Artículo de método

Modelo murino de enfermedad hepática esteatótica asociada a disfunción metabólica con fibrosis

DOI:

10.3791/68294

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18 de julio de 2025

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1Brooklyn College, City University of New York

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Modelo murino de enfermedad hepática esteatótica asociada a disfunción metabólica (MASLD) con disfunción metabólica, cambios en la expresión génica hepática y alteraciones histopatológicas hepáticas que se asemejan a la MASLD humana, incluida la fibrosis que progresa a la fase 3 de fibrosis avanzada. Este modelo se puede utilizar en estudios de fisiopatología de MASLD y en estudios preclínicos de nuevas terapias.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fibrosis hepática es el predictor más importante de resultados adversos en la enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica (MASLD). En los estudios preclínicos de MASLD, los ratones son el modelo de enfermedad más utilizado. Sin embargo, en esos modelos, la fibrosis hepática es difícil de inducir. Este protocolo describe un modelo de ratón de MASLD en el que ratones Ay hiperfágicos son alimentados con una dieta alta en grasas y fructosa, que se asemeja a la dieta promedio en los EE. UU. Los ratones desarrollan esteatosis hepática, lesiones, inflamación y fibrosis. La fibrosis progresa desde la fibrosis pericelular, en etapa 1, después de 16 semanas, hasta la fibrosis puente, en etapa 3, después de 12 meses. Estos ratones también desarrollan obesidad, hipertrigliceridemia, intolerancia a la glucosa e hiperinsulinemia. Este modelo de enfermedad replica la histopatología hepática, las alteraciones de la expresión génica hepática y la disfunción metabólica de la enfermedad humana. Este protocolo incluye dos métodos para cuantificar la fibrosis: la tinción histológica del colágeno por picro-sirius rojo, y la cuantificación del contenido hepático de hidroxiprolina. Estos métodos se pueden utilizar para el estudio de la fisiopatología de MASLD y para estudios preclínicos de posibles terapias.

Introducción

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La enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica (MASLD) es la enfermedad hepática más común, con una prevalencia del 31% al 40% en los EE. UU. y del 42% en todo el mundo 1,2,3,4. Los pacientes con MASLD pueden desarrollar esteatohepatitis asociada a la disfunción metabólica (MASH), anteriormente llamada esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), cirrosis y carcinoma hepatocelular 5,6. La MASLD aumenta el riesgo de carcinoma hepatocelular y, tras el reciente aumento de la prevalencia de la misma, se ha convertido en la enfermedad hepática más frecuente en los pacientes que desarrollan carcinoma hepatocelular 7,8. En la MASLD, la fibrosis es el principal predictor de progresión a cirrosis y de resultados clínicos adversos, incluyendo morbilidad hepática (descompensación hepática, insuficiencia hepática o cáncer hepático) y mortalidad relacionada con el hígado 6,9,10,11. En consecuencia, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, por sus siglas en inglés) fomenta el desarrollo de terapias centradas en MASH/NASH con fibrosis, así como el uso de modelos animales apropiados12.

En los estudios preclínicos de fármacos y en los estudios mecanicistas de MASLD, los modelos de ratón son los más utilizados13. Se han descrito miles de modelos murinos de MASLD, lo que sugiere una falta de consenso sobre un modelo óptimo 13,14. El establecimiento de modelos óptimos se enfrenta a varios desafíos. A pesar de que es relativamente fácil inducir obesidad y esteatosis en ratones alimentándolos con dietas altas en grasas, la fibrosis hepática es más difícil de inducir 13,14,15,16. En los modelos de MASLD impulsados por dietas obesogénicas, la fibrosis se desarrolla lentamente17 Aunque esta progresión lenta puede imitar mejor la enfermedad humana18, aumenta la duración y el costo de los estudios en animales. Las dietas con alto contenido de colesterol (p. ej., 2%) promueven el desarrollo de fibrosis; Sin embargo, también disminuyen la síntesis endógena de colesterol, lo que es lo contrario al aumento descrito en la enfermedad humana15,16. Algunos modelos de MASLD utilizan ratones mutantes o modificados genéticamente; Sin embargo, pueden tener advertencias: los ratones ob/ob desarrollan obesidad, esteatosis y resistencia a la insulina, pero carecen de leptina, que es un mediador de la fibrosis; Los ratones PTEN nulos desarrollan esteatosis pero no desarrollan resistencia a la insulina15,17. Por lo tanto, los modelos murinos de MASLD a menudo requieren estudios de larga duración, dietas con alto contenido de colesterol o manipulaciones genéticas para desarrollar fibrosis significativa14. Para abordar algunos de estos problemas, hemos desarrollado un modelo de ratón en el que los animales desarrollan MASLD con fibrosis que progresa desde la fibrosis pericelular/perisinusoidal (estadio 1) hasta la fibrosis puente (estadio 3)19.

El objetivo de este artículo es describir este modelo de MASLD con fibrosis hepática y dos métodos para cuantificar la fibrosis: la tinción histológica de colágeno mediante rojo picro-sirius y la cuantificación del contenido de hidroxiprolina hepática.

La justificación para el desarrollo de este modelo fue que los modelos animales más útiles son aquellos que mejor replican la enfermedad humana, tanto en los impulsores de la enfermedad como en las alteraciones en la histopatología y la expresión génica. Por lo tanto, utilizamos una dieta que se asemeja a la dieta promedio en los EE. UU., que incluye cantidades moderadamente altas de grasa y fructosa19,20. Alimentamos esta dieta con ratones portadores de la mutación amarilla de Agouti (A y), que han sido ampliamente utilizados como modelos de obesidad21. Estos ratones expresan de forma ubicua la proteína agutí, un antagonista de los receptores de melanocortina, incluyendo MC4R, causando hiperfagia y replicando el aumento de la ingesta de alimentos que es común en la obesidad humana 21,22,23. Este modelo recapitula las alteraciones que definen el MASH, incluyendo la esteatosis, la lesión hepatocelular, la inflamación, la fibrosis y la disfunción metabólica.

Las principales ventajas de este modelo son las características que lo hacen similar a la enfermedad humana. El modelo utiliza una dieta de tipo occidental, que ha sido diseñada para parecerse a la dieta típica de los Estados Unidos y ha demostrado ser la dieta más eficaz para replicar el fenotipo de la MASLD humana14,20. Los ratones desarrollan alteraciones histopatológicas hepáticas similares a las descritas en los hígados de humanos con MASH19,24. Los ratones desarrollan disfunción metabólica, que es un criterio esencial para el diagnóstico de MASLD5. Los hígados de ratones con MASH muestran cambios en la expresión génica que recapitulan los de los humanos con MASH/NASH19. Un estudio reciente comparó 39 modelos de ratón de MASLD por su similitud con la enfermedad humana. Se incluyeron ratones knock-out MC4R, que comparten el mismo mecanismo de hiperfagia y recibieron la misma dieta que el modelo que describimos14. Ese modelo ocupó el quinto lugar (de 39) por su similitud con el MASLD humano evaluado por fenotipo, histopatología hepática y transcriptómica14.

Las ventajas adicionales de este modelo son: los ratones Ay están disponibles comercialmente en el Laboratorio Jackson, y están disponibles en la cepa C57BL/6J, que se utiliza comúnmente en estudios metabólicos21,25; Los ratones mutantes son fácilmente identificables por el color de su pelaje; el modelo puede combinarse con modelos de ganancia o pérdida de función para estudiar el papel de genes específicos en el desarrollo de MASLD; y, por último, el modelo no utiliza deficiencias de nutrientes (deficiencia de colina o metionina), componentes alimentarios inusuales (ácido cólico, etionina), un contenido inusualmente alto de nutrientes específicos (grasas trans) o hepatotoxinas (tetracloruro de carbono), que no son causas comunes de MASLD y pueden no replicar la enfermedad humana 13,14,17.

Este método es apropiado para la investigación de los mecanismos que contribuyen al desarrollo y la progresión de la MASLD, así como para la evaluación de intervenciones para su tratamiento o prevención. Este modelo es particularmente útil porque los animales no solo desarrollan esteatohepatitis y disfunción metabólica, sino que también desarrollan fibrosis que progresa a la etapa 3. Es posible que el modelo no sea apropiado para el estudio de los mecanismos que afectan el comportamiento alimentario (por ejemplo, agonistas de GLP1R), ya que estos ratones tienen hiperfagia.

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Protocolo

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Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal de Brooklyn College; Número de protocolo IACUC 318.

1. Modelo murino de MASLD con fibrosis

  1. Cría ratones para producir descendencia Ay. Establecer parejas reproductoras con ratones Ay (B6. Cg-Ay/J). Registra la fecha de nacimiento de los cachorros.
  2. Asegúrese de que las camadas tengan un número similar de cachorros para promover una alimentación y un crecimiento adecuados y uniformes. Trate de tener de cinco a seis cachorros por camada, ya que es el tamaño promedio de la camada para los ratones C57BL / 6J. Los cachorros adicionales, preferentemente los del sexo que no son necesarios, pueden ser sacrificados o adoptados.
    NOTA: El uso de machos Ay y hembras de tipo salvaje (C57BL/6J Jax 0000664) puede mejorar la eficiencia de la cría, ya que los ratones hembra C57BL/6J de tipo salvaje son fáciles de obtener y pueden ser mejores reproductores que las hembras Ay.
  3. Configure jaulas para experimentos como se describe a continuación.
    1. Identifica a los ratones Ay por el color amarillo de su pelaje. Asigne una identificación única a cada ratón y etiquete o marque los ratones.
      NOTA: El alelo amarillo agutí (Ay) del gen agutí confiere un color de pelaje amarillo. El alelo es semidominante en los heterocigotos. La homocigosis causa letalidad embrionaria. Por lo tanto, los ratones con pelaje amarillo son heterocigotos para el gen Ay.
    2. Desteta a los ratones cuando tienen 21 días de edad. Agrupe a los ratones que se alojarán en la misma jaula durante el estudio. Alberga tres o cuatro ratones Ay por jaula, de acuerdo con el peso corporal esperado y las pautas institucionales.
    3. Alimente comida estándar y agua. Ratones domésticos a temperatura estándar (20-23 °C) y humedad relativa (40% a 60%) con un ciclo de luz de 12 h y 12 h de oscuridad.
  4. Alimente a los ratones Ay con una dieta alta en grasas y fructosa (dieta alta en grasas y fructosa, HFFD) a partir de las 8 semanas de edad, como se describe a continuación.
    1. Proporcionar a los ratones Ay la dieta occidental, que es alta en grasas y sacarosa (Adjusted calories Western Diet Inotiv TD.88137) ad libitum.
    2. Prepare una solución que contenga fructosa (23 g/L) y glucosa (19 g/L) en agua potable. Esterilizar la solución por filtración a través de un filtro de 0,2 μm y almacenarla en frascos estériles. Una vez abierta, mantenga la solución refrigerada.
    3. Proporcione a los ratones la solución que contiene fructosa y glucosa para beber, en botellas estériles. Reemplace la solución y los biberones al menos una vez por semana, verificando el crecimiento de microorganismos.
    4. Use ropa de cama de jaula sin valor nutricional (por ejemplo, astillas de madera).
  5. Alimente a los ratones de control con una dieta baja en grasas y fructosa como se describe a continuación.
    NOTA: El tipo de ratones de control a utilizar depende del diseño del estudio: Si se utilizan ratones Ay-HFFD para evaluar el efecto de los fármacos, los ratones de control pueden ser ratones Ay-HFFD tratados con un placebo. Si el modelo se utiliza para estudiar el efecto de una modificación genética en el desarrollo de fibrosis, se pueden utilizar ratones Ay-HFFD sin la modificación genética como controles. Si desea controles sin MASH, siga los pasos que se describen aquí.
    1. Use ratones de tipo salvaje que sean compañeros de camada de los ratones Ay. Se pueden identificar por el color de su pelaje negro.
    2. Alimente a los ratones con una dieta de control (Dieta de Control Baja en Grasa Inotiv TD.08485; conocida como Dieta Baja en Grasas y Fructosa, LFFD) a partir de la misma edad. Proporcione a los ratones agua potable regular.
  6. Controle el desarrollo de la obesidad pesando a los ratones semanalmente, colocando a los animales despiertos en un recipiente tarado en una balanza de laboratorio y registrando su peso.
  7. Asegúrese de que los ratones tengan suficiente comida y solución para beber en todo momento. Controle y registre el consumo de alimentos y soluciones bebibles para estimar la ingesta calórica, si lo desea.
  8. Recoja los pañuelos como se describe a continuación.
    1. Realizar la recolección de tejido después de 16 semanas con la dieta HFFD. Eutanasia del ratón por inhalación de dióxido de carbono (u otros métodos aprobados por la IACUC de la institución).
      NOTA: Después de 16 semanas, los ratones Ay alimentados con la dieta HFFD generalmente tienen fibrosis en etapa 1; Prolongar el tiempo conducirá a una mayor fibrosis, progresando a la etapa 3 después de 9 a 12 meses.
    2. Pesa el ratón y registra el peso19.
    3. Recoja sangre si es necesario. Para ello, extraiga sangre de la vena cava inferior con una jeringa de 1 mL y una aguja de 27G después de abrir el abdomen y antes de diseccionar el hígado (o utilice cualquier otro método aprobado por la IACUC).
    4. Diseccionar el hígado abriendo el abdomen con una incisión en la línea media, sosteniendo el hígado por el hilio con fórceps y cortando los ligamentos que unen el hígado al diafragma y al retroperitoneo con unas tijeras. Pesa el hígado y registra el peso.
    5. Enjuague el hígado en una solución salina helada tamponada con fosfato (PBS). Fotografíe el hígado e incluya una regla u otro objeto como referencia de tamaño en la imagen. Coloque el hígado en una placa de Petri que se coloca sobre hielo.
    6. Diseccionar muestras (aproximadamente 100 a 150 mg por muestra) de varios lóbulos, incluyendo el lóbulo mediano, el lóbulo izquierdo y el lóbulo derecho. Asegúrese de que las muestras no tengan un grosor superior a 4 mm para facilitar la fijación. Colóquelos en solución fijadora (formalina al 10% o formaldehído al 4%) durante 24 h y procéselos para el análisis histopatológico (ver más abajo).
    7. Diseccionar muestras adicionales de varios lóbulos. Colóquelos en tubos (1,5 o 2 mL), congélelos sumergiéndolos en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 °C. Estas muestras se utilizarán para medir el contenido de hidroxiprolina.
    8. Recoger muestras de otros órganos si se desea (tejido adiposo, músculo, etc.)

2. Tinción histoquímica de colágeno y cuantificación morfométrica

NOTA: Los pasos que requieren el uso de productos químicos peligrosos y/o volátiles deben realizarse en una campana extractora. Todos los portaobjetos deben procesarse en paralelo utilizando placas de tinción y soportes para portaobjetos.

  1. Prepare las secciones de hígado como se describe a continuación.
    1. Fije el tejido hepático manteniéndolo en formol (o formaldehído) durante 24 h a temperatura ambiente. Utilice un volumen de fijador 20 veces mayor que el volumen del tejido. A continuación, transfiera los tejidos a etanol al 70%. El protocolo se puede pausar en este punto.
      NOTA: Los tejidos pueden colocarse en casetes de histología que luego se colocan en un recipiente con fijador o, alternativamente, en recipientes o tubos individuales.
    2. Incrustar pañuelos en parafina. Por lo general, esto lo hace un centro o servicio central de histopatología.
    3. Obtenga secciones con un espesor de 0,5 μm montadas en portaobjetos (los portaobjetos no cargados son adecuados). Deje que las secciones se sequen exponiéndolas al aire a temperatura ambiente. Un centro o servicio central de histopatología suele hacer esto. El protocolo se puede pausar en este punto.
  2. Desparafinar y rehidratar las secciones como se describe a continuación.
    1. Desparafinar las secciones sumergiéndolas en dos cambios de solución desparafinante/aclarante (xileno o citrisolv), durante 5-15 min en cada una.
    2. Rehidrate sumergiendo sucesivamente los portaobjetos en etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 70% y agua, durante 5 minutos en cada uno.
  3. Tiñe las secciones con rojo picro-sirius como se describe a continuación.
    1. Sumergir las secciones en una solución de rojo Sirius (rojo directo 80) 1 g/L en ácido pícrico al 1,3% durante 1 h. No manche por mucho más tiempo, ya que el rojo directo puede manchar otras estructuras además del colágeno (por ejemplo, núcleos). Añada verde rápido (1 g/L) a la solución de tinción si se desea contraponer la tinción26. Alternativamente, tiñe los núcleos con hematoxilina27 de Weigert.
    2. Regrese la solución roja picro-sirius a un recipiente cerrado de vidrio oscuro o plástico para su almacenamiento. La solución se puede reutilizar varias veces (durante al menos 20 años27).
  4. Sumerja las muestras en etanol (100%) durante 5 minutos para deshidratarlas. Repita con un segundo cambio de etanol.
  5. Sumergir en solución transparente (xileno o citrisolv) hasta que se retiren individualmente para su montaje.
  6. Retire un portaobjetos a la vez de la solución limpiadora y elimine el exceso de líquido secando toallas de papel. Agregue medio de montaje (aproximadamente 50 a 100 μL). Cubra la sección con un cubreobjetos y presione suavemente el cubrecubreobjetos hacia abajo para eliminar las burbujas de aire. Deje secar al aire.
    NOTA: El protocolo se puede pausar en este punto.
  7. Observe las secciones con un microscopio óptico con iluminación de campo claro y objetivos de 4x a 20x: el colágeno aparece rojo sobre un fondo amarillo anaranjado claro. Visualice las áreas de interés con una cámara a color, de acuerdo con las instrucciones de la cámara.
  8. Realice imágenes con microscopía de luz polarizada como se describe a continuación.
    1. Activa y ajusta el polarizador y los filtros del analizador ortogonalmente para garantizar que el colágeno sea visible y que la señal de fondo sea mínima. El colágeno es visible como blanco, amarillo o naranja sobre un fondo oscuro. En secciones con poca o ninguna fibrosis, el colágeno en las paredes de los vasos sanguíneos será visible. Mantenga los ajustes, incluida la intensidad de la iluminación, iguales para todas las muestras que se van a comparar.
    2. Imagen utilizando una cámara monocromática o un modo monocromo en una cámara a color. Utilice un objetivo de aumento de 4x. Toma varias imágenes por sección. Evite las áreas cercanas al hilio si tienen vasos sanguíneos grandes. Utilice la misma configuración para todas las imágenes que se van a comparar.
  9. Realice la cuantificación morfométrica con Photoshop (alternativa a) como se describe a continuación.
    1. Cuantifica el área blanca de las imágenes, que corresponde al colágeno. En Photoshop, haga clic en Seleccionar > Gama de colores y, a continuación, seleccione Iluminaciones y ajuste los parámetros Difuminación y Gama para seleccionar los píxeles blancos, correspondientes al colágeno. A continuación, seleccione Ventana > Histograma > Vista expandida y registre el número de píxeles seleccionados, que se muestra junto al parámetro Píxeles. Utilice los mismos parámetros para todas las imágenes que se van a comparar.
    2. Cuantifique el área total de la imagen. En Photoshop, haga clic en Seleccionar > todo y, a continuación, registre el número total de píxeles como se hizo anteriormente.
    3. Calcule el porcentaje del área de la imagen correspondiente al colágeno dividiendo el número de píxeles blancos por el número de píxeles totales. Los valores generalmente se expresan como porcentajes de área.
  10. Realice la cuantificación morfométrica utilizando ImageJ (alternativa b) como se describe a continuación.
    1. Selecciona áreas blancas en las imágenes que correspondan al colágeno. Abra la herramienta Umbral haciendo clic en Imagen > Ajustar > Umbral (o presione Mayús + T). Establezca el rango de umbral para asegurarse de que solo las regiones teñidas de colágeno (áreas blancas) se resalten en rojo (por ejemplo, umbral mínimo 64; umbral máximo: 255) y haga clic en Aplicar. Esto binizará la imagen, convirtiendo la región de colágeno en negro y el fondo en blanco.
    2. Mida el área total de la imagen haciendo clic en Analizar > Establecer mediciones. Verifique el área y la etiqueta de visualización. Haga clic en Aceptar. Haga clic en Analizar > medir (o presione M en el teclado). La ventana de resultados mostrará el área total de la imagen.
    3. Para medir el área y el porcentaje de colágeno, primero, habilite Limitar al umbral haciendo clic en Analizar > Establecer mediciones. Verifique el área, la fracción de área (ImageJ calculará el % de colágeno automáticamente), el límite al umbral y la etiqueta de visualización. Haga clic en Aceptar. A continuación, haga clic en Analizar > medir (o pulse M). La ventana de resultados mostrará: Área de colágeno (recuento absoluto de píxeles) y Fracción de área (% de colágeno de la imagen total).
    4. Guarde los resultados seleccionando Guardar como o cópielos en el portapapeles y péguelos en una hoja de cálculo.

3. Cuantificación de hidroxiprolina hepática

NOTA: Los pasos que requieren el uso de bases fuertes y ácidos deben realizarse con el equipo de protección personal adecuado.

  1. Pesar las muestras de hígado preparadas en el paso 1.8.7 y registrar los pesos. Coloque las alícuotas de tejido en un tubo adecuado para la homogeneización. Agregue agua desionizada utilizando una proporción de agua a tejido de 900 μL de agua por 100 mg de tejido.
  2. Homogeneizar mediante batido de perlas u otro método de acuerdo con las instrucciones del fabricante hasta que el tejido esté completamente homogeneizado, según lo evaluado por observación visual. El protocolo se puede pausar en este punto y los homogeneizados se pueden almacenar a -20 °C.
  3. Realice la precipitación de proteínas como se describe a continuación. Los siguientes pasos se realizan a temperatura ambiente, excepto cuando se especifica una temperatura diferente.
    1. Transfiera aproximadamente 500 μL a 1000 μL de homogeneizado a tubos de centrífuga de 1,5 mL. Transfiera el mismo volumen para todas las muestras.
    2. Añadir ácido tricloroacético para una concentración final del 12% (por ejemplo, añadir 120 μL de ácido tricloroacético a 880 μL de homogeneizado)28. Vórtice brevemente para mezclar.
    3. Incubar las muestras en un baño de hielo/agua durante 30 min. Centrifugar a 6.000 x g a 4 °C durante 10 min. Se forma un precipitado que contiene la proteína. Eliminar el sobrenadante por aspiración. Mantenga los tubos en hielo.
    4. Agregue 1 mL de etanol helado (100%) para lavar el pellet. Vuelva a suspender el pellet por sonicación (u otro método) y verifique visualmente que el material se resuspende. Centrifugar a 6.000 x g a 4 °C durante 10 min y eliminar el sobrenadante por aspiración. Utilice los ajustes de sonicación de acuerdo con las instrucciones del equipo (por ejemplo, utilizando un sonificador Branson SFX 150 con una micropunta de 3,2 mm de diámetro, una amplitud del 70% durante 10 s es eficaz para la mayoría de las muestras). Repita el lavado 2 veces.
    5. Deje que el pellet se seque al aire durante 10 minutos, o más si es necesario.
  4. Realice la hidrólisis de proteínas como se describe a continuación.
    1. Añadir 800 μL de ácido clorhídrico 6 N a los tubos que contienen el precipitado de proteína. Vuelva a suspender el pellet por sonicación (u otro método), utilizando los mismos ajustes que en el paso 3.3.4.
    2. Transfiera la suspensión de proteínas a tubos de vidrio o viales con tapones de rosca; Cierre herméticamente. Incubar los tubos en el horno a 110 °C durante 22 ± 2 h29.
    3. Tubos de centrífuga a 16.000 x g durante 10 min; Las partículas formarán una bolita. Por lo general, esto requiere transferir el hidrolizado de los viales de vidrio a los tubos de centrífuga antes de la centrifugación.
    4. Transfiera el sobrenadante, que contiene hidroxiprolina, a tubos de 1,5 ml. El protocolo se puede pausar en este punto. Los hidrolizados se pueden almacenar a 4 °C.
  5. Prepare una curva estándar para la concentración de hidroxiprolina. Para muestras de hígado con fibrosis en estadios 1 a 3, utilizando las cantidades de tejido indicadas en este protocolo, son adecuadas concentraciones estándar de hasta 125 μg/mL (p. ej., diluciones seriadas de 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,81, 3,91, 1,95 y 0 μg/mL). Prepare los patrones diluyendo hidroxiprolina en ácido clorhídrico 6 N.
  6. Transfiera 40 μL de cada muestra y estándar a tubos de centrífuga marcados de 1,5 mL. Agregue 10 μL de hidróxido de sodio 10 N a cada uno y haga un vórtice brevemente para mezclar.
  7. Realice la oxidación de la hidroxiprolina como se describe a continuación.
    1. Prepare tampón acetato-citrato que contenga ácido acético 1,2% v/v, ácido cítrico 46 g/L, acetato de sodio trihidrato 120 g/L e hidróxido de sodio 34 g/L en agua desionizada, y ajuste el pH del tampón a 6,5.
    2. Prepare una solución de 12,7 g/L de cloramina T en tampón agua:n-propanol:acetato-citrato (1:1:8 v:v:v). Primero, disuelva la cloramina T en agua mezclando, luego agregue n-propanol, mezcle y luego agregue tampón acetato-citrato y mezcle.
    3. Añadir 450 μL de solución de cloramina a los tubos con muestras y estándares. Mezclar por vórtice. Incubar a temperatura ambiente durante 25 min30.
  8. Prepare el reactivo de Ehrlich con benzaldehído 1 M 4-(dimetilamino) en ácido perclórico:propanol 1:2 (v/v). Añada 500 μl del reactivo de Ehrlich a las muestras y a los estándares. Mezclar por vórtice.
  9. Incubar a 65 °C durante 20 minutos en un bloque calefactor, baño de agua o incubadora. Cuando termine la incubación, deje que las muestras y los patrones se enfríen a temperatura ambiente.
  10. Mida la absorbancia de muestras y patrones a una longitud de onda de 550 nm utilizando un espectrofotómetro.
  11. Represente la absorbancia frente a las cantidades estándar y utilice una regresión lineal para crear una curva estándar. Utilice los parámetros de la curva estándar para calcular la concentración de hidroxiprolina en las muestras.
  12. Calcular la cantidad de hidroxiprolina en las muestras de hígado en función del volumen total del hidrolizado (paso 3.4) y normalizar por la masa de tejido correspondiente al volumen de homogeneizado utilizado para la precipitación de proteínas (paso 3.3.1). Exprese los resultados como ng de hidroxiprolina por mg de tejido. Alternativamente, se puede medir la concentración de proteína en homogeneizados y los resultados expresarse como masa de hidroxiprolina por masa de proteína.

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Resultados

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Todos los ratones alimentados con HFFD aumentan más de peso que los ratones de tipo salvaje alimentados con LFFD y desarrollan obesidad (Figura 1A). Aumentan de peso más rápidamente durante las primeras 4 semanas de alimentación con HFFD, ganando aproximadamente 3-4 g/semana. Después de 8 semanas, aumentan de peso a un ritmo similar al de los ratones control (aproximadamente 0,6 g/semana)19. Después de 16 semanas, los ratones Ay alime...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un modelo murino de MASLD con fibrosis hepática que replica la enfermedad en humanos 5,6. Los ratones desarrollan esteatosis hepática, como lo demuestra la esteatosis micro y macrovesicular mixta en la histología y el contenido elevado de triacilglicerol hepático19. Los ratones también desarrollan obesidad, hipertrigliceridemia, intolerancia a la glucosa y se ha reportado hipertensi...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud K22CA178098, R03DK101863 y R15DK131627 y fondos iniciales de Brooklyn College (a JMC).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4-(Dimetilamino)benzaldehídoSigma-AldrichD2004
Ácido acéticoVariosNA
Dieta de calorías ajustadasInotivTD.88137Dieta que contiene grasas (42 % kcal) y sacarosa (34 % en peso y flor). Otros proveedores ofrecen dietas con la misma composición
B6. Cg-ay/JEl Laboratorio Jackson000021La cepa tiene la mutación amarilla letal de Agouti y un trasfondo C57BL6/J. Actualmente, el Laboratorio Jackson tiene la cepa criopreservada.
C57BL/6JEl Laboratorio Jackson000664
CentrifugadoraVariosNACon rotor para tubos de 1,5 mL, refrigerados, capaces de alcanzar 16.000 xg.
CentrifugadoraVariosNA
Cloramina-T hidratadoSigma-Aldrich857319
Ácido cítricoVariosNA
Direct Red 80Sigma365548-5G
EtanolLaboratorios de Descontaminación2701
Solución de formalina, neutral tamponadoSigmaHT501128
FructosaSigma-AldrichF0127
GlucosaSigma-AldrichG8270
Equipos de procesamiento histológicoNANALa incrustación y seccionamiento pueden realizarse en el laboratorio del investigador o en instalaciones externas
HomogeneizadorVariosNALos batidores de perlas son eficientes para procesar múltiples muestras. Se pueden utilizar otros métodos de homogeneización
Ácido clorhídricoVariosNA
HidroxiprolinaSigmaH5534
Dieta de control baja en grasasInotivTD.08485Dieta de control, baja en grasas (13 % kcal) y sacarosa (12 % en p/p)
Microscopio equipado para microscopía de luz polarizadaVariosNA
N-propanolVariosNA
Ácido perclóricoVariosNA
Medio de montaje PermountFisher ScientificSP15-100
Ácido pícrico, solución acuosa saturada, espectroFisher18612375
Trihidrato de acetato de sodioVariosNA
Hidróxido de sodioVariosNA
SonicatorVariosNASonicator es útil para resuspender los pellets en el paso 2.5, pero no es absolutamente necesario
Ácido tricloroacéticoVariosNA
Gafas VWR Micro Cover, rectangularesVWR 48393-081
Portaobjetos de microscopio VWR Premium Superfrost Plus | VWRVWR 48311-703
Agua, desionizadaVariosNAAgua desionizada del sistema de purificación o comprada a un proveedor.
XilenosFisher ScientificX3FAgente de Limpieza Citrisolv   (Fisher 22-143-975) se vende como una alternativa respetuosa con el medio ambiente

Referencias

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