Tomografía Serial de Alto Rendimiento usando un Robot Automatizado de Cambio de Muestras

Summary

Aquí se presentan y discuten los detalles de la implementación y el procedimiento de recogida de datos para la tomografía de rayos X basada en sincrotrón utilizando el robot automatizado de cambio de muestras en la línea de haz Diamond Light Source (DLS) I13-2. Esto mejora drásticamente el rendimiento y la eficiencia de recogida de datos de la línea de haz.

Abstract

Este manuscrito describe un flujo de trabajo para la recogida automatizada de datos que utiliza un brazo robótico para el intercambio de muestras, mejorando significativamente la eficiencia de la recogida de datos. El montaje, implementado para la imagen de rayos X sincrotrón en la Fuente de Luz de Diamante (DLS) I13-2, línea de haz de imagen, utiliza un robot para lograr tomografía serial (3D) o imagen (2D) de alto rendimiento. Actualmente, para muchos experimentos, el tiempo requerido para el intercambio y alineación manual de muestras es comparable o incluso supera la duración de la propia tomografía. Para maximizar el uso eficiente del tiempo disponible de haz y aumentar el rendimiento experimental, es esencial automatizar el intercambio y alineación de muestras. Usar el robot como cambiador de muestras puede aumentar el rendimiento al menos 4-10 veces en comparación con los procedimientos manuales, dependiendo del tamaño de píxel elegido. Con la máquina Diamond II y las mejoras de mografía TOcoherente Operando CI13L y maging Ptychographic I(OCTOPI), el aumento del flujo de rayos X reducirá aún más los tiempos de escaneo experimental, haciendo el sistema aún más eficiente. Además, la automatización permite la recogida remota de datos, incluyendo un servicio opcional de envío por correo para los usuarios. El centrado automatizado de muestras permite un escaneo totalmente sin supervisión, que puede realizarse de forma remota. Esto representa una característica única e innovadora del sistema. Este manuscrito describe todo el procedimiento, incluyendo la preparación de la muestra, el montaje en soportes especializados, el transporte hasta la línea de haz y la colocación en bandejas dedicadas para el intercambio robótico de muestras. Se presenta el procedimiento para el centrado automatizado de la muestra y la posterior cadena de reconstrucción tomográfica.

Introduction

La automatización se ha utilizado ampliamente en las industrias manufactureras pesadas durante^{décadas 1, 2, 3}. Sin embargo, el desarrollo de hardware y software robótico ha madurado lo suficiente como para poder realizar tareas muy delicadas como la secuenciación del genoma, realizar cirugías médicas en hospitales o ayudar en la realización de experimentos de química 4,5,6,7. La automatización no solo elimina errores humanos, sino que también mejora el rendimiento y la eficiencia⁴.

Una fuente de rayos X sincrotrón genera radiación electromagnética extremadamente brillante y altamente coherente en el amplio espectro que va desde el infrarrojo hasta los rayos X duros. Estas fuentes permiten experimentos de imagen de alto rendimiento y alta resolución con tiempos de escaneo muy cortos y estadísticas elevadas. La coherencia parcial puede utilizarse para lograr un mejor contraste en materiales blandos de absorción débil como polímeros o muestras de tejido ^8,9,10 en comparación con fuentes de rayos X de laboratorio. Un conjunto completo de datos de tomografía de rayos X —que permite la visualización de un objeto en 3D real— requiere la adquisición de proyecciones de la muestra desde diferentes ángulos. Los avances en brillo de fuente, hardware experimental y controles permiten tiempos de recogida de datos en el rango de decenas de segundos a^{minutos 8}. Como resultado, la carga y alineación de la muestra se han vuelto más laboriosas que la propia tomografía ^11,12. Es importante señalar que cambiar muestras manualmente en un experimento de tomografía sincrotrón puede llevar un tiempo considerable (en comparación con el tiempo de escaneo), ya que es necesario seguir un procedimiento de seguridad radiológica al entrar y cerrar la cabina experimental. Este procedimiento suele durar varios minutos. Además, la alineación de la muestra puede llevar unos minutos.

Si este proceso de cambio y alineación de muestras se automatiza, se ahorrará una cantidad significativa de tiempo. Por ello, se ha implementado un robot cambiador de muestras en la línea de haz I13-2 Imaging de la instalación de sincrotrón DLS. Este manuscrito describe el protocolo completo para realizar un experimento de microtomografía de rayos X sincrotrón con múltiples muestras utilizando un robot cambiador de muestras en la línea de haz I13-2 Imaging^11,12. Esta implementación no solo mejora la eficiencia del tiempo experimental, sino que también permite realizar experimentos de forma remota. La alternativa es el funcionamiento manual o semiautomático, ambos significativamente más lentos. Aquí, semi-automatizado significa usar el robot solo para el intercambio de muestras sin alineación de muestras.

La importancia de la automatización queda subrayada por proyectos de automatización en otras líneas de haz de imagen sincrotrón, siendo los proyectos más similares en la línea de haz 2BM de APS¹³, la línea de haz SLS^{TOMCAT 14}, la línea EMBL P14 en PETRA^{III 15} y la línea de haz IMAGE en la fuente de luz¹⁶ del Instituto de Tecnología de Karlsruhe (KIT). En el APS 2-BM, las muestras que requieren escaneo con un robot se montan en un soporte cinemático estándar, que se coloca en una bandeja de cambiador de muestras con capacidad máxima de 60 muestras a la vez. Un brazo de agarre recoge la muestra y la monta en la etapa de rotación. Sin embargo, la alineación de la muestra se realiza offline usando un estereoscopio. Un sistema similar se instaló en la línea de haz TOMCAT en SLS, excepto que aquí el proceso está totalmente automatizado, lo que puede realizar descarga de carga de muestras, alineación, escaneo de una región de interés correcta y reconstrucción. El número total de muestras que se pueden escanear a la vez es de 60. Recientemente, la línea de haz P14 en PETRA III¹⁵ ha instalado un sistema de cambio de muestras que puede manejar muestras biológicas blandas del orden de 1 mm. El posicionamiento y el centrado se realizan mediante el procedimiento de centrado de tres clics. En la línea de haz IMAGE en KIT, una estación terminal de imagen/tomografía de alto rendimiento permite la medición de hasta 1.500 muestras en dos días¹⁶. A diferencia de los sistemas robóticos mencionados anteriormente, el sistema de línea de haz I13-2 Imaging puede actualmente manejar muestras de hasta 8 mm de diámetro y medir hasta 112 muestras en un turno de ocho horas, sin intervención humana, incluyendo el centrado automático de la muestra.

El sistema actual de tomografía en I13-2, línea de haz Diamond-Manchester Imagining, ha sido reportado en la publicación^{mencionada 17}. Para mayor exhaustividad, aquí se resumen aspectos clave de los experimentos de tomografía; por favor, consulte también la Figura 1. La pila de la etapa de tomografía consiste en un hexápodo (PI miCos) para la manipulación de muestras así como para la alineación de inclinación del eje de rotación. Una etapa de rotación con cojinete de aire está montada sobre el hexápodo. La etapa de rotación presenta excelentes movimientos de oscilación (<2,4 μrad) y de error axial (<100 nm). El sistema detector de tomografía está equipado con cuatro aumentos diferentes (o campo de visión). Para el estudio actual, se han utilizado objetivos de 1,25× (tamaño efectivo de píxel de 2,6 μm con campo de visión de 6,7 mm x 5,6 mm) y 4× (tamaño efectivo de píxel de 0,81 μm con campo de visión de 2,1 mm x 1,8 mm). El objetivo de 1,25× tenía un centelleador LuAg:Ce de 500 μm, mientras que el objetivo 4x tenía un centelleador LuAg:Ce de 100 μm (Crytur). Un detector sCMOS (pco.edge 5.5) registra la imagen de pantalla de centelleo ampliada mediante un ocular fotográfico adicional 2x (todas las ópticas de microscopio son de Olympus). Los píxeles efectivos varían desde 2,6 μm hasta 0,33 μm, con una resolución de aproximadamente 1 μm en la máxima ampliación utilizada. El chip detector consta de 2560 x 2160 con un tamaño de píxel de 6,5 μm, y la velocidad máxima de lectura de la matriz de píxeles es de 100 Hz.

Protocol

NOTA: Este estudio utiliza especímenes de insectos del Museo de Historia Natural (NHM) de Londres para análisis fenotípicos comparativos. Los especímenes habían sido adquiridos por el Museo de Historia Natural, siguiendo los procedimientos estándar de adquisición para asegurar que los especímenes se habían recogido y donado legalmente.

1. Planificación del experimento

1. Comprobar la viabilidad de realizar experimentos de tomografía o imagen con la muestra de interés en la línea de haz I13-2 contactando con el personal de la línea de haz mediante el siguiente enlace: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Imaging-and-Microscopy/I13-2/Staff.html .
2. Envía una propuesta para obtener un horario para realizar el experimento previsto utilizando el siguiente enlace: https://www.diamond.ac.uk/Users.html.
3. Discutir la preparación de la muestra y el proceso de medición con el personal de la línea de haz una vez aceptada la propuesta y programado el experimento. Los experimentos realizados con el robot tienen ciertos requisitos, que se detallan en la siguiente sección (sección 2).
4. Discuta las dimensiones y composición de la muestra con el personal de la línea de haz para verificar que el experimento puede realizarse con éxito en la línea de haz.
5. Comienza a prepararte para la visita experimental con suficiente antelación siguiendo las instrucciones de la web (https://www.diamond.ac.uk/Users.html).
6. Completar la formación en seguridad antes de la sesión experimental.

2. Preparación de muestras (para experimentos con robots)

1. Preparar las bases de muestra^{compatibles con SPINE-Compatible 18} para el montaje de la muestra. Montar cada muestra sobre una base estándar de muestra estilo SPINE equipada con un código de barras Data Matrix para permitir el seguimiento automatizado de la muestra.
2. Acopla la muestra a la base usando una de dos configuraciones. Montaje de pinos: Fije la muestra en un pasador de muestra de estilo SPINE (véase la Figura 1C, inserto). Contenedor o montaje directo: Coloque la muestra dentro de un recipiente compatible, como un tubo microcentrífuga/tubo de poliimida, o directamente sobre la base de la muestra.
3. Comprueba la compatibilidad dimensional con el agarre del robot verificando que la muestra montada se ajuste a los tamaños permitidos para garantizar un manejo robótico seguro (véase la Figura 2):
   Opción A: Cabe dentro de un cilindro de 8 mm de diámetro x 20 mm de altura.
   Opción B: Encaja dentro de un cilindro de 3,5 mm de diámetro x 33 mm de altura.
4. Asegúrate de que ambas configuraciones estén centradas en la base de la muestra. Asegúrate de que la altura total (muestra + montaje + base) no supere los 27 mm o 40 mm, dependiendo de la configuración elegida.
5. Al montar muestras en pines de SPINE, asegúrate de que la muestra esté situada sobre el pasador, sin que ninguna parte de ella quede oculta por el eje del pasador. La muestra debe montarse vertical y en el centro sobre la base del pasador para evitar el contacto con la pinza del robot. Esto es especialmente importante para el montaje de la Opción B descrito en la sección 2.3 del protocolo, así como para muestras alargadas que se montan sobre los pines de muestra.
6. Al montar dentro de contenedores o tubos, asegura la muestra firmemente dentro del contenedor para que no se desplace durante el transporte o la manipulación robótica. Asegúrate de que el recipiente en sí permanezca alineado verticalmente sobre la base de la muestra.
7. Fija el elemento de montaje elegido (pasador o contenedor) de forma segura y vertical sobre la base de la muestra para asegurar la estabilidad posicional durante todo el experimento.
8. Utilice un adhesivo o método de fijación fiable para evitar desprendimientos durante el envío y manipulación automatizada, ya que ambos procesos pueden generar tensiones mecánicas.
   NOTA: Los adhesivos más comunes incluyen cianoacrilato (superglue), cera de parafina y cola termofusible. Consulta al personal de la línea de viga si no estás seguro de la compatibilidad del material.
9. Comprueba que todas las muestras estén posicionadas a una altura constante desde el borde superior del recipiente o sobre el pasador de muestra. Para las muestras montadas dentro de contenedores, asegúrate de que la distancia lateral respecto a la pared del contenedor sea la misma en todas las muestras.
   NOTA: La colocación consistente es esencial para una alineación automática fiable. Muestras más pequeñas en relación con el campo de visión permiten una mayor tolerancia.
10. Documenta el código de la Matriz de Datos asociado a cada muestra para asegurar la correcta identificación de la muestra durante el análisis de datos.
11. Genera un archivo samples.csv para relacionar cada nombre de muestra con su código matricial de datos base y para transmitir los parámetros relevantes para realizar tomografías.

3. Embalaje y entrega de muestras

1. A más tardar 15 días laborables antes de la sesión experimental, presentar la evaluación de riesgos experimentales (ERA) y declarar todas las muestras allí presentes. Esta ERA debe ser aprobada por el grupo de salud y seguridad (HSE) del DLS antes de que se permita enviar o traer muestras al lugar.
2. Utiliza la base universal de muestra con el almacenamiento combinado y/o contenedor de envío montado en el pasador de muestra, también llamado Uni-puck. Esto es bastante importante si se envía por correo.
3. Si las muestras no caben dentro de las ranuras del contenedor de almacenamiento mencionadas en el paso 3.2, por favor realice arreglos alternativos de montaje, como el uso de tapas protectoras magnéticas que se ajusten a la base de la muestra y que lleven directamente las muestras para las mediciones.

4. Montaje experimental

1. Ajusta los parámetros de la fuente de rayos X para maximizar el contraste en la muestra. Para lograrlo, desplaza todo el espectro y/o filtra el espectro de rayos X.
2. Optimiza la cámara para la distancia de muestreo en función del espectro de rayos X y el grado de contraste de fase deseado para una muestra dada.
3. Selecciona la ampliación del microscopio en función del tamaño de la muestra y el campo de visión requerido, y selecciona el objetivo correspondiente del microscopio.
4. Alinea la posición horizontal de la cámara (eje x en el laboratorio) respecto al haz de rayos X.

5. Carga y alineación de muestras

1. Revisa las muestras y el montaje de muestras minuciosamente al inicio de cada sesión experimental para detectar muestras que parezcan dañadas o montadas de forma floja. Informa a los usuarios sobre cualquier muestra de este tipo.
   NOTA: Actualmente, la línea de haz está equipada con monturas para hasta 7 discos, y cada disco puede contener hasta 16 muestras. Se pueden medir un total de 112 muestras durante una sola operación de robot. Por favor, consulte la Figura Suplementaria 2, que ilustra cómo identificar las posiciones de las ranuras del puck (pinos).
2. Montar muestras en los respectivos puck y ranuras de puck (pines) identificados en el archivo samples.csv. Realiza un ensayo en seco del procedimiento de intercambio de muestras del robot en algunas muestras para comprobar el funcionamiento del robot, así como para asegurarte de que las muestras están dentro de las especificaciones requeridas.
3. Utiliza una base de muestra con un pasador de muestra (sin muestra) para alinear el eje de rotación de la etapa de rotación con el centro del detector en dirección horizontal.
4. Mueve la parte superior del pasador al centro de la cámara de rayos X (Figura 3A). Alinea la cámara del telescopio (TC), que está situada a 90° respecto al haz, como se muestra en la imagen (Figura 3), para que esté en el centro del campo de visión (FOV). Determina las coordenadas de esta posición en coordenadas de píxeles TC.
5. Actualiza la posición objetivo de la muestra en el script que gestiona la alineación de la muestra.
6. Monta una muestra representativa. Ejecuta el script automático de alineación de muestras para colocar la muestra en el centro de rotación del TC. El enlace al guion se proporciona en el Archivo Suplementario 1.
7. Comprueba si la región de interés de la muestra (ROI) está centrada en el campo de visión (FOV) de la cámara de rayos X.
8. Si el ROI no está centrado en el campo de visión, repite los pasos 5.5 a 5.7 y refina la alineación de la muestra cambiando las coordenadas para la posición objetivo.
   NOTA: Las secciones 4 y 5 las realiza el contacto local excepto la sección 4.2.

6. Configuración de adquisición de datos

1. Comprueba que la estructura de archivos/carpetas requerida en el sistema de archivos DLS se haya creado para almacenar datos en bruto, archivos de metadatos y resultados de análisis.
2. Copia el archivo samples.csv a la carpeta mencionada en el paso 6.1.
3. Actualiza el tiempo de exposición de la cámara y el número de proyecciones para adquirirlas en el samples.csv, basándose en la estructura de la muestra y el contraste deseado.
4. Defina dos grupos de posiciones motoras llamadas Posición de Carga (LP) y Posición de Escaneo (SP). LP es el conjunto donde las etapas se optimizan para la carga de la muestra, y la SP para el escaneo tomográfico de la muestra.
   NOTA: La sección 6 la realiza el contacto local o se crea automáticamente por los sistemas DLS.

7. Realizar la recopilación de datos

1. Monta todas las muestras en las posiciones correctas del disco y del pin, según las instrucciones del archivo samples.csv.
2. Para la recogida de datos, utiliza el banco de trabajo Generic Data Acquisition (GDA), un software de código abierto desarrollado por DLS (https://alfred.diamond.ac.uk/documentation/manuals/GDA_User_Guide/master/introduction.html). Es un sistema basado en Java utilizado en DLS para controlar experimentos y recopilar datos. Una captura de pantalla se proporciona en la Figura Suplementaria 1.
3. Utiliza un objeto llamado tomomatic en GDA para cambiar automáticamente la muestra, alinear muestras y medir tomografía.
4. Emite el comando tomomatic.load (/dls/i13/data/year/... samples.csv) en el terminal GDA para cargar el archivo. Luego emite el tomomatic. escanea () para ejecutar el comando.
5. El robot primero recoge la muestra de la bandeja de carga y la lleva al lector de códigos láser. Una vez leído el código de barras, se traslada la muestra a la etapa de tomografía y se monta. Asegúrate de que todo el proceso funcione sin problemas.
   NOTA: Aquí se está utilizando un robot Yaskawa con el agarre de flexión desarrollado internamente.
6. Una vez realizada la carga de la muestra, las etapas se mueven a la posición SP. Después, se ejecuta la función autoCentrePin dentro del script tomomatic, que coloca la muestra en el Centro de Rotación (COR). La medición por tomografía por rayos X con un cambiador robot ya está lista para realizarse.
   NOTA: Por favor, consulte el Archivo Suplementario 1 para el pseudocódigo del sistema tomomático.
7. Realizar la función TomoFlyscan para la medición tomográfica. La función primero recoge 40 imágenes de proyección sin haz de rayos X, denominadas imagen oscura (DI), y 40 imágenes con haz de rayos X pero sin muestra en el haz, denominadas imágenes de campo plano (FI). Estas imágenes se utilizarán para la normalización de imágenes durante la reconstrucción de datos.
8. Recoge imágenes de proyección (PI) con la muestra en el haz en intervalos de ángulo de rotación de la muestra, como indica el archivo samples.csv. En el caso presente, tiene 3001 imágenes PI.
   NOTA: Todos los pasos, del 7.5 al 7.8, avanzan uno tras otro sin intervención humana.

8. Acceso a los datos y análisis

1. Accede a los datos guardados navegando por el sistema de archivos y la carpeta correspondientes. Los datos escaneados mencionados en la sección anterior se guardan en dos archivos diferentes, uno con *.nxs y *.hdf con * como número numérico, por ejemplo: 123456.nxs y 123456.hdf. El NXS contiene los metadatos del escaneo, mientras que el HDF contiene todos los datos de la imagen de proyección (datos enlazados desde el NXS).
2. Utiliza la tubería de reconstrucción^{Savu 19} para generar cortes 2D a partir de imágenes de proyección.
3. Accede y visualiza las imágenes reconstruidas usando software de renderizado 3D, como AVIZO/ImageJ.
   NOTA: La finalización de las secciones 7 y 8 requiere acciones coordinadas tanto por parte de usuarios como de contactos locales, con subpasos individuales realizados por cada uno.

Results

La Figura 1 muestra el robot cambiador de muestras Yaskawa GP7 instalado en la línea de haz de imagen Diamond I13-2. La Figura 1A muestra el robot (1) y el agarre de flexión diseñado internamente (2). Esta pinza puede contener una muestra con un diámetro de ≤ 8 mm. La Figura 1B muestra el robot (1) y el sistema de óptica/cámara de rayos X (4) y (6) utilizados para obtener datos de tomografía. El robot pinza la muestra de la bandeja de muestras (3), que puede contener 7 uni-pucks con 16 muestras en cada uno, como se muestra en la Figura 1C. Las muestras se montan sobre la varilla de aluminio (5), y la adquisición de datos de la tomografía se realiza con el sistema detector (6). Los detalles de (5) y (6) se proporcionan en el último párrafo de la sección introductoria. La línea roja rota en la Figura 1B indica la dirección del haz de rayos X.

Los detalles del esquema de montaje de la muestra y el diseño de la pinza de flexión se ilustran en la Figura 2. La Figura 2A muestra una muestra cilíndrica de plástico, fabricada mediante impresión 3D, pegada a la base de la muestra. El límite de la muestra representa el envolvente de la altura máxima de la muestra y el diámetro. Las flechas rojas indican la posición donde la pinza de flexión sujeta la base de la muestra para moverla de la bandeja de muestras a la etapa de tomografía y viceversa. Un diseño 3D del agarrador de flexión se muestra en la Figura 2B. Los dedos del agarre son accionados por un tubo de transmisión controlado neumáticamente (Figura 1B, ítem 2). El espacio central en la pinza tiene un diámetro de 8,9 mm, como se muestra en la Figura 2C, lo que permite un tamaño máximo de muestra de 8 mm con un margen de ~1 mm. La Figura 2D muestra la imagen de la parte superior de la etapa tomográfica. Una varilla de aluminio se monta sobre las dos etapas ortogonales y un disco magnético, que tiene un diámetro exacto tal que el hueco en la parte inferior de la base de la muestra encaja. Dado que este disco es magnético, mantiene la base montada firmemente en su lugar durante las mediciones tomográficas.

Para este experimento representativo, se han seleccionado 64 muestras de insectos proporcionadas por el Museo de Historia Natural (NHM) de Londres. Los ejemplares se seleccionaron para representar una variedad de fenotipos de artrópodos ajustándose a las limitaciones de tamaño del agarrador. Como los artrópodos, especialmente los insectos, representan la gran mayoría de la diversidad de especies conocidas, con más de un millón de especies nombradas, resulta especialmente difícil muestrearlos para estudios comparativos de fenotipos. Por tanto, la muestra actual demuestra el potencial de este enfoque al muestrear tres clados de artrópodos a nivel de clase: Arachnida, Entognatha e Insecta, así como al muestrear de forma más fina dentro de insectos para captar variaciones en siete órdenes, incluyendo cuatro de los órdenes más ricos en especies que existen hoy en día. Los ejemplares se fijaban a una cartulina con adhesivo. Las tarjetas se montaban entonces en los pines de muestra. Se evita montar muestras (insectos) directamente sobre los pasadores de muestra, ya que una estructura altamente absorbente en la viga con muestras de baja absorción creará artefactos de rayas durante las reconstrucciones, además de la dificultad para montarlas de forma segura en los pasadores de muestra. La Tabla 1 muestra la plantilla samples.csv archivo que el usuario completará con los parámetros requeridos para la tomografía (columnas A, B, C, E, F, G, H, K). La descripción de cada una de las columnas se proporciona en la tabla. Las columnas D, I, J y L en el input_file se rellenan tras alinear y optimizar los parámetros de la tomografía en la línea de haz. Las 64 muestras se midieron primero con un objetivo de 1,25x (FOV de 6,7 mm x 5,6 mm) a una distancia de propagación optimizada de rayos X (de la muestra al detector), y más tarde las mismas muestras se midieron con un objetivo 4x usando sus propios parámetros optimizados. Una vez cargadas las muestras en la bandeja y asegurada la caja experimental, el escaneo se inicia con GDA.

El alineamiento automático de la muestra se realizaba mediante un script escrito en Python (Ubicación del archivo en GitHub: https://gist.github.com/ndg63276/9b3c5cfe7db26b14930dff3ef889e2bc). Al principio, la alineación de la muestra se establece usando una base de muestra y una combinación de pasadores de muestra sin la muestra. La Figura 3 muestra el pin de la muestra, visto por la cámara del telescopio lateral (cámara situada a 90° respecto al haz de rayos X - Figura 1B, ítem 4), que se utiliza como muestra estándar de alineación. La imagen de la cámara del telescopio está binarizada para que la muestra pueda ser detectada desde el fondo. Los bordes de la muestra se determinan y marcan como un límite blanco, como se muestra en la Figura 3. La posición de coordenada de referencia de la muestra es la parte superior del pasador marcado como un círculo blanco en el recuadro de la Figura 3A. Al observar la imagen de rayos X, el ROI de la muestra se posiciona en el COR, y la posición requerida de coordenadas del objetivo, marcada como una flecha azul cruzada con doble cabeza y un punto rojo (Figura 3B), se determina en la cámara lateral. Este ajuste de posición objetivo permite colocar la muestra no solo sobre el COR, sino también unos pocos mm por encima/baja o un poco descentrada, si es necesario. Una vez que la muestra ha sido cargada en la etapa de tomografía, se ejecuta la función automática de centrado. El script primero mueve la muestra a la posición objetivo (Figura 3B) y luego pasa a 0°. A continuación, mueve la muestra a 90° (Figura 3C) y determina cuánta muestra debe moverse para situar la muestra en el centro de rotación (COR). Esto suele tardar entre 15 y 20 segundos. La muestra está ahora en el COR (Figura 2D), y el COR ya ha sido alineado con el centro de la cámara. El sistema ya está listo para la adquisición de tomografía.

En este estudio de insectos NHM, se realizaron 128 tomografías sin intervención humana. La medición duró un total de 17 horas. Cada escaneo duraba unos 8 minutos. Un experimento así sin el uso del robot habría tardado entre 20 y 25 minutos por tomografía. Esto implica que las tomografías con robots son 3-4 veces más rápidas que las escaneadas manuales en el caso actual. La Tabla 2 muestra un archivo de registro típico generado al final de un escaneo por lotes robotizado, incluyendo los parámetros necesarios para vincular cada número de escaneo con su muestra correspondiente. Detalles adicionales se proporcionan en la leyenda de la Tabla 2 .

La Figura 4 muestra imágenes de proyección normalizadas de una de las muestras, un insecto (Clase – Insecta, orden – Coleópteros), capturado durante el experimento de tomografía mencionado anteriormente con ampliación 1,25x y 4x. La fila superior, la Figura 4A-C, muestra una muestra con imágenes de 1,25x, y luego la misma muestra se ha imaginado con 4x, es decir, la Figura 4D-F. La Figura 4 de A–F muestra las imágenes de proyección adquiridas en 0°, 90° y 180°. El rectángulo amarillo muestra el campo de visión de las imágenes de proyección ampliadas que se adquieren con un objetivo 4x. Es importante señalar que, una vez cargadas las muestras en la bandeja mostrada en la Figura 1C, todos los procesos continuaron sin intervención humana. Ten en cuenta que estas dos exploraciones se realizaron con una diferencia de ~8,5 horas. Esto indica la estabilidad y la reproducibilidad del sistema.

La Figura 5 muestra cortes horizontales o transversales del conjunto de cortes de reconstrucción tomográfica de la muestra mencionada en la Figura 4. Tanto las rebanadas 1,25x (Figura 5A) como 4x (Figura 5B) se representan sin recortar las imágenes y tienen 2510 x 2510 píxeles. Los cortes están bien centrados dentro del campo de visión, lo que muestra que es posible hacer zoom en una región con mayor aumento sin necesidad de intervención física.

Los resultados presentados aquí demuestran que implementar un sistema robótico para el intercambio de muestras en experimentos de microtomografía sincrotrónica ofrece varias ventajas significativas. Estos incluyen un mayor rendimiento, una mayor eficiencia operativa y la capacidad de realizar escaneos a múltiples aumentos (zoom) sin necesidad de intervención humana. Teniendo en cuenta el número de muestras que deben ser escaneadas, como en el estudio NHM presentado aquí, sería imposible obtener conclusiones estadísticamente robustas y consistentes mediante escaneo manual.

Figura 1: Imagen del robot y el montaje experimental de tomografía instalado en la línea de haz I13-2. (A) El robot (1) con una pinza de flexión diseñada internamente (2). (B) La bandeja de carga de muestras (3) y la etapa de tomografía (5). La cámara óptica (cámara de telescopio), indicada como (4), se utiliza para alinear las muestras con el COR. El sistema detector (6) utilizado para la medición contiene múltiples objetivos motorizados para cambiar automáticamente el campo de visión, y un detector pco.edge 5.5. La flecha discontinua roja representa la dirección del haz de rayos X. (C) Imagen de la bandeja de carga de muestras con 7 discos, y cada disco puede contener hasta 16 muestras montadas sobre una combinación de base y pasadores de muestra. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Detalles del esquema de montaje de la muestra y el diseño de la pinza de flexión. (A) Imagen de una muestra de plástico ficticio impresa en 3D montada sobre una base de muestra, que representa la envolvente máxima que puede manejar la pinza de flexión. Las flechas rojas indican la posición donde la pinza sostiene la base de la muestra. (B) Diseño 3D del agarre de flexión. Los dedos del agarrador se accionan para sujetar o soltar la base de la muestra. (C) Dibujo de sección vertical de la garra con dimensiones. La abertura máxima en el centro es de 8,9 mm; por lo tanto, el tamaño máximo permitido de muestra es ≤ 8 mm. (D) Imagen de la parte superior de la etapa de tomografía. Una varilla de aluminio (indicada por la flecha azul) está montada en la parte superior de las dos etapas ortogonales. Un disco magnético se fija en la parte superior de la varilla sobre el cual la base de la muestra (junto con la muestra) se posiciona por el agarrador. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Instantáneas del gráfico de vídeo del procedimiento de alineación COR usando la cámara del telescopio lateral. (A) Imagen del pasador de alineación justo antes de que comience la rutina de alineación. La posición objetivo es la cruz azul de doble cabeza con punto rojo central, que coincide con el COR de la etapa de rotación de la tomografía. El recuadro muestra la imagen ampliada de la parte superior del pasador que muestra el centro de muestra detectado, tanto en altura como en ancho. (B) Pasador alineado con la posición objetivo en 0°. (C) El perno giró a 90°, y está fuera de posición objetivo. (D) Clavo alineado con la posición objetivo a 90°. Ahora el pasador está alineado en ambas direcciones ortogonales; por lo tanto, la muestra girará en el centro de la cámara. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Imágenes de proyección normalizadas de un insecto recogido con un objetivo de 1,25x y un objetivo de 4x. El insecto pertenecía a la clase Insecta, orden Coleoptera. Esto representa dos de cada 128 tomografías. El insecto fue pegado a un papel y sujeto al pasador de muestra. Las imágenes de proyección con objetivo de 1,25x están en (A) 0°, (B) 90°, (C) 180° y con 4x en (D) 0°, (E) 90° y (F) 180°. El conjunto de tomografías 1,25x y 4x se recogió en una sola sesión sin intervención humana. Un conjunto de imágenes con 1,25x proporciona una vista completa de la muestra, y un conjunto de imágenes 4x muestra la capacidad de zoom. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5. Comparación de una rebanada tomográfica idéntica adquirida usando dos campos de visión diferentes. Un único corte reconstruido a partir de tomografía de las imágenes de proyección mostradas en la Figura 4 para aumentos de (A) 1,25x y (B) 4x. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 1: Archivo típico de samples.csv que proporciona el usuario que contiene parámetros de tomografía. Este archivo se lee mediante el script tomomatic Python que se utiliza para la adquisición de datos. Las columnas A (descripción de la muestra), B (ID del disco), C (ranura en el puck), E (paso de rotación de tomografía), F (número de FI), G (número de DI), H (aumento a utilizar) y K (prioridad de ranura) son rellenadas por el usuario. Las columnas D (tiempo de exposición), I (distancia de propagación de rayos X entre la muestra y la cámara), J (movimiento de la cámara a través del haz para colocar el COR en el centro de la cámara) y L (código de barras de la base de la muestra) se rellenan tras la alineación y la optimización preliminar. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Archivo de registro típico de salida guardado como Output_file.txt después de que se hayan escaneado todas las muestras. El archivo informa de todos los parámetros de entrada y, además, proporciona el código de barras de la muestra escaneada (columna M), la ruta hacia los metadatos escaneados y los archivos de imagen (columna N), y la posición del motor utilizado para recoger FI (columna O). Básicamente, este archivo de salida proporciona la información necesaria para la reconstrucción y el análisis de datos. Como no se proporcionó entrada en la columna A del archivo de entrada, esta columna se llena con el recuento actual del escaneo, junto con los números de puck y pin. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo suplementario 1: Pseudocódigo que describe el script utilizado para operar el robot como cambiador de muestras. El archivo describe la rutina para el montaje automático de la muestra, la lectura del código Data Matrix, la alineación automática de muestras y la ejecución de una tomografía. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 1: Captura de pantalla de la interfaz genérica de adquisición de datos. Esta interfaz permite ajustar parámetros básicos de la cámara, visualizar en tiempo real la muestra e iniciar adquisiciones de tomografía. Los escaneos pueden iniciarse usando el botón en pantalla (solo escaneo manual) o mediante la interfaz de línea de comandos, indicada por el rectángulo amarillo en la parte inferior central de la captura de pantalla. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Fotografía del Puck estándar SPINE (izquierda) y el Puck Cap (derecha). Las posiciones de los pasadores, mostradas en rojo, sobre las que se montan las bases de las muestras, se numeran comenzando desde la posición opuesta a la muesca en el poste central de sujeción. El número 7267 (marcado en blanco) es el número de identificación del disco. La tapa del disco puede montarse en el disco para proteger las muestras durante el transporte o almacenamiento. Por favor, asegúrate de que los tamaños de muestra sean compatibles antes de intentar montar la tapa. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

La preparación y alineación de la muestra son dos pasos críticos para que el robot cambiador automático de muestras funcione correctamente y^{eficazmente 11}. El tamaño de la muestra y los requisitos de montaje se indican en la Sección 2 (Protocolo). Básicamente, el diámetro de la muestra debe ser de 8 mm o menos y debe estar bien centrado en la base de la^{muestra 12}. Esta restricción se establece mediante las dimensiones de las pinzas. Además, todas las muestras en una sola medición deben estar a la misma altura para que la posición de las muestras en el centro de rotación sea consistente en todas las muestras. Si el robot ha sido alineado para un experimento, entonces realizar otro experimento con el robot cambiador de muestras es completamente automático, excepto para establecer la región de interés de la muestra. Esto se explica en la sección de resultados representativos, Figura 3. Además, es importante señalar que esto forma parte del proceso de alineación realizado por el personal de la línea de haz (contacto local). Una vez establecido, todas las mediciones de muestra se realizan sin intervención humana. Desde la perspectiva del usuario, las mediciones son completamente automáticas. Hasta la fecha, solo se utilizan bases de muestra y pasadores de muestra de Molecular Dimensions Ltd; sin embargo, existen otros proveedores, como MiTeGen y Hampton Research, que producen las bases de muestras y pines de muestra estilo SPINE.

Actualmente se están desarrollando y probando pinzas de muestra más grandes, diseñadas para contener muestras de hasta 12 mm de diámetro. Esto permitirá al robot manejar muestras más grandes, como las que se colocan dentro de tubos de microcentrífuga y se montan sobre una base de muestra. Un diseño mejorado de pinzas podría implicar un mecanismo que se acerque a la muestra desde un lado, eliminando así las restricciones actuales sobre el tamaño de la muestra. Además, la actualización de la línea de haz aumentará el rendimiento en un orden de magnitud, permitiendo el escaneo de más de 3.000 muestras al día. Esto, a su vez, permitirá la recopilación de conjuntos de datos estadísticamente significativos que comprenden aproximadamente 30.000 muestras en un plazo de 10 días previos al tiempo de haz. En un futuro próximo, implementaremos una nueva línea de reconstrucción por tomografía, llamada HTTomo.

Cabe señalar que parámetros como la distancia de propagación del haz (distancia de la muestra al detector), el tiempo de exposición, el número de proyecciones, etc., deben optimizarse de antemano, como en cualquier otro experimento de tomografía de rayos X sincrotrón. Otra limitación es que las etapas implicadas en el experimento, como la manipulación de muestras en 6 ejes, las etapas de tomografía y las etapas de manipulación con cámara, debían estar en una posición definida para la carga y descarga de la muestra. Esto implica que las etapas deben moverse de un lado a otro cuando se realiza la carga y descarga de la muestra.

En conclusión, la tomografía de alto rendimiento puede realizarse con la ayuda del robot de cambio de muestras, haciendo el proceso al menos 4-10 veces más rápido y reduciendo o eliminando el tiempo muerto en comparación con la operación manual. La automatización experimental con robots también nos permite desplegar personal de forma más eficiente, ya que se requiere menos personas para realizar las mediciones. Medir conjuntos de datos estadísticamente significativos es importante en muchos campos científicos donde se requiere un volumen de datos fiable y suficiente para abordar el caso científico. Utilizar un robot puede ayudar mucho en estas tareas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etapa de rotación de rodamiento de aire	Aerotech, Inc.	https://www.aerotech.com/wp-content/ uploads/2021/01/abrt-data-sheet.pdf	Etapa de rotación de tomografía
AVIZO	ThermoFisher scientific		Software comercial de visualización y análisis de datos
Cryocap -MiTeGen	MiTeGen LLC	https://www.mitegen.com/product/ reusable-goniometer-base-styles/	Proveedor alternativo de CryoCap
CryoCap-Hampton research	Hampton research	https://hamptonresearch.com/ product-CrystalCap-SPINE-HT-445.html	Proveedor alternativo de CryoCap
Cryocaps (MD7-401) y Cryopins (MD7-410)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions.com/ products/magnetic-cryovials-and-cryocaps	Usados para el montaje de muestras
Óptica del detector	Olympus/Evident Scientific	https://evidentscientific.com/en/objective-finder? creative=651972731238&keyword =olympus+objectives&matchtype= e&network=g&device=c&campaign id=19865307548&adgroupid=144 087466781&gad_source=1&gad_ campaignid=19865307548&gbraid =0AAAAADMIOOmWDa2WC5VP2 Ngxlqao8dyWe&gclid=Cj0KCQiAhtv MBhDBARIsAL26pjFYUqjLVZ1Miz p2W7eGzD2SEPNTjxiA87Dry6un 1Fx6GplHQjuBR94aAs1xEALw_wcB	Objetivo y foto-ocular
GDA	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment -at-Diamond/IT-User-Guide/Software/Data-Acq/GDA.html	Software genérico de adquisición de datos
Hexápodo	PI miCos GmbH	https://www.physikinstrumente.co.uk/en/pro ducts/6-axis-hexapods-parallel-positioners	Etapa de 6 ejes para alineación de tomografía y manipulación de muestras
ImageJ	Desarrollado en los Institutos Nacionales de Salud, Universidad de Wisconsin	https://imagej.net/ij/	Software de procesamiento y visualización de imágenes de código abierto
Cámara sCMOS pco.edge 5.5	PCO (PCO AG / Excelitas Technologies)	https://www.excelitas.com/product-category/ pcoedge-cooled-scmos-cameras	Cámara de rayos X utilizada para la imagen por tomografía
SAVU	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Home.html ;jsessionid=8977FA8A10694BFA2AA DFD5D0D23B320	Pipeline de reconstrucción de tomografía
Cintiladores	CRYTUR, spol. S r.o	https://www.crytur.com/materials/luag-ce/	Óptica de centelleo
Universal V1-puck (Uni-puck)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions. com/products/uni-pucks-and-accessories	Las muestras se montan en Uni-puck para que el robot las recoja