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Artículo de método

Un canal de brebajes para generar unidades taxonómicas operativas moleculares (MOTU) entre escarabajos ribereños y acuáticos

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DOI:

10.3791/68323

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11 de julio de 2025

 ,  , 
1Ateneo Biodiversity Research Laboratory, Department of Biology, School of Science and Engineering, Higher Education Cluster, Ateneo de Manila University, 2Ateneo Institute of Sustainability, Ateneo de Manila University, 3Ateneo School of Medicine and Public Health, Higher Education Cluster, Ateneo de Manila University

En este artículo

Resumen

El protocolo presentado aquí tiene como objetivo guiar a los usuarios en el procesamiento informático de las secuencias génicas de la subunidad I (COI) del citocromo c oxidasa generadas a partir de escarabajos, de modo que la hipótesis de agrupamiento de especies llamadas unidades taxonómicas operativas moleculares (MOTU) se pueda generar a partir del ADN.

Resumen

El declive de la biodiversidad está ocurriendo a ritmos inimaginables, sin embargo, el monitoreo de la biodiversidad se ve obstaculizado por una gran cantidad de factores, incluido el inventario incompleto de la diversidad de referencia y la disminución de la población de taxónomos calificados. Superar este impedimento en el inventario de especies de "taxones oscuros", o grupos hiperdiversos a menudo poco estudiados en taxonomía, es particularmente crucial en los trópicos que enfrentan presiones ambientales insuperables. Si bien la taxonomía alfa basada en la morfología sigue siendo el estándar de oro en la identificación de especies, los métodos basados en el ADN han demostrado un tremendo potencial para acelerar la delineación y el descubrimiento de especies. Aquí, describimos una línea de evención para generar unidades taxonómicas operacionales moleculares (MOTUs) que involucra seis enfoques de delimitación de especies moleculares implementados en dos géneros de escarabajos altamente discretos, a saber, Byrrhinus Motschulsky, 1858 de la familia Limnichidae y Anacaena Thomson, 1859 de la familia Hydrophilidae, de Filipinas. Dado que este protocolo se centra en el procesamiento de códigos de barras de ADN y dado que estos datos genéticos se pueden obtener mediante secuenciación o descarga de bases de datos en línea, el punto de partida del protocolo aquí descrito son las secuencias de ADN. Dados los códigos de barras COI, el oleoducto utiliza una combinación de tres enfoques de delimitación de especies moleculares basados en umbrales, a saber, TaxonDNA, K2P y ASAP, que utilizan la alineación de secuencias como datos de entrada. Además, la canalización continúa con tres enfoques basados en coalescencia, a saber, PTP-ML, PTP-BI y mPTP, que requieren un archivo de árbol como datos de entrada. Algunos enfoques implican el uso de servidores web, mientras que otros utilizan software local. Con la selección de los métodos algorítmicos presentados, se pueden identificar los MOTU, ya sea por consenso o por mayoría. Sorprendentemente, este oleoducto delineó especies de escarabajos casi conspicuas de Filipinas, incluso aquellas documentadas en la misma localidad o en localidades adyacentes.

Introducción

Con las tasas sin precedentes de disminución de especies globales en diversos taxones 1,2,3,4, el ímpetu para crear un inventario integral de biodiversidad, que incluya especies no descubiertas y descritas previamente, se convierte en una carrera contra el tiempo 2,5. Por un lado, la conservación de la biodiversidad solo tiene sentido a la luz de un conocimiento taxonómico adecuado 6,7. Por lo tanto, la identificación de la biodiversidad a nivel de especie es necesaria, dado que especies estrechamente relacionadas pero diferentes pueden tener nichos fundamentales únicos8.

En la sistemática de escarabajos, la taxonomía alfa o taxonomía tradicional es el estándar de oro en la identificación de especies, similar a la mayoría delos grupos de animales, si no a todos los 9. Este enfoque se basa en caracteres morfológicos para clasificar los organismos en una taxonomía superior y para proporcionar identificación a nivel de especie10,11. En muchos casos, la identificación de la familia12 o incluso de la categoríade género 13 puede realizarse utilizando únicamente características morfológicas externas, como la forma del cuerpo y las adaptaciones especializadas. Mientras tanto, la identificación a nivel de especie en los escarabajos generalmente se realiza a través de la comparación de los detalles estructurales del aedeagus o los genitales masculinos 14,15,16.

A pesar de la amplia aceptación de esta taxonomía alfa basada en la morfología, este enfoque para el descubrimiento de especies se ve obstaculizado por numerosos "impedimentos taxonómicos"6,17,18, especialmente entre los invertebrados19. En la sistemática de escarabajos, la identificación y/o descubrimiento de especies utilizando la taxonomía alfa se enfrenta a los desafíos de tener un número limitado de taxónomos capacitados20,21, de descripciones previas breves y apenas informativas22, y de problemas logísticos relacionados con el acceso a la literatura y a los especímenes tipo23.

Esto se agrava incluso cuando el taxón en cuestión es críptico o muy discreto. La especie críptica se refiere al conjunto de especies del mismo género, o incluso de géneros diferentes, que no pueden ser fácilmente delineadas por la morfología comparativa, dadas las sutiles diferencias fenéticas interespecíficas24. Algunos taxones crípticos, considerados como "taxones oscuros"25,26,27, también sufren de ser hiperdiversos, pero muy poco estudiados. Desafortunadamente, esto no es raro en los escarabajos ribereños y acuáticos 8,28. El hecho de no abordar la delimitación de especies entre taxones oscuros crípticos amenaza la biodiversidad, ya que se da una medida de conservación única para todos los organismos de nichos y requisitos ecológicos potencialmente diferentes 8,29.

Teniendo en cuenta estos desafíos, la "taxonomía integradora"23, o el enfoque de acoplar la taxonomía alfa con otra línea de evidencia, ha ganado terreno como medio para erigir nuevas especies en las últimas dos décadas 30,31,32. Una de esas líneas de evidencia utilizada en los estudios taxonómicos integrativos sobre los escarabajos 33,34,35,36,37,38,39 y otros órdenes de insectos 40,41,42,43,44,45 es la secuencia de ADN. En particular, el gen de la subunidad I (COI) de la citocromo c oxidasa mitocondrial se está utilizando para codificar un conjunto diverso de animales debido a su naturaleza moderadamente conservadora 46,47,48. Mientras que su extremo 5' (COI-5' de 658 pb' de largo, también conocido como el 'fragmento de código de barras' o 'fragmento de Folmer', se ha propuesto como la secuencia de "diagnóstico"49, el COI-3' de 723 pb de largo también se está utilizando debido a un robusto conjunto de cebadores para el extremo 3' 50,51,52.

Mientras que el código de barras de ADN que utiliza COI fue concebido para la identificación a nivel de especie, está limitado por un repositorio de secuencias a priori 53, como GenBank54 y BOLD55, los enfoques de delimitación molecular de especies establecen límites de especies utilizando solo las secuencias de ADN proporcionadas sin ningún repositorio de requisitos previos56. Hay dos clases de enfoques de delimitación de especies moleculares basados en el archivo de entrada. En primer lugar, utilizando la alineación de la secuencia como entrada, los enfoques basados en umbrales utilizan valores de corte para determinar la divergencia entre y dentro de la especie 48,57,58. Como métodos basados en la distancia, estos enfoques se basan en una distancia intraespecífica máxima observada del 3% para los insectos, lo que se conoce como la "brecha de código de barras"51,59. Algunos de los enfoques basados en umbrales son SpeciesIdentifier implementado en TaxonDNA60, la distancia genética a través del parámetro Kimura 2 (K2P)61 y Assemble Species by Automatic Partitioning (ASAP)62.

En segundo lugar, utilizando el árbol como archivo de entrada, los enfoques basados en coalescencia identifican los límites de las especies y clasifican los linajes independientes determinando el cambio en la tasa de ramificación del linaje 63,64,66. A menudo basándose en el concepto filogenéticode especie 67, los enfoques basados en coalescencia incluyen los procesos de árbol de Poisson (PTP)68 y su variación, PTP69 de tasa múltiple. En cualquier caso, los grupos formados por los enfoques de delimitación de especies moleculares se denominan colectivamente unidades taxonómicas operacionales moleculares (MOTU).

Aquí, presentamos métodos para una tubería de brebaje para generar MOTU que involucran tres enfoques basados en umbrales y tres enfoques basados en coalescentes (Figura 1). La tubería se prueba en dos conjuntos de datos, a saber, (1) secuencias COI-3' de los escarabajos ribereños Byrrhinus Motschulsky, 1858, que se compone de dos especies publicadas35 previamente erigidas utilizando taxonomía integradora y secuencias adicionales de especies no descritas, y (2) secuencias COI-5' de escarabajos Anacaena Thomson, 1859, que se compone de secuencias de dos especies publicadas70 Previamente erigidos utilizando la taxonomía alfa y secuencias adicionales de especies no descritas.

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Figura 1: Diagrama de flujo de la tubería de brebaje para generar MOTU. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

Los materiales de partida para este proceso de creación son secuencias de ADN, que pueden descargarse de repositorios en línea (por ejemplo, BOLD, GenBank) o generarse a partir de la secuenciaciónSanger 71. En la Tabla 1 y la Tabla 2 se enumeran los números de accesión para los conjuntos de datos cuyos resultados representativos se presentan en este documento.

1. Etapa preparatoria para los enfoques basados en umbrales: alineación de secuencias

  1. Secuencias de carga en MEGA X72.
    NOTA: MEGA X se puede descargar desde https://www.megasoftware.net/
    1. Haz clic en Alinear para abrir un menú desplegable. Haga clic en Editar/Crear alineación y seleccione Crear una nueva alineación. Haga clic en Aceptar para confirmar esta selección. Seleccione ADN como tipo de datos para la alineación.
    2. Pase el ratón por encima de la pestaña Editar y seleccione Insertar secuencia desde archivo. Navegue hasta el directorio con las secuencias y selecciónelas para cargarlas en MEGA.
  2. Alinee secuencias haciendo clic en Alineación, y luego en Alinear por ClustalW73. Continúe con la configuración predeterminada y haga clic en Aceptar.
  3. Edite manualmente las secuencias recortando ambos extremos y limpiando las inserciones o eliminaciones.
    1. Para eliminar inserciones, haga clic en las bases y/o posiciones insertadas y presione Eliminar en el teclado.
    2. Para corregir las eliminaciones, haga clic en la posición que se supone que se ha eliminado como se indica con "-". Elimine el "-" y escriba la base deseada.
    3. Encuentre la primera posición en la que todas las secuencias tengan un carácter. Haga clic en el cuadro en blanco en el encabezado de la fila de la posición a la izquierda de la posición determinada y arrastre hasta que se seleccionen las posiciones sobrantes para todas las secuencias hasta el final inicial. Presione Eliminar para recortar.
    4. Repita el paso 1.3.3 buscando la última posición en la que todas las secuencias tengan un carácter. Haga clic en el cuadro en blanco en la fila de encabezado de la posición a la derecha de la posición determinada, arrastre hasta que se seleccionen las posiciones sobrantes para todas las secuencias hasta el final del terminal. Presione Eliminar.
      NOTA: La Figura 2A muestra una buena alineación de las secuencias de ADN. El conjunto de datos final es una matriz de secuencias de igual longitud; Por lo tanto, la longitud de la secuencia no es un factor que afecte los resultados del estudio. Las secuencias de referencia sirven como base para la longitud final de la matriz de alineación.
  4. Traslade la secuencia para comprobar si hay codones de parada, dado que COI es una secuencia codificante de proteínas.
    1. Seleccione todas las secuencias, luego haga clic en la pestaña Secuencias de proteínas traducidas .
    2. Cuando se le solicite, verifique el código genético como Invertebrado Mitocondrial. Si el código genético es diferente, haga clic en No y aparecerá un menú que le permitirá marcar la casilla Código genético mitocondrial de invertebrados .
    3. Si los codones de parada, como se indica con asteriscos en el cuerpo de alineación, están presentes para una columna completa, haga clic en Secuencias de ADN y elimine la primera posición para todas las secuencias.
    4. Repita el paso anterior si los codones de parada todavía están presentes en cualquier secuencia.
    5. Si los codones de parada aún están presentes, restaure las posiciones eliminadas anteriormente. Seleccione todas las secuencias, luego pase el mouse sobre la pestaña Datos y haga clic en Invertir.
    6. Repita el paso 1.4.1. Si todavía hay codones de parada, repita los pasos 1.4.3 y 1.4.4.
      NOTA: La Figura 2B muestra una buena alineación de codones.
  5. Haga clic en Secuencias de ADN y guarde la alineación de la secuencia en .mas/x. Exporte la secuencia a otros tipos de archivo pertinentes, como archivos .meg y archivos .fasta.
    NOTA: Ciertos enfoques de delimitación de especies moleculares funcionan mejor sin el grupo externo. Por lo tanto, una posible consideración es generar una copia del archivo de alineación sin el grupo externo.

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Figura 2: Alineación de secuencias en MEGA X. (A) Alineación de la secuencia final de ADN limpiada manualmente y (B) alineación de la secuencia de proteínas traducida del conjunto de datos de Byrrhinus que no muestra inserciones, deleciones ni brechas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Delimitación por módulo de ADN taxonómico en el Identificador de Especie 1.8

NOTA: El identificador de especie se puede descargar desde https://taxondna.sourceforge.net/

  1. TaxonDNA abierto. Haga clic en Importar, luego haga clic en FASTA. Cargue la alineación en formato .fasta.
  2. Haga clic en Módulos y haga clic en Clúster. Establezca el umbral en 3%. A continuación, active Generar información sobre un clúster individual (figura 3).
  3. Haga clic en ¡Crear clústeres ahora!. Guarde los resultados tomando una captura de pantalla.

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Figura 3: Ventana de TaxonDNA en el Identificador de Especies 1.8 que muestra el umbral del 3% identificado por el usuario para la delimitación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Delimitación por Kimura de 2 parámetros (K2P) en MEGA X

  1. En MEGA, abra el archivo .meg haciendo clic en Archivo, luego en Abrir un archivo/sesión. Haga clic en Distancia, luego haga clic en Calcular distancias por pares. Confirme el archivo .meg para la delimitación.
  2. Pase el ratón por encima del cuadro amarillo situado junto a Modelo/Método y, a continuación, haga clic en la flecha que aparece a la derecha del cuadro.
  3. Seleccione el modelo de 2 parámetros de Kimura en el menú desplegable. Haga clic en Aceptar para ejecutar el programa. Abra la ventana de salida de datos (Figura 4).
  4. Haga clic en Archivo, luego en Exportar/Imprimir distancias.
  5. Abra el menú desplegable junto a Formato de salida y seleccione XL: Libro de Microsoft Excel. En Decimales, elija 4.
  6. Guarde la hoja de cálculo resultante en Microsoft Excel. Utilice el formato condicional para resaltar aquellos con una distancia inferior a 0,03 (o 3%).
    NOTA: A diferencia de los otros enfoques discutidos en este artículo, K2P no proporciona inmediatamente la agrupación en clústeres porque depende del umbral identificado por el usuario. Esta línea de producción trabaja en la suposición de que el umbral es del 3%, lo que significa que cualquier par de secuencias cuya distancia genética sea inferior al 3% pertenece al mismo grupo molecular.

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Figura 4: Ventana resultante en MEGA X que muestra los resultados del parámetro Kimura-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Delimitación por ensamble de especies mediante partición automática (ASAP)

  1. Vaya al servidor web ASAP: https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap/asapweb.html
  2. Cargue la alineación haciendo clic en el cuadro naranja con la etiqueta Elegir un archivo... y seleccionando el archivo .fasta. Alternativamente, arrastre el archivo .fasta al cuadro naranja. Desplázate hacia abajo y haz clic en Ir.
  3. Para descargar la agrupación, haga clic en la lista de la fila con la puntuación ASAP más baja y el rango p-val más alto (Figura 5).
    NOTA: La salida del resultado es un archivo .txt, que presenta subconjuntos de los grupos moleculares.

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Figura 5: Ventana resultante en ASAP que muestra las posibles delimitaciones. El primer resultado (caja azul) se acepta debido a la puntuación ASAP más baja (caja roja) y el rango P-val más alto (caja amarilla). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Paso preparatorio para los enfoques basados en coalescencia: Estimación de árboles

  1. Abra el archivo .meg haciendo clic en Datos, luego en Abrir un archivo/sesión. Pruebe el modelo de sustitución más adecuado.
    1. Haga clic en Modelos, luego busque Mejores modelos de ADN/proteínas (ML). Confirme el archivo .meg para el análisis.
    2. Haga clic en Aceptar en el menú Preferencias de análisis (Figura 6A). Tome nota del mejor modelo que utiliza el valor más bajo de BIC y AICc (Figura 6B).
      NOTA: Este suele ser el primero en la lista de modelos en la ventana resultante. Consulte los nombres completos de los nombres de modelos abreviados en la parte inferior de la ventana resultante.
  2. Genere el árbol.
    1. Haga clic en Filogenia y luego en Construir/Probar árbol de máxima verosimilitud.
    2. Utilice el modelo de sustitución de nucleótidos que mejor se adapte. Para ello, haga clic en el cuadro amarillo junto a Modelo/Método. Seleccione el modelo en el menú desplegable.
    3. Si el modelo de sustitución de nucleótidos más adecuado tiene '+G' o '+I' o ambos, haga clic en el cuadro junto a Tasas entre sitios y seleccione los parámetros (G, I, G + I) en el menú desplegable (Figura 6C).
    4. En Prueba de filogenia, haga clic en el cuadro junto a Prueba de filogenia y seleccione Método de arranque en el menú desplegable. Haga clic en la casilla junto a "No. de replicaciones de Bootstrap" y escriba 1000 (Figura 6C). Haga clic en Aceptar para ejecutar el análisis.
  3. Una vez que se abra una ventana que contenga el árbol resultante (Figura 6D), guarde la sesión del árbol como .mts/x. Guarde la salida como archivo .nwk. Guarde también el árbol como .png archivo de imagen.

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Figura 6: Estimación de árboles en MEGA X como paso preparatorio para enfoques basados en coalescencia. (A) Configuración para determinar el modelo de sustitución de nucleótidos más adecuado. (B) Para el conjunto de datos de Byrrhinus , el modelo más adecuado es GTR + I debido a los valores más bajos de BIC y AICc (cuadro rojo). (C) Al ejecutar el árbol de máxima verosimilitud, se establecieron GTR (cuadro amarillo) + I (cuadro azul) como parámetros. (D) El árbol de ML sin procesar resultante que se utilizará en los análisis posteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Delimitación por Procesos de Árbol de Poisson (PTP)

NOTA: Los pasos a continuación producirán los resultados de PTP-ML y PTP-BI.

  1. Vaya al servidor web PTP: https://species.h-its.org/ptp/
  2. Cargue un archivo newick haciendo clic en Elegir archivo. En Mi árbol es, seleccione Rooteado (Figura 7A).
  3. Introduzca los parámetros para el análisis. En el número de generaciones de MCMC, entrada 100000. En Adelgazamiento, escriba 100. En Burn-in, escriba 0.1. En Semilla, entrada 123.
  4. Introduzca el grupo externo escribiendo el nombre de las sugerencias en el cuadro debajo de Nombres de taxones del grupo externo (si los hay). Las instrucciones para formatear la entrada se encuentran a la derecha del cuadro de entrada.
  5. Introduzca la dirección de correo electrónico en el campo correspondiente y haga clic en Enviar. En la ventana de resultados de la delimitación de especies PTP, haga clic aquí para abrir la ventana de resultados.
  6. En la solución de máxima verosimilitud, descargue los resultados de PTP-ML haciendo clic en Descargar resultados de delimitación (Figura 7B).
  7. En la solución compatible con bayesianos, descargue los resultados de PTP-BI haciendo clic en Descargar resultados de delimitación.
    NOTA: Los resultados indicarían grupos de secuencias en particiones. Estas se etiquetarán como especies numeradas seguidas de un valor de soporte, en el que 1.000 es lo ideal.

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Figura 7: Delimitación de especies moleculares por procesos de árbol de Poisson. (A) Ventanas que muestran los parámetros de entrada. (B) Ventana resultante en el servidor web PTP, con enlace que contiene los resultados de la delimitación (recuadro rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Delimitación mediante procesos de árbol de Poisson de múltiples tasas (mPTP)

  1. Vaya al servidor web mPTP: https://mptp.h-its.org/#/tree
  2. Cargue el archivo newick arrastrándolo al rectángulo gris o haciendo clic en el rectángulo. Una vez que los datos se carguen en la misma página, haga clic en Continuar con la selección de grupos externos (Figura 8A).
  3. En la página de especificación del grupo externo, seleccione el grupo externo haciendo clic en el cuadro junto a las etiquetas de taxones de los especímenes del grupo externo. Haga clic en la opción Recortar grupo externo en la parte inferior de la secuencia. Haga clic en Selección de modelo.
  4. Haga clic en MPTP y, a continuación, haga clic en Opciones de visualización. En la página Opciones de visualización , acepte la configuración predeterminada.
    NOTA: Alternativamente, el tamaño total de la imagen se puede ajustar ingresando un valor (en px) en el ancho SVG. La fuente y el espaciado del texto se pueden ajustar ingresando los tamaños deseados (en px) en Tamaño de fuente SVG, Espacio entre puntas, Margen izquierdo, Margen derecho, Margen superior y Margen inferior.
  5. Haga clic en Datos de contacto. Introduzca la dirección de correo electrónico para futuras referencias de resultados (opcional).
  6. Haga clic en Descripción general. Asegúrese de revisar el número de taxones de entrada y los grupos externos seleccionados.
  7. Haga clic en Enviar. Haga clic con el botón secundario en los archivos de Archivos descargables (Figura 8B) y seleccione Guardar como... para guardar los resultados.
    NOTA: El archivo de texto de salida indicará el número total de especies delimitadas al comienzo de los resultados. A continuación, se presentarán las secuencias que se incluyen en cada uno de los grupos. Estos clústeres y las secuencias correspondientes se organizan de forma similar al árbol generado en el archivo .svg. El archivo SVG mPTP mostrará la agrupación en clústeres de las secuencias. Los grupos se presentan mediante grupos de secuencias conectadas por ramas rojas a lo largo del árbol. Cada conjunto aislado de ramas rojas indica un MOTU singular.

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Figura 8: Delimitación molecular de especies mediante procesos de árbol de Poisson multitasa. (A) Ventanas que muestran la información de lectura mPTP con respecto al árbol cargado. (B) Ventana resultante en el servidor web mPTP, con enlace que contiene los resultados de la delimitación (recuadro rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

8. Generación de MOTU

  1. Abra el árbol usando un programa de edición de fotos o usando PowerPoint.
  2. Cree una barra para representar los resultados de cada enfoque de delimitación de especies moleculares (consulte la Figura 9 y la Figura 10 para ver muestras). Asegúrese de que cualquier barra individual se alinee con las secuencias que incluye en su grupo molecular.
  3. Determine el MOTU por uno de estos dos enfoques74
    1. Si todos los enfoques generan resultados idénticos para un grupo molecular dado, se erige el grupo molecular como un MOTU por consenso.
    2. Si la mayoría de los enfoques generan resultados idénticos para un grupo molecular dado, se debe erigir el grupo molecular como un MOTU por mayoría.

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Resultados

Este artículo implementó una línea de invención de delimitación molecular de especies, que incluye TaxonDNA, K2P, ASAP, dos variaciones de PTP y mPTP, para escarabajos acuáticos y ribereños. Los resultados de cada uno de los seis enfoques se denominan «grupos moleculares», mientras que el resumen se denomina «unidades taxonómicas operacionales moleculares» o MOTU75.

El canal de brebajes se probó en dos conjuntos de datos. El primer conjunto de datos (Tabla 1,

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Discusión

Si bien las secuencias de ADN, especialmente el COI49, pueden compararse con las secuencias de referencia 22,53,78 en repositorios públicos en línea 54,55,79,80 para un sistema de bioidentificación46, este enfoque está limitado por...

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Divulgaciones

No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a la Oficina de Pesca y Recursos Acuáticos (BFAR, por sus siglas en inglés) y a las unidades gubernamentales locales interesadas por otorgarnos el consentimiento informado previo para realizar muestreos de biodiversidad. Agradecemos al Dr. Hendrik Freitag por su orientación sobre el trabajo taxonómico. También agradecemos a los revisores y editores por sus comentarios útiles y constructivos. Por último, expresamos nuestro mayor agradecimiento a la Subvención de Grandes Proyectos del Consejo de Investigación Universitaria (URC 2022-09) y a la Subvención de Publicación de Acceso Abierto de la Universidad Ateneo de Manila, al Fondo de Investigación y Desarrollo Estudiantil SC Johnson para el Liderazgo Ambiental del Instituto de Investigación de Ciencias e Ingeniería del Ateneo, y al Fondo de Investigación Sistemática LinnéSys: de la Sociedad Linneana de Londres y la Asociación de Sistemática por financiar este estudio.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
LO ANTES POSIBLE Explorador de Sparthttps://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap/asapweb.html
OrdenadorCualquier unidad de procesamiento
MEGA X MEGA Softwarehttps://www.megasoftware.net/
Servidor web mPTPhttps://mptp.h-its.org/#/tree
Servidor web PTPInstituto de Estudios Teóricos de Heidelberg (HITS)https://species.h-its.org/ptp/
Identificador de especie   https://taxondna.sourceforge.net/

Referencias

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