Artículo de método

Mutagénesis semialeatoria inducible por luz azul en ADN exógeno específico en la cepa BL21 de Escherichia coli

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DOI:

10.3791/68283

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20 de junio de 2025

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1Central Laboratory, Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, 2Department of Emergency Medicine, Mount Sinai Hospital, 3NNHS, 2024 International Genetically Engineered Machine Team, Luoyang Central Hospital, 4USC Alfred E. Mann School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Southern California

En este artículo

Resumen

El protocolo descrito describe métodos simplificados para reconocer cualquier ADN exógeno mientras se generan mutaciones solo en esos ADN exógenos en Escherichia coli.

Resumen

Las tecnologías de mutagénesis se han utilizado ampliamente en la reproducción de variaciones, la evolución dirigida y la ingeniería de proteínas. Sin embargo, la mayoría de los métodos solo pueden inducir mutaciones genómicas aleatorias del ADN que son incontrolables, lo que provoca deformidades o incluso efectos letales. Aquí, al aprovechar la fusión de tres sistemas: editor de bases de citosina (CBE), elementos p-Mag/n-Mag inducibles por luz azul y ARN polimerasa T7 dividida, este método descrito incorpora un sistema de mutagénesis semialeatorio controlable por luz azul, específico de la región del ADN.

Este sistema puede mutar la citosina a timina en el ADN, comenzando desde el promotor T7 y terminando en el terminador T7. Cualquier gen exógeno aguas abajo del promotor T7 puede estar potencialmente mutado. Estas herramientas también se diseñaron en dos partes para que el sistema fuera controlable por luz azul. La primera parte se creó mediante la fusión de CBE con n-Mag y el gen de la ARN polimerasa N-terminal-T7. La segunda parte consistió en la fusión de p-Mag con la ARN polimerasa C-terminal-T7. Bajo luz azul, estas dos partes se ensamblaron para funcionar como un generador de mutaciones en el ADN entre el promotor T7 y el terminador T7. Sin luz azul, p-Mag se separa de n-Mag, liberando al CBE de la edición del ADN.

El objetivo de este protocolo es generar mutaciones aleatorias específicas de la región en Escherichia coli con control de luz azul y validar aún más los plásmidos mutados. El sistema se puede adaptar a un sistema de evolución in vivo en el que se puede seleccionar la función del gen de interés y se pueden recopilar las mutaciones deseadas para su posterior estudio.

Introducción

La mutación aleatoria y la selección natural son las fuerzas clave que impulsan la evolución, que ha generado una gran variación genética entre las especies. El proceso evolutivo se ha utilizado como una poderosa herramienta para diseñar proteínas con funciones optimizadas o novedosas1. Se ha estimado que las tasas de mutación natural de la replicación del ADN son de aproximadamente una de cada 109 bases por división celular en múltiples procariotas y eucariotas2. Las bajas tasas de mutación natural hacen que sea poco práctico generar una gran diversidad genética en los laboratorios. Los estudios se han centrado en el desarrollo de métodos que aumentan las tasas de mutación para cubrir tantos sitios como sea posible en un gen determinado dentro de un período de tiempo razonable.

Se han desarrollado múltiples sistemas para lograr tasas de mutación más altas en estudios de evolución de laboratorio 3,4,5,6,7,8,9,10. Los sistemas de evolución in vitro aprovechan la PCR propensa a errores, la mutagénesis de saturación dirigida al sitio o el diseño de bibliotecas computacionales para introducir mutaciones en genes de interés1. Las bibliotecas de ADN se transforman en células huésped donde se examinan o seleccionan los productos proteicos. Las etapas de mutagénesis y selección en la evolución in vitro no están acopladas, lo que limita la eficiencia y la escala de las poblaciones que se pueden generar11. Los sistemas de evolución in vivo han superado las limitaciones introduciendo sistemas de mutación en las células y acoplando las etapas de mutagénesis y selección para permitir una evolución continua. Los métodos anteriores de mutagénesis in vivo empleaban mutágenos químicos 3,4 y cepas mutadoras 5,6. Sin embargo, estos métodos adolecen de bajas tasas de mutación, falta de control y un espectro mutacional estrecho o desigual12. Estudios recientes han desarrollado nuevos y mejorados sistemas de evolución in vivo, representados por OrthoRep, un sistema de replicación de ADN propenso a errores ortogonales 7,8; MutaT7, una fusión de la citidina desaminasa a la ARN polimerasaT7 9; y EvolvR, una fusión de la nickasa Cas9 a la ADN polimerasa10 propensa a errores. Estos métodos tienen diferentes celdas host, contexto de destino y facilidad de implementación.

La ARN polimerasa T7 (T7 RNAP), un componente clave del sistema MutaT7, ha sido ampliamente estudiada y diseñada en el campo de la biología sintética. Los fragmentos de T7 RNAP se han coexpresado a diferentes niveles en diferentes puntos de tiempo para construir un asignador de recursos13. Se ha construido un RNAP T7 dividido con fragmentos C-terminal de diferente especificidad de promotor para crear la puerta lógica AND14. La capacidad de los fragmentos de ARN T7 para ensamblarse y reconstituir una polimerasa funcional ha llevado al desarrollo de biosensores activados por luz y moléculas pequeñas donde la dimerización de los socios de interacción fusionados con cada uno de los terminales N y C de ARN T7 genera una salida transcripcional15. El RNAP T7 dividido también se ha fusionado con los dominios n-Mag y p-Mag para construir un control de la expresión génica inducible por luz en Escherichiacoli 16. Tras la activación de la luz azul, los dominios del imán se dimerizan, acercando espacialmente dos dominios del RNAP T7 dividido para llevar a cabo la función de polimerasa. Este sistema permite un control espacio-temporal preciso de la expresión génica con baja expresión basal y un amplio rango dinámico.

Este artículo presenta un protocolo para construir un sistema de mutagénesis semialeatorio in vivo controlable por luz azul (Figura 1). Está construido sobre rAPOBEC1 desaminasa fusionada con n-Mag-N-T7 RNAP. La coexpresión de p-Mag-C-T7 RNAP a partir del mismo plásmido permite el control con luz azul de la polimerasa y las actividades de edición de bases. El sistema combina la capacidad de edición de la base de rAPOBEC1 con el RNAP T7 dividido controlado por luz. Se ha validado en E. coli utilizando la proteína verde fluorescente (GFP) como gen diana, donde su intensidad se selecciona mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). En comparación con el sistema MutaT7 original, nuestro sistema controlado por luz azul introduce mutaciones semialeatorias en el gen objetivo mediante la modulación del intervalo de luz. En lugar de convertir toda la citosina en bases de uracilo en el gen objetivo, genera un perfil de mutación más grande mediante la edición de un subconjunto de los nucleótidos a través del control de luz. El sistema se puede adaptar fácilmente a un sistema de evolución in vivo donde la GFP puede ser reemplazada por otros genes de interés y la función se puede seleccionar por la aptitud celular o la supervivencia.

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Protocolo

El siguiente protocolo describe cómo realizar el diseño de mutagénesis de ADN exógeno utilizando el sistema de mutagénesis de polimerasa CBE-Mag-T7 (Paso 1). Una vez que se construye el plásmido de ADN exógeno, se describen los pasos para la transformación de los dos plásmidos para expresar la mutagénesis de la polimerasa CBE-Mag-T7 en la cepa BL21 de E. coli mediante la adición de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y seguido de la irradiación con luz azul para iniciar la mutagénesis (Pasos 2-9.2). Los pasos de control de calidad para evaluar cuántas mutaciones se generaron en GFP o en ADN exógeno se realizaron mediante secuenciación de Sanger (pasos 9.3-11.2).

1. Diseñar ADN exógeno y construir el sistema de mutagénesis de la polimerasa CBE-Mag-T7

  1. Encuentre la secuenciación del ADN exógeno o del ADNc utilizando herramientas en línea (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene o https://www.uniprot.org/).
    NOTA: Aquí, utilizamos la secuencia GFP como ADN exógeno para la mutagénesis de citosina.
  2. Reemplace el ADN gfp con el ADN de interés utilizando un kit de clonación adecuado.
    NOTA: Usamos NheI para eliminar el ADN gfp en el plásmido original en el kit de ensamblaje de colonias de ADN. Una alternativa es trabajar con empresas para la síntesis de ADN. Consulte el Archivo Suplementario 1 para la secuencia de plásmidos.
  3. Sintetizar todos los genes junto con el sistema de mutagénesis de la polimerasa CBE-Mag-T7 e incorporarlos a la columna vertebral de pET-11a con resistencia a la ampicilina.
    NOTA: Trabajamos con una empresa de síntesis de ADN para construir este plásmido y obtuvimos bacterias de reserva de glicerol que contienen nuestro plásmido objetivo.

2. Activación de la cepa bacteriana

  1. Pipetear 10 μL de bacterias de reserva de glicerol en el borde de una placa de agar LB que contenga 100 μg/mL de ampicilina. Pase las bacterias de este punto a través del plato con un lazo estéril.
  2. Incubar la placa boca abajo a 37 °C durante la noche en una incubadora bacteriana.

3. Amplificación de plásmidos

  1. Elija una sola colonia de la placa e inocule en un tubo cónico de 50 mL con 15 mL de medio LB que contenga 100 μg/mL de ampicilina.
  2. Colocar el cultivo en una incubadora agitadora a 37 °C, 180 rpm durante 14-16 h.

4. Extracción de plásmidos

  1. Tome de 5 a 15 ml del cultivo bacteriano durante la noche y transfiéralo a un tubo de centrífuga. Centrífuga a 18.894 × g durante 1 min.
  2. Recoja la bolita bacteriana y retire con cuidado todo el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet bacteriano en 500 μL de tampón de resuspensión mediante vórtice o pipeteo.
  3. Agregue 500 μL de tampón de lisis al tubo, mezcle suavemente invirtiendo el tubo 8-10x y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos para lisar las células.
    NOTA: Confirme la lisis completa asegurándose de que no quede material floculante blanco visible.
  4. Añada 200 μL de tampón de equilibrio a la columna de centrifugación colocada en un tubo de recolección. Centrifugar a 18.894 × g durante 2 min y desechar el flujo. Vuelva a colocar la columna en el tubo de recolección.
  5. Añadir 500 μL de tampón de neutralización al lisado bacteriano, mezclar suavemente invirtiendo el tubo 8-10x hasta que aparezca un precipitado blanco, y dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 min.
  6. Centrifugar a 18.894 × g durante 5 minutos y transferir el sobrenadante a una columna de filtro. Centrifugar a 18.894 × g durante 1 min para filtrar la solución.
  7. Agregue 0,3 veces el volumen de isopropanol a la solución filtrada, mezcle invirtiendo. Transfiera la mezcla a la columna de centrifugación equilibrada.
  8. Centrifugar a 18.894 × g durante 1 min, desechar el flujo y volver a colocar la columna en el tubo de recolección.
  9. Lave la columna con 750 μL de tampón de lavado, centrifugue a 18.894 × g durante 1 min y deseche el flujo.
  10. Vuelva a centrifugar la columna a 18.894 × g durante 1 minuto para eliminar el tampón de lavado residual.
  11. Coloque la columna de centrifugación en un nuevo tubo de centrífuga. Añadir 100-200 μL de tampón de elución al centro de la membrana de la columna. Déjalo reposar a temperatura ambiente durante 2-5 minutos y centrifuga a 18.894 × g durante 2 minutos. Almacene el ADN plasmídico a -20 °C.

5. Transformación de plásmidos (E. coli BL21, células químicamente competentes)

  1. Tome 50 μL de células BL21 químicamente competentes descongeladas en hielo. Agregue 2 μL de ADN plasmídico del paso 4.11 y mezcle suavemente. Incubar en hielo durante 30 min.
  2. Choque térmico a 42 °C durante 45 s, luego vuelva a transferir el tubo inmediatamente a hielo durante 2 minutos.
  3. Agregue 500 μL de medio LB estéril a cada tubo. Incubar a 37 °C, 180 rpm durante 1 h para permitir la recuperación.
  4. Centrifugar a 1.000 × g durante 5 min, desechar el exceso de sobrenadante, dejando aproximadamente 100 μL. Vuelva a suspender las células y la placa en agar LB que contenga 100 μg/mL de ampicilina. Incubar boca abajo a 37 °C durante la noche.

6. Expresión del generador de mutaciones de la polimerasa CBE-Mag-T7 (forma inactiva)

  1. Siga los pasos 5.1-5.4. Antes de esparcir las células, aplique uniformemente 1 mM de IPTG a la superficie del agar LB con ampicilina. Utilice agua desionizada como control para comparar con los grupos tratados con IPTG.
  2. Después de que se hayan cultivado todas las colonias, elija de 10 a 20 colonias para cultivar en 5 mL de medio LB que contenga 1 mM de IPTG en tubos de vidrio de fondo redondo de 100 mL con tapón de rosca fenólico y revestimiento de goma a 16 °C, 180 rpm durante 8 h.
    NOTA: Todas las colonias pueden almacenarse a 4 °C para un almacenamiento a corto plazo antes de continuar con el paso 7.

7. Activar el generador de mutaciones de la polimerasa CBE-Mag-T7

  1. Recoja las bacterias en tubos de vidrio de fondo redondo de 100 ml con tapón de rosca fenólico y revestimiento de goma y centrifuga a 18.894 × g durante 2 minutos.
  2. Cambie el medio a medio LB sin ningún IPTG.
    NOTA: Este paso es importante para asegurarse de que el generador de mutaciones de la polimerasa CBE-Mag-T7 no pueda editarse a sí mismo. Hemos diseñado el sistema lacI/O para proteger los grupos de genes de la polimerasa CBE-Mag-T7.
  3. Irradie la placa con un irradiador de luz azul (470 nm, 4 mW/cm2) mientras cultiva a 37 °C durante el tiempo predeterminado. Realice la secuenciación de Sanger para verificar las mutaciones y comprobar si una exposición más prolongada aumenta la frecuencia de las mutaciones.
    NOTA: Aquí, establecemos la exposición a la luz azul para 0, 8, 16 y 24 h.

8. Selección de mutaciones para el aumento de la función de las proteínas y la mutagénesis continuada

NOTA: Aquí, utilizamos el gen gfp como ADN exógeno para la mutagénesis y estamos buscando mutaciones que puedan mejorar la intensidad fluorescente de la proteína GFP.

  1. Elija las colonias, etiquete la posición en un plato e inocule las colonias recolectadas en 100 μL de ddH2O.
  2. Transfiera los 100 μL de suspensión bacteriana a una placa de 96 pocillos y lea la intensidad de GFP a Ex/Em = 488/510 nm.
  3. Repita los pasos 6.3 a 9.2 hasta que se puedan identificar algunas colonias obvias.

9. Detener la mutagénesis y verificar las mutaciones

  1. Después de realizar varias horas de irradiación con luz azul, traslade todas las bacterias a un lugar oscuro a 4 °C durante otros 15 minutos.
  2. Siga los mismos pasos de extracción de plásmidos que se describen en el paso 4.
  3. Diseñar los cebadores directos e inversos para la secuenciación de Sanger.
    NOTA: Aquí, usamos ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGTGT como cebador directo y TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG como cebador inverso para la secuenciación de Sanger.

10. Análisis de datos y cálculo de la frecuencia de mutación

  1. Visualice la mutación abriendo el archivo .ab1 y compruebe los picos manualmente.
  2. Analice la frecuencia de mutaciones mediante el uso de herramientas en línea (p. ej., la herramienta Mutation Surveyor).
  3. Cargue el archivo de datos de Sanger en la herramienta en línea e inicie el análisis de la tasa de mutación.

11. Preparación del caldo de glicerol bacteriano

  1. Inocular una sola colonia en un tubo que contenga 5 mL de medio LB con 100 μg/mL de ampicilina. Incubar a 37 °C, 180 rpm durante 12-16 h.
  2. Mezcle el cultivo bacteriano con glicerol al 50% en una proporción de 1:1. Alícuota en tubos de centrífuga de 1,5 mL. Conservar a -80 °C.

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Resultados

Los métodos descritos en este protocolo son para la creación de mutaciones en el ADN exógeno utilizando un generador de mutaciones de ARN polimerasa CBE-Mag-T7 dividido. Los genes para construir el sistema de mutación de la ARN polimerasa CBE-Mag-T7 y el gen objetivo para la mutagénesis están incorporados en la columna vertebral del plásmido pET-11a. La transformación exitosa y la irradiación con luz azul se realizaron sin ningún daño al ADN genómico bacteriano, lo que se muestra a través de números de colonias normales ...

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Discusión

La herramienta de edición de bases guiada por polimerasa fue creada por primera vez por Cravens et al. en 2021, utilizando una estrategia de fusión de proteínas17. Las mutaciones en cuatro nucleótidos de ADN se incorporaron con éxito a tasas superiores a 10-4 mutaciones por pb. Sin embargo, dado que las mutaciones se introdujeron continuamente entre el promotor T7 y el terminador sin control adicional por parte de los investigadores18<...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de centrífuga cónicos de 50 mlHalcónCLS352070
AmpicilinaProductos químicos Thermo ScientificJ60977.14
Irradiador de luz azulLaboratorios de ThorlabsLIU470A
Kit de clonación de ensamblaje de ADN NEBE5520S
Síntesis de ADN/PrmersGenómica BGI
Kit Midi de plásmidos EndoFree CWBIOCW2106STampón P1: tampón de respensión, Tampón P2: tampón de lisis, Tampón E3: tampón de equilibrio, Tampón PS: tampón de neutralización, Tampón PW: tampón de lavado, Tampón libre de endo EB: tampón de purificación de ADN, Endo-Remover de ARNasa A FM: tampón de eliminación de endotoxinas, Columnas de centrifugación DM con tubos de recogida
GlicerolFisher ChemicalG33-4
Agitador incubadoThermo ScientificSK2001CPKG
IPTG (isopropiltio-β-galactósido)Invitrogen15529019
Lector de microplacasThermo ScientificVarioskan LUX
Microscopio LeicaDMI 4000B
Multiskan FCProductos químicos Thermo Scientific
One Shot BL21 (DE3) E. coli químicamente competenteInvitrogenC600003
Kit de purificación de plásmidos midi de baja endotoxina PureLink FastInvitrogenReferencia A36227
Pyrex  tubos centrífugos de fondo redondo de alta resistencia, con tapón de rosca fenólico y revestimiento de gomaCorning  8422CLS8422100

Referencias

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