El protocolo describe un método para crear un modelo de organoide de cáncer colorrectal (CCR) derivado del paciente cocultivado con linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para estudiar sus interacciones y potencial terapéutico. Este modelo proporciona una plataforma preclínica para explorar las respuestas inmunitarias en el microambiente tumoral y predecir la eficacia de la terapia basada en TIL para el tratamiento personalizado del CCR.
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Artículo de método
Establecimiento de un sistema de cocultivo de organoides tumorales colorrectales derivados de pacientes y linfocitos infiltrantes de tumores (TIL)
En este artículo
Resumen
Resumen
El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en todo el mundo. Los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) se han identificado como un marcador pronóstico importante en el CCR. La aplicación terapéutica de los TILs ya ha mostrado resultados prometedores en el melanoma y el cáncer de cuello uterino. Sin embargo, su uso en el tratamiento del CCR se encuentra en una fase exploratoria. Actualmente no se dispone de un modelo in vitro adecuado para evaluar la eficacia de TIL, lo que dificulta nuevos avances en este campo. Los modelos de organoides derivados del paciente (PDO), que conservan estrechamente las características del tejido tumoral original y reflejan la heterogeneidad entre pacientes, proporcionan una plataforma excelente para estudiar la interacción entre el CCR y los TIL. En este estudio, se describe un método para establecer un modelo de organoide de CCR derivado del paciente a partir de tejido tumoral recién resecado, seguido del aislamiento y la expansión de los TIL. Este sistema permite el cocultivo de organoides de CCR y TIL, lo que permite evaluar la citotoxicidad mediada por TIL y las respuestas inmunitarias. Al analizar la eficacia de la eliminación de TIL en los organoides, se pueden predecir los posibles resultados de la inmunoterapia basada en TIL para el tratamiento personalizado del CCR. Además, la ingeniería adicional de los TIL puede mejorar su eficacia antitumoral, ofreciendo una estrategia prometedora para desarrollar terapias celulares más efectivas. Este modelo de cocultivo PDO-TIL proporciona una poderosa herramienta para la evaluación preclínica de las terapias TIL y las estrategias de tratamiento personalizadas en el CCR.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más prevalentes y letales a nivel mundial, lo que representa un importante desafío para la salud pública1. A pesar de los avances en las modalidades de tratamiento, como la cirugía, la quimioterapia y la inmunoterapia, el pronóstico de los pacientes con CCR, especialmente aquellos con enfermedad metastásica, sigue siendo malo. El microambiente tumoral (TME) desempeña un papel vital en la configuración de la progresión del cáncer y las respuestas al tratamiento, y los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) emergen como un componente clave que influye en la respuesta inmunitaria contra el cáncer2. Las TIL, una población diversa de células inmunitarias que se encuentran dentro de los tumores, se han identificado como marcadores pronósticos importantes en el CCR, con altos niveles de infiltración de TIL que a menudo se asocian con mejores resultados clínicos3. Estudios recientes también han puesto de manifiesto el potencial terapéutico de los TIL en otros tipos de cáncer, como el melanoma4 y el cáncer de cuello uterino5, donde la inmunoterapia basada en TIL ha demostrado una eficacia prometedora.
Sin embargo, a pesar del éxito de los TIL en algunos tipos de cáncer, su aplicación en el CCR sigue siendo un área de investigación en curso. La complejidad y heterogeneidad del CCR, junto con el microambiente tumoral inmunosupresor, presentan desafíos para una inmunoterapia eficaz basada en TIL6. Los tumores de CCR a menudo exhiben una EMT7 altamente inmunosupresora, caracterizada por la presencia de células T reguladoras (Tregs), células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) y macrófagos asociados a tumores (TAM), todas las cuales inhiben activamente la función de TIL. Además, las células del CCR expresan con frecuencia moléculas de puntos de control inmunitario, como PD-L1, que pueden dificultar aún más la muerte mediada por TIL8. Además, la heterogeneidad genética de los tumores de CCR, junto con un estroma inmunosupresor, complica la capacidad de los TIL para atacar y eliminar eficazmente las células tumorales, lo que dificulta el logro del mismo nivel de éxito observado en el melanoma y el cáncer de cuello uterino9. Una laguna crítica en la investigación actual es la falta de modelos in vitro adecuados que puedan simular con precisión las interacciones entre el CCR y los TIL. Estos modelos son esenciales para evaluar el potencial de los TIL en el tratamiento del CCR y optimizar su aplicación para estrategias de tratamiento personalizadas.
Los organoides derivados de pacientes (PDO, por sus siglas en inglés) se han convertido en una poderosa herramienta para modelar cánceres humanos10. Estos cultivos 3D, derivados de tejidos tumorales de pacientes, imitan de cerca las características histológicas y genéticas de los tumores originales, proporcionando una representación más precisa de la biología tumoral en comparación con las líneas celulares 2D tradicionales. Los modelos PDO también conservan la heterogeneidad entre pacientes, lo que los hace ideales para los abordajes de medicina personalizada11. En el CCR, las PDOs se han utilizado para el cribado de fármacos y el estudio de la biología tumoral12, pero su uso en la evaluación de las respuestas inmunitarias, especialmente en el contexto de las TIL, sigue siendo limitado. El diseño de un modelo de cocultivo de PDO-células inmunitarias debe equilibrar la complejidad del microambiente con la controlabilidad experimental. Aunque componentes como los macrófagos y las células dendríticas pueden mejorar la biomímesis, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se han convertido en la opción principal debido a su accesibilidad. Sin embargo, las PBMC tienen una baja proporción de células T específicas del tumor, y las subpoblaciones de monocitos pueden interferir con la estabilidad microambiental13. Por el contrario, los TIL enriquecen naturalmente a los clones reactivos al tumor y tienen un fenotipo de agotamiento in situ, lo que los convierte en un modelo superior para analizar con precisión los mecanismos de evasión inmunitaria en el cáncer colorrectal.
El objetivo de este estudio es desarrollar una nueva plataforma in vitro para evaluar las respuestas antitumorales mediadas por TIL en el CCR mediante el establecimiento de un sistema de cocultivo de PDOs y TILs del CCR. Este modelo permite la evaluación directa de la citotoxicidad de TIL frente a las PDOs del CCR y el análisis de las respuestas inmunitarias en el contexto específico del paciente. El uso de este sistema puede proporcionar información más profunda sobre el potencial de las inmunoterapias basadas en TIL para el CCR y respaldar la exploración de estrategias para mejorar la eficacia de TIL a través de enfoques de ingeniería. Los métodos anteriores estaban limitados por el pequeño número de TIL14. En la mayoría de los casos, las PBMC se cocultivaron primero con las PDOs durante dos semanas, después de lo cual las TILs específicas del tumor pudieron expandirse a partir de las PBMCs y luego se volvieron a cocultivar con las PDOs para observar los efectos citotóxicos15. Sin embargo, este enfoque también adolece de un tiempo de modelado prolongado y un bajo rendimiento general. Por el contrario, el método descrito permite el aislamiento y el establecimiento de PDOs y TILs a partir de muestras de tejido tumoral más pequeñas, que luego pueden ser directamente co-cultivadas. Este enfoque puede ofrecer una mayor comodidad tanto en términos de metodología como de eficiencia. En última instancia, este sistema tiene como objetivo proporcionar una herramienta poderosa para la evaluación preclínica de las terapias TIL, allanando el camino para estrategias de tratamiento personalizadas que pueden mejorar los resultados de los pacientes con CCR.
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Protocolo
Todos los experimentos con materiales derivados del ser humano se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fueron aprobados previamente por el Comité de Ética del Hospital de Zhongshan, afiliado a la Universidad de Dalian (números de aprobación: KY2023-206-1). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes que proporcionaron muestras clínicas para este estudio. Los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
Los criterios de inclusión incluyeron tejido de cáncer colorrectal primario confirmado patológicamente, un tamaño de muestra suficiente (≥1 cm3), sin antecedentes de tratamiento neoadyuvante (quimiorradiación o terapia dirigida) y consentimiento informado firmado. Los criterios de exclusión fueron la mala calidad de la muestra, con necrosis o fibrosis superior al 50%, la presencia de infección grave concurrente o enfermedad autoinmune, los antecedentes de otras neoplasias malignas y la negativa del paciente a participar.
1. Preparación de reactivos de cultivo celular
- Medio de cultivo para las DOP del CRC: Prepare el medio completo de las DOP del CRC de acuerdo con la composición descrita en la Tabla 1.
- Medio completo (CM) para TILs16: Complementar medio RPMI1640 con 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, HEPES, 2-mercaptoetanol y 3000 UI/mL de IL-2.
- Medio de expansión (EM): Complemente el medio RPMI1640 con 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, HEPES y 600 UI/mL de IL-2.
- AdDMEM++++: Complemente Advanced DMEM con 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de HEPES, 1% de glutamina y 5 mM Y-27632.
- Tampón de digestión CRC: Añadir 50 μL de colagenasa tipo IV y 10 μL de solución de penicilina-estreptomicina-anfotericina B a AdDMEM++++.
- Solución de lavado de tejidos: Agregue penicilina-estreptomicina al 2% al PBS.
2. Procesamiento de tejidos derivados del paciente
- Resecar el tejido tumoral primario del cáncer colorrectal (a ser realizado por cirujanos experimentados). Después de la recolección, divida el tejido en dos partes. Coloque una parte en AdDMEM++++ en una caja de hielo y transpórtela al laboratorio para la disociación y el cultivo de células tumorales. Colocar la otra parte en paraformaldehído al 4% para el análisis histopatológico17.
- Descongele Matrigel lentamente en un refrigerador a 4 °C. Precalentar el tampón de lisis globular a temperatura ambiente. Prepare tijeras de tejido, fórceps, medio AdDMEM++++ y tampón de digestión CRC.
- Transfiera el pañuelo a una placa de Petri y enjuague tres veces con 5 ml de PBS. Reemplácelo con un plato nuevo y enjuague tres veces con 5 ml de tampón de lavado de pañuelos para minimizar la contaminación.
- Picar el tejido con unas tijeras, transferirlo al tampón de digestión e incubar en un baño de agua a 37 °C durante 30 min hasta la disociación completa.
- Corta el tejido con unas tijeras de tejido y transfiérelo a la solución de digestión de tejidos. Digiera el tejido en un baño de agua a 37 °C y controle hasta que se complete la disociación del tejido.
- Agregue un volumen igual de AdDMEM++++ para neutralizar la digestión. Centrifugar a 380 × g durante 5 min a 25 °C.
- Deseche el sobrenadante con una pipeta. Observe el número de eritrocitos en el pellet. Añadir 1-3 mL de lisado de eritrocitos e incubar durante 10 min a 25 °C.
- Finalice la lisis con un volumen igual de AdDMEM++++. Centrifugar a 380 × g durante 5 min a aproximadamente 25 °C.
- Deseche el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender el pellet de celda en un volumen adecuado de AdDMEM++++.
- Cuantificar células viables mediante exclusión de azul de tripano para obtener una suspensión unicelular de tejido tumoral.
3. Establecimiento del modelo de DOP y cultura de los TIL
- Divida la suspensión unicelular del tejido tumoral en dos partes: use una para el establecimiento del modelo PDO y la otra para el cultivo de TILs.
- Después del recuento de células, mezcle 80.000 células por pocillo de la suspensión de células con Matrigel en una proporción de 1:1 para el establecimiento del modelo PDO.
- Vuelva a suspender la suspensión celular restante en CM en una placa de 24 pocillos a una concentración de 1 × 106 células/mL para el cultivo de TILs.
- Observar a diario. Tome fotografías para registrar el estado de las DOP y las TIL. Cambie el medio cada 2 días.
4. Purificación y expansión de TILs
- Cultive TILs durante 10-20 días antes de la purificación.
- Recoja los TIL en un tubo de centrífuga. Enjuague la placa de pocillos con medio fresco y recoja las células restantes de la placa de pocillos.
- Centrifugar a 125 × g durante 5 min a aproximadamente 25 °C.
- Deseche el sobrenadante con una pipeta. Lavar con 2 mL de PBS y volver a centrifugar a 125 × g durante 5 min a aproximadamente 25 °C.
- Realice el recuento de células.
- Utilice perlas magnéticas CD3+ para clasificar y aislar las células CD3+T18.
- Incubar el anticuerpo con la suspensión celular a 4 °C durante 10-15 min.
- Incubar las perlas magnéticas con la suspensión de anticuerpos-células a 4 °C durante 10-15 min.
- Coloque la columna de clasificación en el imán de clasificación. Agregue la suspensión de celdas a la columna y permita que solo las celdas positivas marcadas con perlas magnéticas se conserven en la columna de clasificación.
- Retire la columna de clasificación del campo magnético. Agregue una solución tampón para eluir las celdas positivas retenidas en la columna. Vuelva a suspender las células en 2 mL de PBS y centrifugar a 195 × g durante 5 min a aproximadamente 25 °C.
- Deseche el sobrenadante con una pipeta. Vuelva a suspender las células en una placa de 12 pocillos con medio EM fresco a una concentración de 1 × 106 células/mL. Añadir 5 μg/mL de anticuerpo CD3. Pase las células a nuevos matraces de cultivo cada 3 días.
5. Histología y caracterización IHQ de las PDOs
- Aspirar el medio de cultivo después de que los organoides hayan crecido hasta un tamaño de 50 μm.
- Fijar las esferas de organoides directamente en paraformaldehído al 4%. Aspirar los organoides, centrifugar a 195 × g durante 5 min a aproximadamente 25 °C, incrustar en agarosa al 2%, dejar curar y transferir a paraformaldehído al 4% para la fijación durante la noche.
- Al día siguiente, realice la deshidratación de gradiente. Prepare bloques de cera, corte secciones de 4 μm, rehidrate con un gradiente y realice tinciones inmunohistoquímicas con anticuerpos CK7, CK20, Ki-67 y CDX-2.
6. Caracterización de FI de TILs
- Purificar los TILs, cultivarlos hasta alcanzar un número adecuado y extraer una porción para su caracterización.
- Caracterice las celdas de suspensión utilizando el método de descamación. Ajuste la velocidad de rotación de la escamadora a 343 × g durante 4 minutos a aproximadamente 25 °C.
- Cuente y siembre las celdas en 1 × 104 por portaobjetos.
- Fije las células firmemente a los portaobjetos por centrifugación.
- Fije las celdas con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos y lave tres veces con PBS.
- Incubar con solución de bloqueo (PBS que contiene 2% de FBS) durante 1 h.
- Incubar con anticuerpos primarios (CD45, CD3, EpCAM) durante 1 h a temperatura ambiente. Lavar tres veces con PBS.
- Preparar e incubar con el anticuerpo secundario según la concentración recomendada por el fabricante durante 1 h a temperatura ambiente. Lavar tres veces con PBS.
NOTA: Preste atención a la homología de anticuerpos. - Incubar con DAPI durante 15 min a aproximadamente 25 °C.
- Observe las células teñidas bajo un microscopio de fluorescencia.
7. Sistema de cocultivo de DOP y TIL
- Agregue IFN-γ al medio organoide para mejorar la presentación del antígeno. Incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h15.
- Diluir el anticuerpo anti-CD28 con PBS. Cubra una placa de 96 pocillos añadiendo 50 μL de la solución de anticuerpos a cada pocillo. Sellar la placa con film sellador e incubar a 4 °C durante 24 h.
- Después de 24 h, disocie los organoides en células individuales usando TrypLE. Cuente las células y lávelas dos veces con PBS.
- Recoja los TIL emparejados, cuente las celdas y lávese dos veces con PBS.
- Inocular organoides a 1 × 104 células por pocillo e inocular TIL a 1 × 105 células por pocillo para lograr una relación efector-objetivo (E:T) de 10:1 para el cocultivo.
- Realizar cocultivo en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, 3000 U/mL de IL-2 y 20 μg/mL de anticuerpo bloqueante anti-PD-1. Incubar durante 3 días y capturar imágenes para observación y documentación.
NOTA: Configure organoides sin TIL como grupo de control.
8. Ensayo funcional de TILs por citometría de flujo
- Recoja las DOP y las TIL al final del período de cocultivo.
- Lave las células dos veces con PBS por centrifugación a 300 × g durante 5 min cada vez. Deseche el sobrenadante con una pipeta.
- Prepare el cóctel de anticuerpos que contiene CD3-FITC, CD4-APC/cianinina7, CD8-APC, CD107a-PE-cianinina7, CD279-PE y 7-AAD.
- Vuelva a suspender las células en 100 μL del cóctel de anticuerpos e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos, protegidas de la luz.
- Agregue 1 mL de PBS para lavar las células. Centrifugar a 300 × g durante 5 min y desechar el sobrenadante con una pipeta.
- Vuelva a suspender las células en 500 μL de PBS.
- Realizar análisis de citometría de flujo. Consulte la Figura complementaria 1 para obtener la estrategia de análisis detallada.
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Resultados
Establecimiento y caracterización de las DOP del CRC
Se obtuvieron muestras tumorales de pacientes con CCR. Se utilizó tejido tumoral de CCR recién resecado para establecer PDOs y TILs, que posteriormente se emplearon en experimentos de cocultivo de PDO-TIL (Figura 1).
Figura 1: Es...
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Discusión
En este estudio se utiliza tejido de CCR derivado de pacientes para obtener células tumorales y TIL, a partir de las cuales se establecen las PDO y se amplían las TIL. La interacción entre estos dos componentes se investiga a través de un sistema de co-cultivo.
En estudios previos, los TILs se extrajeron utilizando instrumentación compleja19 o directamente de suspensiones de tejido tumoral20. Sin embargo, estos m...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [82172822]; Programa de Apoyo a la Innovación de Talento de Alto Nivel de la Oficina de Ciencia y Tecnología de Dalian [2021RD02]; Plan Conjunto del Programa Provincial de Ciencia y Tecnología de Liaoning [2024JH2/102600067]; Proyecto de Cooperación Internacional en Ciencia y Tecnología de la provincia de Liaoning [2024JH2/101900006].
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM/F-12 avanzado | Gibco | 12634028 | |
| 2-Mercaptoetanol | sigma | 63689 | |
| 4% de paraformaldehído | BBI | E672002-0100 | |
| 7-AAD | Bioleyenda | 420403 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Suplemento B27 | Gibco | 17504-44 | |
| CD107a-PE-cianina7 | Bioleyenda | 328618 | |
| CD279-PE | Bioleyenda | 329906 | |
| Anticuerpo monoclonal CD3 (OKT3) | Invitrogen | 14-0037-82 | |
| CD3-FITC | Bioleyenda | 300406 | |
| CD45 (dominio intracelular) (D9M8I) | CST | 13917S | |
| CD4-APC/cianina7 | Bioleyenda | 300518 | |
| CD8-APC | Bioleyenda | 344722 | |
| CDX-2 | MXB | RMA-0631 | |
| CK20 | MXB | Kit-0025 | |
| CK7 | MXB | Kit-0021 | |
| Dylight 488, IgG anti-conejo de cabra | Abbkine | A23220 | |
| Dylight 549, IgG anti-ratón de cabra | Abbkine | A23310 | |
| FEAG | Peprotech | AF-100-15 | |
| EpCAM | CST | 36746T | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Cellmax | SA211.02 | |
| FGF 10 | Peprotech | 100-26 | |
| Gastrin (Humano) | Tocris | 3006 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050-061 | |
| Hepes | Sigma | H4034 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Kit de separación de células CD3+ humanas (RUO) | RWD | K1201-10 | |
| Proteína recombinante IFN-gamma humana | PeproTech | 300-02-20UG | |
| Ki-67 | CST | 9449s | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| N-acetilcisteína | Sigma | Referencia A9165 | |
| Nicotinamida | Sigma | N0636 | |
| Nivolumab (anti-PD-1) | Vendedor | A2002 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Sigma | V900929 | |
| penicilina-estreptomicina | NCM Biotech | C100C5 | |
| Primocina | Invivogen | Hormiga-pm-1 | |
| Tampón de lisis de glóbulos rojos | termo-invitrogen | 00-4300-54 | |
| IL-2 humana recombinante (sin portador) | Bioleyenda | 589104 | |
| RPMI 1640 | Gibco | ||
| SB202190 | Vendedor | S1077 | |
| Tinción azul de tripano 0,4% | termo-invitrogen | T10282 | |
| Ultra-LEAF Anticuerpo CD28 antihumano purificado | Bioleyenda | 302934 | |
| Anticuerpo CD3 antihumano purificado Ultra-LEAF | Bioleyenda | 317325 | |
| Y-27632 | Vendedor | S1049 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
