Este estudio mostró que el suero que contiene la medicina tibetana Jiangtangle podría mejorar la disfunción mitocondrial al aumentar los niveles de ATP mitocondrial y glucolítico.
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Artículo de investigación
Efectos protectores del suero que contiene medicina tibetana jiangtangle sobre la función mitocondrial en las células β pancreáticas RIN-m5F
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Resumen
Resumen
β fallo celular causado por la disfunción mitocondrial es la característica principal de la diabetes mellitus tipo 2 (DM2). La medicina tibetana Jiangtangle, compuesta por Berberis kansuensis, Curcumaelongae Rhizoma, Malvae Fructus, Tribuli Fructus, Thlaspi arvense L. y Phyllanthus emblica L., se puede utilizar para remediar la T2DM. Sin embargo, sus efectos sobre la función mitocondrial siguen sin estar claros. Este estudio tiene como objetivo esclarecer los efectos farmacológicos de la medicina tibetana Jiangtangle sobre las mitocondrias. A los 7 días después de la preadministración del medicamento tibetano Jiangtangle, se obtuvo suero de rata mediante la recolección de sangre de la aorta abdominal. Las células β de los islotes pancreáticos de rata (RIN-m5F) se dividieron en grupos de suero control, modelo y que contienen Jiangtangle. El modelo y los grupos séricos que contenían Jiangtangle fueron inducidos para la lesión con medio DMEM que contenía 50 mM de glucosa durante 24 h. El grupo control fue tratado con medio DMEM que no contenía glucosa durante 24 h. A continuación, se añadió medio a los grupos de control y modelo, mientras que los grupos de suero que contenían Jiangtangle se incubaron durante 24 h con medio que contenía 2,5%, 5% y 10% de suero que contenía Jiangtangle. Los resultados de UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS indicaron 90 compuestos en Jiangtangle, entre los cuales 6 compuestos prototípicos ingresan a la sangre. Se utilizó CCK 8 para medir la viabilidad celular, Seahorse XFe se empleó para evaluar el metabolismo energético mitocondrial y se evaluó el efecto del suero que contiene Jiangtangle en el modelo hiperglucémico de células RIN-m5F. El suero que contiene Jiangtangle aumentó la viabilidad celular de RIN-m5F, el nivel de ATP mitocondrial, el nivel glucolítico de ATP, la glucólisis basal, la glucólisis compensatoria, el OCR, la fuga de protones y la respiración máxima.
Introducción
La diabetes mellitus es una enfermedad metabólica crónica ampliamente prevalente en el mundo. Su compleja patogenia representa una seria amenaza para la salud humana, siendo un importante problema de salud pública que debe resolverse con urgencia1. La diabetes se divide principalmente en diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 (DM2), diabetes gestacional y tipos específicos de diabetes2. Con el cambio de estilo de vida y la aceleración del proceso de envejecimiento, la prevalencia de la diabetes ha mostrado una fuerte tendencia al alza en las últimas décadas. China tiene la población diabética más grande del mundo, con más de 118 millones de personas que padecen diabetes, lo que representa aproximadamente el 22% del total mundial, y más del 90% tiene DM2 3,4,5. En todas las patogenias reportadas, se ha anunciado que la disfunción de las células β de los islotes es un mecanismo fundamental durante el proceso de DM2 6,7.
Las mitocondrias, al ser el centro del metabolismo energético celular, son suborgánulos implicados en las funciones básicas del islote β célula8. Los estudios actuales han demostrado que la aparición y el desarrollo de la DM2 están estrechamente relacionados con la actividad, la función y el estrés oxidativo mitocondrial. β fallo celular causado por la disfunción mitocondrial es la característica principal de la DM29. β células ubicadas en los islotes se encargan de sintetizar y secretar insulina, una hormona necesaria para regular los niveles de azúcar en la sangre. En el curso del desarrollo de la DM2, la función mitocondrial anormal, las especies reactivas de oxígeno fortificadas y la reacción al estrés oxidativo rompen el equilibrio dinámico mitocondrial de las células β y afectan la secreción y el metabolismo de la insulina10.
La medicina tibetana Jiangtangle está compuesta por Berberis kansuensis, Curcumaelongae, Rhizoma, Malvae Fructus, Tribuli Fructus, Thlaspi arvense L. y Phyllanthus emblica L. (Figura 1). Es un polvo amarillo con un olor fragante y un sabor amargo. Se puede utilizar para curar la boca seca, la polidipsia, la emaciación, la poliuria, el pie diabético, la picazón en la piel y otros síntomas causados por la diabetes. La evidencia clínica existente ha demostrado que los alcaloides de la corteza de Berberis pueden aliviar eficazmente la DM2 al reducir el azúcar en la sangre, mejorar la resistencia a la insulina y reducir la inflamación. La curcumina tiene el potencial de mejorar la DM2 al reducir los niveles de glucosa en sangre, mejorar la sensibilidad a la insulina, modular los perfiles lipídicos yejercer efectos antiinflamatorios y antioxidantes. Además, Malave Fructus, Tribulifructus, Thlaspi arvense L. y Phyllanthus emblica L. también tienen actividad antidiabética u oxidante 13,14,15. En la actualidad, la eficacia, la base material y el mecanismo de la medicina tibetana Jiangtangle en la terapia de la DM2 aún no se han revelado. La composición de la medicina tibetana china es compleja y su prevención y tratamiento de enfermedades se basan en la teoría del uso de drogas desde una perspectiva holística y sistemática. En la actualidad, la farmacoquímica del suero chino puede explicar en parte los componentes de absorción en la sangre y se ha convertido en un medio importante para explorar las bases materiales de lasmedicinas tibetanas. Este estudio inicialmente dilucidó el efecto protector de la medicina tibetana Jiangtangle sobre las mitocondrias in vitro, con un enfoque en probar la nueva hipótesis de que el suero que contiene Jiangtangle puede mitigar la disfunción mitocondrial en las células β de los islotes pancreáticos de rata (RIN-m5F) bajo estrés con alta glucosa.
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Protocolo
El Comité Administrativo de Sichuan Scientist Biological Testing Biotechnology Co., Ltd. ha aprobado el protocolo animal (Número de registro: SYST-2024-019). Para este estudio, se mantuvieron ratas macho Sprague Dawley (SD), de 8 a 10 semanas de edad y con un peso de 260 a 300 g, en jaulas de ventilación independientes en un ambiente controlado de 23 ± 2 °C y 55%-60% de humedad relativa. Estos animales específicos libres de patógenos se obtuvieron de un proveedor comercial (consulte la Tabla de materiales). Todas las ratas se sometieron a un período de alimentación adaptativa de 1 semana para aclimatarse al nuevo entorno antes del inicio del experimento, con acceso sin restricciones al agua y la comida.
Preparación experimental
Los fármacos y reactivos requeridos se prepararon de acuerdo con el diagrama de flujo experimental (ver Tabla de Materiales). En este estudio se utilizaron ratas SPF SD (8-10 semanas, 260-300 g). Todos los animales fueron comprados a un proveedor comercial (ver Tabla de Materiales). Después de la cuarentena, los animales se mantuvieron a una temperatura ambiente constante con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h y se alimentaron con una dieta estándar para roedores y agua.
Tratamiento animal y recolección de suero
A todas las ratas que se sometieron a alimentación adaptativa se les administró medicina tibetana Jiangtangle por sonda nasogástrica durante 7 días. La dosis clínica fue de 0,6 g/d, que se convirtió en una dosis en ratas de 1,26 g/kg17. Después de 1 h de la última administración, las ratas fueron anestesiadas con isoflurano al 3%-4% para inducción y 2% para mantenimiento. A continuación, las ratas anestesiadas se colocaron en una mesa quirúrgica y el sitio quirúrgico se desinfectó con yodóforo. Se hizo una incisión a lo largo de la línea media del abdomen para exponer la aorta abdominal. La sangre se extrajo lentamente de la aorta con una jeringa heparinizada (8 mL) y se transfirió a un tubo centrífugo para su centrifugación. La sangre recolectada se centrifugó a 2360 x g durante 10 min a 4 °C para separar el suero. A continuación, las muestras de suero se alícurates en tubos criogénicos a 5 mL por tubo y se almacenaron en un refrigerador médico a -80 °C (ver Tabla de Materiales) para su posterior análisis.
Análisis UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS
Preparación de muestras de material medicinal: el medicamento tibetano Jiangtangle (140,0 mg) se pesó con precisión y se disolvió en 25 mL de metanol (véase la tabla de materiales), seguido de 30 minutos de sonicación a 40 kHz, 300 W. La solución resultante se filtró a través de una membrana de 0,22 μm para obtener la muestra de prueba.
Preparación de la muestra de suero: 100 μL de suero se mezclaron completamente con 400 μL de metanol frío y acetonitrilo (v/v, 1:1; ver Tabla de Materiales) por vórtice. La mezcla se procesó por sonicación (40 kHz, 300 W) durante 1 h en un baño de hielo. A continuación, la mezcla se incubó a -20 °C durante 1 h y se centrifugó a 4 °C durante 20 min a 14.000 x g. A continuación, los sobrenadantes se cosecharon y secaron al vacío para el análisis UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS.
Condiciones cromatográficas: Los sobrenadantes se midieron mediante un sistema UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS (ver Tabla de Materiales). Para la separación de LC, se utilizó una columna ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm). La fase móvil consistió en A (0,1% de ácido fórmico en agua) y B (100% de acetonitrilo). El caudal fue de 0,3 mL/min, con un programa de gradiente específico de 5%-95% B (0-30 min), 95% B (30-35 min). El volumen de inyección fue de 5 μL. Los datos de MS se adquirieron en los modos ESI positivo y negativo por separado. La fuente HESI había establecido condiciones para el voltaje de pulverización, la temperatura capilar, los flujos de gas, etc. El instrumento escaneó a m/z 70-1050 Da, con diferentes resoluciones para MS completa y MS/MS. Los datos brutos de MS se procesaron utilizando MS-DIAL para la alineación de picos. La composición de la medicina tibetana Jiangtangle se identificó mediante datos precisos de masa y MS/MS en bases de datos públicas. Solo se mantuvieron las variables con más del 50% de valores distintos de cero en al menos un grupo.
Cultivo y tratamiento celular
Las células RIN-m5F (ver Tabla de Materiales) se cultivaron con medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina/estreptomicina en una incubadora controlada de CO2 al 5% (ver Tabla de Materiales) a 37 °C. Se tomaron células RIN-m5F en etapa de crecimiento logarítmico, se contaron después de la digestión y se inocularon en placas de 96 pocillos con 1 x 105 celdas por pozo. Usando 10-60 mM de glucosa, se realizó la inducción celular para imitar un entorno de alta glucosa de DM2. Las células RIN-m5F se dividieron en grupos de control, modelo y 2,5%, 5% y 10% de suero que contenían Jiangtangle. Las células del grupo control fueron tratadas con DMEM, y otros grupos fueron inducidos con DMEM que contenía glucosa durante 24 h. Los grupos control y modelo se añadieron con medio, mientras que cada grupo de suero se añadió con DMEM que contenía 2,5%, 5% y 10% de suero que contenía Jiangtangle, y se incubaron durante 24 h a 37 °C con 5% de CO2.
Análisis CCK 8
La viabilidad celular se midió mediante CCK 8 (ver Tabla de Materiales). Las células RIN-m5F se inocularon en placas de 96 pocillos y se trataron con glucosa (0, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 mM). A continuación, se añadieron 100 μL de DMEM con suero que contenía Jiangtangle a los pocillos y se incubaron a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h. Cada grupo incluyó 6 pozos replicados. Después de 24 h de incubación con glucosa y 24 h de incubación con suero que contiene Jiangtangle, se añadieron 10 μL de solución de CCK 8 y se incubaron a 37 °C durante otras 1,5 h. Se utilizó un lector de microplacas de longitud de onda completa (ver Tabla de Materiales) para detectar los valores de absorbancia de cada agujero a 450 nm16.
Análisis de la función mitocondrial
Como informamos anteriormente18, se utilizó el analizador Seahorse XFe 24 (ver Tabla de Materiales) para evaluar la tasa de producción de ATP en tiempo real y la tasa de glucólisis. Las células RIN-m5F se inocularon en microplacas Seahorse XFe24 V24. Las células se sembraron en placas de cultivo celular XF24 utilizando un protocolo de dos pasos: se dispensaron 100 μL de suspensión celular en cada pocillo y la placa se dejó sin tocar durante 1 h. A continuación, la placa se transfirió a una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 4 h para favorecer la fijación inicial. A continuación, se añadieron 150 μL de DMEM a cada pocillo. Después de modelar durante 24 h y administrar el fármaco durante 24 h, la solución de detección se preparó añadiendo un 1% de glucosa, un 1% de piruvato y un 1% de glutamina al medio Seahorse XF DMEM. Luego, las células se lavaron dos veces con 1 mL de solución de detección. Para utilizar el kit de medición de la tasa de ATP en tiempo real y el kit de ensayo de la tasa de glucólisis, se resuspendieron 56 μL de oligomicina y 62 μL de rotenona/antimicina A y se añadieron a los pocillos de los cartuchos sensores A y B, respectivamente. Y la placa de cultivo celular se colocó en una incubadora de cultivo celular libre de CO2 durante 60 min. Finalmente, la tasa de producción de ATP y la tasa de glucólisis se monitorearon en tiempo real mediante un sistema de inyección automática. Todos los experimentos se realizaron a 37 °C y los datos se analizaron utilizando el software XF Wave19.
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Resultados
UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS demostró que la medicina tibetana Jiangtangle contenía compuestos como fenoles, alcaloides, flavonoides, nucleósidos, ácidos orgánicos, aminoácidos, terpenoides, cumarinas, glucósidos, taninos, lignanos, esteroides y otros. (Figura 2, Tabla 1). A las ratas SD se les administró por vía oral 1,26 g/kg de medicamento tibetano Jiangtangle una vez al día. En la Figura 3 se presenta una visión ge...
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Discusión
La DM2 es generalmente considerada como una enfermedad metabólica crónica de inicio oculto y alta prevalencia, y se acompaña de muchas complicaciones relacionadas con la diabetes, como disfunción ocular, cardiovascular y renal 20,21,22,23. Sus manifestaciones clínicas incluyen elevación de azúcar en sangre, poliuria, polidipsia, pérdida de peso e incluso ceguer...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo contó con el apoyo del Proyecto de Construcción de Connotación del 14º Plan Quinquenal de la Universidad de Medicina Tibetana (2023ZYYGH05) y el Departamento de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Sichuan (2024NSFSC1845). Mientras tanto, los autores desean agradecer al Dr. Lu Yang, ingeniero senior de equipos en el Instituto Innovador de Medicina China y Phamacy/Academy for Interdiscipline, por brindar servicios técnicos para las técnicas de Seahorse XF.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| -80 ° C refrigerador médico | Mether | MDF-86H118 | |
| 0.22 µ m membrana acuosa | Jinteng | JTMF0445 | |
| 0,22 µ membrana filtrante microporosa tipo aguja | Jinteng | JTSFM013001 | |
| Acetonitrilo | Aladdin | A104440 | |
| Agilent OpenLab software | Agilent | Versión 2.X | |
| Cabina de bioseguridad | Airtech | BSC-1004 II A2 | |
| Kit de recuento de células-8 | Bioground | BG0025 | |
| CelMate CO2 Incubadora | Esco Micro Pte Ltd. | CLM-240B-8 | |
| Columna cromatográfica | Agilent | SB-C18 | |
| águila modificado de Dulbecco | Gibco | ||
| NCM Biotech | 20230801 | ||
| Glucosa | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | P012-180-180222 | |
| Software GraphPad Prism | Software GraphPad, LLC | Versión 9.5.1 | |
| Centrífuga refrigerada de alta velocidad | Thermo Fisher Scientific | Legend Micro 17R | |
| Centrífuga de baja velocidad | Hallon | NH5 | |
| Metanol | Aladino | M116118 | |
| Penicilina-estreptomicina | NCM Biotech | C125C5 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (1×) | Gibco | 8120485 | |
| Rata islote pancreático β-células | ATCC | CRL-11605 | |
| ReadMax 1500 absorción de luz enzima de longitud de onda completa | Flash | ReadMax 1500 | |
| Seahorse XF kit de ensayo de tasa de glucólisis | Agilent | 103344-100 | |
| Seahorse XF kit de medición de tasa de ATP en tiempo real | Agilent | 103592-100 | |
| Seahorse XFe 24 analizador | Agilent | XFe24 | |
| Tripsina (0.25%, 1×) | Analizador HyClone | J210045 | |
| UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS | Thermo Scientific | QE Q Mezclador | |
| Kylin-Bell | XW-80A |
Referencias
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