One. 11 (12), e0167548(2016).
  20. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer multicellular spheroid analysis by two-photon microscopy. Biomed Opt Express. 13 (5), 3120(2022).
  21. Diosdi, A., et al. Single-cell light-sheet fluorescence 3D images of tumour-stroma spheroid multicultures. Sci Data. 12 (1), 492(2025).

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