Artículo de método

Análisis 3D simultáneo del daño cardíaco y la respuesta inmune en el infarto agudo de miocardio reperfundido mediante microscopía de fluorescencia de hoja de luz

DOI:

10.3791/68347

⸱

26 de septiembre de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Vascular Medicine, West German Heart and Vascular Center, University Hospital Essen, 2Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG, 3Institute for Experimental Immunology and Imaging, University Hospital, University Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La reconstrucción tridimensional (3D) del daño cardíaco en el infarto agudo de miocardio reperfundido (repAMI) permite la cuantificación fiel y la colocalización de los patrones asociados que afectan a la enfermedad. Aquí, se proporciona un enfoque de imágenes automatizado guiado por hojas de luz para la medición contemporánea del daño cardíaco, el área en riesgo y la respuesta de las células inmunitarias.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las interacciones celulares complejas determinan la remodelación funcional y estructural del tejido durante el infarto agudo de miocardio reperfundido (repAMI). Estos procesos muestran una distribución espacial distinta a medida que el músculo cardíaco lesionado se segmenta en diferentes áreas (área dañada, área en riesgo (AAR) y área remota). La visualización tridimensional (3D) de estas áreas es esencial para el análisis de diversas interacciones entre las células cardíacas residentes y las células inmunitarias infiltrantes, lo que permite identificar posibles objetivos de tratamiento. Aquí, se describe un protocolo para la visualización y cuantificación 3D simultánea y automatizable del área de daño cardíaco, AAR y células inmunitarias infiltrantes (por ejemplo, neutrófilos) después de repAMI. Esto incluye la tinción mediada por anticuerpos intravitales del área de daño cardíaco (CD31neg) y la infiltración de neutrófilos (Ly6G+) después de la visualización ex vivo de AAR mediante perfusión de anticuerpos retrógrados y una mayor limpieza de tejido no tóxico para imágenes de microscopía de fluorescencia de hoja de luz (LSFM). Esta técnica permite el análisis espacial de las células diana, por ejemplo, la infiltración de células inmunitarias y las áreas dañadas en un corazón de ratón intacto después de repAMI. La histología tradicional y la inmunohistoquímica se pueden realizar después de la limpieza de tejidos no tóxicos y la adquisición de imágenes con posprocesamiento asistido por computadora. Esto permite la multiplexación de la ganancia de información dentro del mismo corazón del ratón, fortaleciendo la robustez de los datos y siendo especialmente significativo en una lesión altamente compleja como repAMI.

Introducción

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La lesión tisular en el infarto agudo de miocardio reperfundido (IAMrep) es el principal factor impulsor de la remodelación cardíaca y el desarrollo de insuficiencia cardíaca1. Múltiples mediadores locales y células cardíacas residentes, pero también células inmunes infiltrantes, afectan su expansión en una interacción compleja 2,3. Comprender la organización espacial de estos procesos es esencial para obtener un conocimiento profundo para la identificación de nuevos objetivos terapéuticos para limitar la lesión tisular después de un IAM rep y mejorar la función cardíaca.

Dado que el músculo cardíaco en sí consta de diferentes tipos de células, el análisis detallado del daño cardíaco es un desafío, ya que cada tipo de célula muestra su propia capacidad de resistencia específica durante la isquemia y la lesión por reperfusión 4,5. Un sello distintivo importante en el contexto del infarto de miocardio es una pérdida importante de vasculatura acompañada de deterioro de la función de las células endoteliales6. El marcador más establecido utilizado para la representación de la estructura vascular y el análisis de la disfunción endotelial en ratones y humanos es CD31 (también conocido como PECAM-1), una molécula de adhesión expresada en la superficie de las células endoteliales7. En diferentes modelos de isquemia/reperfusión, la pérdida de CD31 demostró ser un buen marcador sustituto para la distinción del daño tisular endotelial 8,9,10. Además, se distinguen tres compartimentos principales de lesiones en todo el corazón durante la repetición. El tejido cardíaco no afectado por la lesión por isquemia/reperfusión (I/R) representa el área remota. El miocardio aguas abajo de la oclusión de un vaso se define como un área de riesgo (AAR)11,12. Después del inicio de la reperfusión, se puede diferenciar un área distinta de tejido cardíaco dentro del AAR, que fue dañada por isquemia previa (área de daño)13. La evaluación convencional de la lesión cardíaca I / R en ratones utiliza cloruro de trifenil tetrazolio (TTC) en secciones gruesas en serie que muestran una disminución de la actividad metabólica de las células cardíacas dañadas13,14. Simultáneamente, se puede agregar tinción azul de Evan ex vivo para la determinación de AAR15. Sin embargo, estos métodos establecidos tienen varias limitaciones, incluida la posibilidad reducida de evaluación conjunta de la infiltración de células inmunitarias, la distinción de lesiones específicas del tipo de célula y la reconstrucción precisa de tejidos en 3D.

La microscopía de fluorescencia de hoja de luz (LSFM) permite la posibilidad de visualizar órganos de ratón enteros intactos y despejados con resolución de señal de fluorescencia hasta el nivel celular. Recientemente, se introdujo un método mejorado de limpieza de tejidos no tóxico utilizando cinamato de etilo (ECi) para la visualización en 3D de corazones de ratón intactos8. Para abordar las limitaciones de la tinción con azul de TTC/Evan, se utilizó la tinción de fluorescencia CD31 basada en anticuerpos intravitales, que reveló una lesión endotelial cardíaca como áreas sin tinción de CD31 (CD31 neg) durante el infarto de miocardio8. La administración adicional de inyección aórtica retrógrada ex vivo con un anticuerpo anti-CD31 conjugado con fluoróforo con otro espectro de fluorescencia como para la tinción intravital explica la representación 3D contemporánea de AAR. Además, este método se puede ampliar agregando tinción de neutrófilos, lo que permite el análisis de distribución celular separados por área remota, AAR y volumen de lesión endotelial cardíaca para mejorar la comprensión de la función de los neutrófilos durante el repAMI.

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Protocolo

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Todos los procedimientos de experimentación con animales fueron aprobados por la agencia gubernamental local responsable (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) y cumplieron con todas las normas éticas pertinentes para la experimentación e investigación con animales. Los experimentos se realizaron con ratones machos C57BL / 6J (9-30 semanas de edad). Los animales fueron alojados y utilizados en condiciones específicas libres de patógenos (SPF) en el establo local en el ciclo diurno y nocturno de 12 h/12 h.

NOTA: Todas las intervenciones quirúrgicas se realizaron bajo inducción intraperitoneal de anestesia con ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) con mantenimiento con isoflurano (1,5 % en volumen). Para disminuir el sufrimiento de los animales, todos los animales recibieron inyecciones subcutáneas de 0,1 mg/kg de buprenorfina antes y después de la anestesia durante el día en combinación con buprenorfina que contenía agua potable durante la noche. El protocolo quirúrgico para la inducción de un IAM de repetición se ha descrito previamente en otros lugares16,17. Antes de comenzar con la inyección intravital de anticuerpos, prepare dos placas de Petri de 6 cm que se utilizan para la inyección de anticuerpos retrógrados ex vivo en los pasos posteriores que se describen a continuación. Se necesita una placa de Petri poco profunda con PBS en hielo para la eliminación cruda del exceso de tejido circundante del corazón (se recomienda usar trozos de gasa cortados a medida dentro de la placa para facilitar el proceso de manipulación posterior). Se necesita otro plato para la canulación aórtica con una aguja de cánula de acero romo de 20 G sumergida en PBS sobre hielo con un nudo suelto de sutura 5-0 sobre la muesca de la cánula. Evite o elimine las burbujas de aire dentro de la cánula, ya que pueden bloquear los vasos coronarios e impedir la perfusión total.

1. Inyección de anticuerpos intravitales

  1. Anestesiar al ratón con ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg).
  2. Inyecte 10 μg de anticuerpos anti-CD31 de ratón marcados directamente (clon: MEC13.3; fluoróforo: AlexaFluor 790) y anti-Ly6G de ratón (clon: 1A8; fluoróforo: AlexaFluor 647) en PBS con un volumen total de 5 μL por g de peso corporal (100 μL para un ratón de 20 g) mediante inyección intravenosa en la vena de la cola.
    NOTA: Esta inyección de anticuerpos etiquetará todo el endotelio dentro del corazón y está destinada a cuantificar el tamaño de la lesión por reIAM.
  3. Deje que los anticuerpos inyectados circulen durante 10 minutos antes de continuar con el procedimiento.

2. Recolección de corazones

NOTA: Las secciones 2 y 3 son críticas en el tiempo y deben completarse en menos de 6 minutos.

  1. Sacrificar al animal por luxación cervical 10 min después de la inyección de anticuerpos. Controlar la muerte evaluando los reflejos.
    NOTA: Si se necesitan muestras de sangre, tómelas antes de continuar con el siguiente paso.
  2. Coloque el mouse debajo de un microscopio estereoscópico.
  3. Abra la cavidad torácica y haga una incisión en la vena cava superior expuesta cerca de la salida del vaso desde la caja torácica hasta el cuello.
    NOTA: Mantenga la aorta intacta, ya que es necesaria para la inyección de anticuerpos retrógrados ex vivo .
  4. Perfunda corazones in situ a través de la aurícula auricular derecha e izquierda con PBS que contenga heparina (20 IE / ml) usando una aguja de 27 G con una bomba de rodillo (70 μl / s) durante un total de 3 minutos. La extracción suficiente de sangre cardíaca se nota por el desvanecimiento de la extracción vascular superficial del corazón y el blanqueamiento del pulmón y el hígado.
    NOTA: Evite la perfusión cardíaca a través del ventrículo derecho o izquierdo, ya que puede causar artefactos de imagen durante la microscopía de fluorescencia de hoja de luz.
  5. Extirpar el corazón y al menos 5 mm de la aorta restante junto con el tejido pulmonar circundante.
    NOTA: No sujete el músculo cardíaco directamente durante la escisión para evitar daños tisulares y artefactos de imagen durante la microscopía de fluorescencia de hoja de luz.

3. Inyección de anticuerpos retrógrados ex vivo

  1. Transfiera el corazón a una placa de Petri de 6 cm con PBS helado y gasa preparada anteriormente.
  2. Corte el resto del tejido pulmonar, graso y vascular circundante hasta que solo quede el corazón con aproximadamente 5 mm de aorta.
  3. Transfiera el corazón al plato preparado para la canulación aórtica.
  4. Tire de la aorta restante sobre la cánula de acero romo de 20 G y átela con la sutura 50 del nudo previo a la muesca de la cánula.
    NOTA: La punta de la cánula debe empujarse cerca de la válvula aórtica para garantizar que no haya fugas de líquido de perfusión.
  5. Vuelva a ligar la arteria descendente anterior izquierda (LAD) de forma permanente con una sutura 6-0 en el lugar exacto utilizado para la inducción de repAMI anteriormente.
  6. Inyecte 400 μL de PBS que contenga 20 μg de anticuerpo anti-CD31 de ratón (clon: MEC13.3), marcado con AlexaFluor 546, retrógradamente a través de la cánula insertada.
    NOTA: Cierre la unión entre la jeringa de inyección y la cánula insertada con una película de sellado para asegurar la perfusión completa de anticuerpos a través de las arterias coronarias. Esta inyección de anticuerpos solo tiñe el endotelio fuera del AAR y, por lo tanto, se puede utilizar para la cuantificación de AAR.
  7. Saque la cánula insertada de la aorta.
  8. Transfiera el corazón a un tubo de reacción de polipropileno de 15 ml que contenga 10 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% e incube sin agitación durante la noche a 4 ° C en la oscuridad.

4. Procesamiento y limpieza de muestras

  1. Lave el corazón fijado en tres cambios de 5 ml de PBS durante 10 min cada uno a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad, siempre agitando con rotación casi superior en tubos de reacción de polipropileno de 5 ml.
  2. Deshidrate el corazón fijado en series ascendentes de etanol de 5 ml al 50%, 70% y 100% en agua desionizada, cada uno durante al menos 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad, siempre agitando con rotación casi superior en tubos de reacción de polipropileno de 5 ml.
    NOTA: La incubación en etanol al 50% y al 70% puede prolongarse hasta el día siguiente, mientras que la incubación en etanol al 100% puede prolongarse hasta 3 días.
  3. Blanquear el corazón deshidratado en tubos de reacción de polipropileno de 15 ml que contengan 10 ml de etanol al 100% con DMSO al 5% y al 5% de H2O2 sin agitar durante 4 h a 4 °C en la oscuridad.
    NOTA: Es posible que se esté acumulando presión dentro del tubo durante el proceso de blanqueo; Tenga cuidado al abrir el tubo después.
  4. Lave el corazón blanqueado en 5 ml de etanol al 100% tres veces durante 12 h cada una a temperatura ambiente en la oscuridad, siempre agitando con rotación casi superior en tubos de reacción de polipropileno de 5 ml.
    NOTA: Cada paso de incubación puede prolongarse hasta 3 días.
  5. Transfiera el corazón a un tubo de reacción de polipropileno de 5 ml que contenga 4 ml de cinnemato de etilo (ECi) para la limpieza del tejido e incube sin agitación durante 3 días a temperatura ambiente en la oscuridad.
    NOTA: El corazón despejado puede permanecer en ECi durante al menos 3 meses sin una disminución en la intensidad de la fluorescencia bajo el almacenamiento correcto en la oscuridad en RT. No almacene ECi ni muestras almacenadas en ECi por debajo de 6 °C, ya que ECi se congela a esta temperatura, dañando la muestra en el proceso.

5. Preparación de bloques de goma gellan

  1. Mezclar 1 g de goma gellan en polvo en 100 ml de agua del grifo caliente (50-60 °C).
  2. Deje mezclar hasta que se resuelva por completo con un agitador magnético.
    NOTA: Si el polvo no se disuelve correctamente, caliente la solución hasta que hierva en un microondas.
  3. Filtrar la solución de goma gellan a través de un colador celular de 100 μm.
  4. Coloque la solución filtrada en una placa de Petri de 10 cm poco profunda.
  5. Deje enfriar hasta que el gel se endurezca.
  6. Cortar el gel en bloques de 15 mm 15 mm 5 mm.
  7. Deshidrate los bloques en 50 mL de serie de etanol ascendente al 50% y 70% en agua desionizada, cada uno durante al menos 2 h a RT siempre agitando con rotación casi por encima de la cabeza en un tubo de reacción de polipropileno de 50 mL.
    NOTA: Llene el tubo de reacción con etanol después de agregar bloques de gel. Solo llene el tubo de reacción hasta la mitad con bloques de gel.
  8. Incubar bloques deshidratados en 50 mL de etanol al 100% tres veces durante 12 h cada uno a RT siempre agitando con rotación casi por encima de la cabeza en un tubo de reacción de polipropileno de 50 mL.
    NOTA: Llene el tubo de reacción con etanol después de agregar bloques de gel. Solo llene el tubo de reacción hasta la mitad con bloques de gel. Los bloques de gel pueden permanecer en el último tubo de reacción con etanol al 100% durante períodos prolongados hasta que se eliminen en ECi.
  9. Transfiera los bloques a un tubo de reacción de polipropileno de 50 ml que contenga 25 ml de ECi e incube sin agitación durante 3 días a temperatura ambiente.
    NOTA: Coloque solo unos pocos bloques en un tubo de reacción con ECi para evitar borrar artefactos. Los bloques borrados pueden permanecer en ECi durante al menos 6 meses y almacenarse en RT.

6. Imágenes

  1. Corte los bloques de goma gellan aclarados al tamaño necesario para estabilizar el corazón despejado en el soporte de muestras del microscopio.
    NOTA: Los bloques de goma gellan se pueden reutilizar varias veces.
  2. Detecte señales de fluorescencia de interés (autofluorescencia, tinción AAR [anticuerpo anti-CD31 marcado con AlexaFluor 546], anticuerpo anti-Ly6G acoplado a AlexaFluor647 y tinciónnegativa CD31 [anticuerpo anti-CD31 marcado con AlexaFluor 790]) con la configuración adecuada de excitación y filtro de emisión. Para la adquisición, utilice una lente de objetivo de 0,1 NA con una distancia de trabajo de 17,6 mm.
    NOTA: Detecte señales con un láser de luz blanca (200 mW; 480-2400 nm). Para la detección de autofluorescencia derivada del tejido conectivo, use un filtro de excitación de paso de banda de 470/30 nm y un filtro de emisión de paso de banda de 525/50 nm; La tinción de CD31 con un anticuerpo acoplado a AlexaFluor 546 se detecta con un filtro de excitación de paso de banda de 520/40 nm y un filtro de emisión de paso de banda de 585/40 nm; La tinción de Ly6G con un anticuerpo acoplado a AlexaFluor 647 se detecta con un filtro de excitación de paso de banda de 630/30 nm y un filtro de emisión de paso de banda de 680/30 nm; La tinción de CD31 con un anticuerpo acoplado a AlexaFluor 790 se detecta con un filtro de excitación de paso de banda de 740/40 nm y un filtro de emisión de paso de banda de 824/55 nm. Los tiempos de iluminación y el porcentaje de atenuación del láser deben ajustarse de acuerdo con la calidad de la señal.
  3. Elija la siguiente configuración para las imágenes de microscopía de hoja de luz:
    1. Elija una hoja NA de 0,079, lo que da como resultado un espesor de hoja ligero de 5 μm.
    2. Elija 10 μm como distancia entre dos planos z individuales.
      NOTA: Esto da como resultado un submuestreo y la consiguiente pérdida de precisión para el rastreo y las mediciones de volumen. Para evitar esto, una distancia entre dos planos z individuales debe ser igual a la mitad del grosor de la hoja ligera, por lo que en este caso, 2,5 μm. Este estudio optó por submuestrear los datos, ya que los beneficios obtenidos por la reducción del tiempo de imágenes y el tamaño de la pila de datos superan la pérdida mínima de precisión del análisis.
    3. Utilice un ancho de hoja del 100% para obtener una iluminación homogénea de la muestra.

7. Post-procesamiento de imágenes

NOTA: Los datos de imágenes digitales adquiridos se procesaron posteriormente utilizando un software científico de procesamiento y análisis de imágenes en 3D que figura en la Tabla de materiales.

  1. Inicie el software Imaris file converter 10.1 y cargue el conjunto de datos sin procesar en el software arrastrando y soltando la carpeta con los archivos de imagen en la ventana del convertidor de archivos Imaris o haciendo clic en Examinar y navegando a la carpeta con los archivos de imagen.
  2. Seleccione la carpeta de salida a través de Seleccionar carpeta.
  3. Haga clic en Iniciar todo y espere a que los archivos se conviertan en archivos .ims Imaris.
  4. Inicie el software y seleccione Superar en la esquina superior izquierda.
  5. Abra pilas de imágenes seleccionando Abrir y seleccione el archivo de datos .ims correspondiente.
  6. Para crear una superficie generada automáticamente de todo el corazón, seleccione Vista 3D y Superficies.
  7. ElijaSeleccionar solo una región de interés, Procesar finalmente toda la imagen y Estadísticas de objeto-objeto mientras desactiva Clasificar superficies en la sección Configuración del algoritmo .
    NOTA: La activación de las estadísticas objeto-objeto permite el cálculo de superposición de diferentes superficies y funciones de tintas planas.
  8. Haga clic en el botón de flecha azul en la esquina inferior derecha de la hoja Crear para continuar con los siguientes pasos.
  9. Determine la región tridimensional de interés utilizando los manipuladores que aparecen dentro de la vista de imagen.
  10. Continúe con el siguiente paso eligiendo el canal de origen (canal de autofluorescencia).
  11. Active Suavizar y elija el ajuste predeterminado de 11,8 μm.
  12. Continúe con el siguiente paso y determine el umbral necesario para crear una superficie tridimensional ópticamente satisfactoria que aparezca dentro de la vista de imagen.
  13. En el último paso, ajuste el filtro de superficie, eligiendo Número de vóxeles como tipo de filtro y determinando 10 como umbral.
  14. Cree una superficie haciendo clic en el botón de flecha verde en la esquina inferior derecha de la sección Crear . Utilizando la hoja de color , cambie el material y el color de la superficie creada según sea necesario.
  15. Genere dos superficies adicionales creadas manualmente para AAR (volumennegativo CD31 en el canal AlexaFluor 546) y volumen de lesión endotelial cardíaca (volumennegativo CD31 en el canal AlexaFluor 790) eligiendo Vista 3D y Superficies una vez más.
  16. Elija Segmentar solo una región de interés, Procesar finalmente toda la imagen y Estadísticas de objeto-objeto mientras desactiva Clasificar superficies en la sección Configuración del algoritmo y haga clic en Omitir creación automática, editar manualmente.
  17. Dentro de la hoja de la placa , seleccione XY para orientación, Ninguno para visibilidad y ajuste manualmente el controlador de resolución al máximo.
  18. Vaya a la hoja Modelo, haga clic en el icono Distancia y establezca el espaciado de vértices en 100 μm.
  19. Habilite Dibujar y rodear áreasnegativas CD31 en el canal AlexaFluor 546 o en el canal AlexaFluor 790 cada 10 cortes de imagen.
  20. Después de terminar de rodear todas las áreas correspondientes, elija Autoajuste y Realizar Autoajuste.
  21. Haga clic en Crear superficie y ajuste el material y el color de las superficies generadas en la hoja Color .
  22. Para mostrar neutrófilos como manchas Ly6G+ , genere una función de tinta plana seleccionando Vista 3D y Manchas.
  23. Seleccione Segmentar solo una región de interés, Procesar finalmente toda la imagen y Estadísticas objeto-objeto mientras desactiva Clasificar manchas en la sección Configuración del algoritmo .
  24. Continúe con los siguientes pasos usando el botón de flecha azul en la esquina inferior derecha de la hoja Crear .
  25. Determine la región tridimensional de interés utilizando los manipuladores que aparecen dentro de la vista de imagen como se mencionó anteriormente.
  26. Continúe con el siguiente paso utilizando el canal de origen (canal AlexaFluor 647).
  27. Establezca el diámetro XY estimado en 10 μm, habilite el alargamiento del modelo PSF a lo largo del eje Z y establezca el diámetro Z estimado en 20 μm.
  28. Deshabilite la sustracción en segundo plano.
  29. Continúe con el siguiente paso, seleccione Intensidad mínima como filtro y establezca un umbral apropiado.
    NOTA: Para estimar el nivel de umbral, haga clic en Slice en el área superior de la ventana del programa y seleccione el canal AlexaFluor 647. Mueva el cursor sobre diferentes puntos en el segmento de la imagen sin procesar que representan una tinción positiva de Ly6G y lea el valor de intensidad en la esquina inferior izquierda de la ventana del programa.
  30. Genere tintas planas haciendo clic en el botón de flecha verde situado en la esquina inferior derecha de la hoja Crear .
  31. Establezca la Escala de radio en 3,0 en la sección Estilo/Calidad de puntos de la hoja Crear .
  32. Llegué a la hoja de color para ajustar el color directo como se desea.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El enfoque presentado utilizando microscopía de fluorescencia de hoja de luz (LSFM) permite el análisis simultáneo de AAR, lesión endotelial e infiltración de neutrófilos después de repAMI. La Figura 1A ilustra la tinción de anticuerpos intravital y ex vivo de ratones C57BL / 6J 24 h después de la inducción de repAMI. Los anticuerpos para la tinción de la lesión endotelial cardíaca (anti-CD31 marcado con AlexaFluor 790) y la infiltración de neutrófilos (anti-Ly6G marcado con AlexaFl...

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Discusión

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Existen varias entidades de imagen para detectar lesiones del tejido cardíaco durante el infarto de miocardio en ratones. Estas técnicas brindan diferentes ventajas, pero también tienen limitaciones. La tinción de la disminución de la actividad metabólica de las células cardíacas mediante TTC es el método más utilizado para la cuantificación de la lesión cardíaca I/R y se puede combinar con la tinción azul de Evan para la distinción de AAR 13,14,15.

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elias Haj-Yehia informa de honorarios personales y otros de AstraZeneca, que están fuera del trabajo presentado. Simon F. Merz y Lea Bornemann trabajan actualmente en Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG. Matthias Totzeck y Tienush Rassaf informan sobre los honorarios personales, y otros de Edwards and Novartis, Bristol Myers Squibb, Bayer, Daiichi Sankyo y Astra Zeneca, que están fuera del trabajo presentado. Tienush Rassaf y Ulrike B. Hendgen-Cotta cofundaron Bimyo, una empresa centrada en el desarrollo de péptidos cardioprotectores. Matthias Gunzer recibió financiación de investigación general de Miltenyi BioTec B.V. & Co. KG. Todos los demás autores declaran no tener conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores reconocen las siguientes fuentes de financiación: Fundación Alemana de Investigación (UMEA Clinician Scientist, FU 356/12-2, Elias Haj-Yehia; HE6317/2-1, Ulrike Hendgen-Cotta, RA969/12-1, Tienush Rassaf) y Sociedad Alemana del Corazón (DGK, Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V., DGK02/2022, Elias Haj-Yehia). Parte de este trabajo se realizó en el Centro de Imágenes de Essen (IMCES), una instalación central de servicios de la Facultad de Medicina de la Universidad de Duisburg-Essen, Alemania. Agradecemos al personal del IMCES por su continuo apoyo técnico y el uso de sus instrumentos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aguja de 27 GBecton Dickinson305889BD Eclipse
Procesamiento de imágenes 3D y Software de análisisPlano de bitsVers. 10.1.0Imaris
Sutura 5-0Serag-WiessnerIC108000Seda
Sutura 6-0EthiconEH7814Prolene
Kit de etiquetado de anticuerpos AlexaFluor 546InvitrogenA20183
Kit de etiquetado de anticuerpos AlexaFluor 790InvitrogenA20189
Anticuerpo anti-ratón Ly6G (AlexaFluor 647)Bioleyenda127610Clon: 1A8
Filtro celular (100 µ m)Corning431752
Dimetilsulfóxido (DMSO)Carl Roth7029.1
EtanolCarl Roth0911.4
Cinnemato de etilo (ECi)Sigma-Aldrich112372
Software de conversión de archivosPlano de bitsVers. 10.1.0Imaris
GasaFuhrmann10021
Goma gellan en polvoSigma-AldrichP8169Phytagel
Heparina (25.000 IE/5 mL)LEO Pharma15261203
Peróxido de hidrógeno (H2O2, 30%)Carl Roth8070.2
Jeringa inyectableB Braun9161502SOmnican F
Ketamina (100 mg/ml)Bela-Pharma402581.00.00
Sistema de microscopio de hoja de luzMiltenyi Biotec-UltraMicroscope Blaze
Jeringa Luer lockBecton Dickinson303172BD Plastipak
Agitador magnéticoVWR444-0572
Cámara Neo sCMOS (4,2 MP)Tecnología AndorZL41 Celda 4.2
ObjetivoMiltenyi Biotec130-133-625MI Plan 1.1x NA 0.1, WD 17.6 mm
Paraformaldehído (PFA, 4%)Sigma-Aldrich1.0049610% de formalina, tamponado neutro
Placa de PetriGreiner Bio-One632181
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Gibco14190-094Sin MgCl2/CaCl2
Tubo de polipropileno (15 ml)Greiner Bio-One188261
Tubo de polipropileno (5 ml)Carl RothEKY9.1Negro
Tubo de polipropileno (50 ml)Greiner Bio-One227261
Plato de preparación para canulación de corazón de ratónHugo Sachs Elektronik73-4327Cánula incluida
Anticuerpo CD31 anti-ratón purificadoBecton Dickinson53369Clon: MEC13.3
Bomba de rodillosIsmatecISM597-230
Película de selladoBemisTeléfono: PM-996Parafilm
Microscopio estereoscópicoLeicaS6D
Rotador de tubosHeidolfoPolymax 1040
Láser de luz blancaFotónica NKTSuperK extremo200 mW, 480– 2400 nm
WT cepa de ratónLaboratorios Janvier-C57BL/6JRj
Xilacina (2%)Ceva Tiergesundheit6324464.00.00

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).
  2. Frangogiannis, N. G. Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration. Curr Opin Cardiol. 30 (3), 240-245 (2015).
  3. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The biological basis for cardiac repair after myocardial infarction: from inflammation to fibrosis. Circ Res. 119 (1), 91-112 (2016).
  4. Koch, A., et al. Capillary endothelia and cardiomyocytes differ in vulnerability to ischemia/reperfusion during clinical heart transplantation. Eur J Cardiothorac Surg. 20 (5), 996-1001 (2001).
  5. Singhal, A. K., Symons, J. D., Boudina, S., Jaishy, B., Shiu, Y. T. Role of endothelial cells in myocardial ischemia-reperfusion injury. Vasc Dis Prev. 7, 1-14 (2010).
  6. Robbers, L. F., et al. Magnetic resonance imaging-defined areas of microvascular obstruction after acute myocardial infarction represent microvascular destruction and haemorrhage. Eur Heart J. 34 (30), 2346-2353 (2013).
  7. DeLisser, H. M., Newman, P. J., Albelda, S. M. Molecular and functional aspects of PECAM-1/CD31. Immunol Today. 15 (10), 490-495 (1994).
  8. Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10 (1), 2312(2019).
  9. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507(2019).
  10. Zhong, X., et al. Tubular epithelial cells-derived small extracellular vesicle-VEGF-A promotes peritubular capillary repair in ischemic kidney injury. NPJ Regen Med. 7 (1), 73(2022).
  11. Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17 (4), 268-272 (2012).
  12. Arai, A. E. Magnetic resonance imaging for area at risk, myocardial infarction, and myocardial salvage. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16 (3-4), 313-320 (2011).
  13. Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Res Cardiol. 113 (5), 39(2018).
  14. Rassaf, T., et al. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circ Res. 114 (10), 1601-1610 (2014).
  15. Haj-Yehia, E., et al. CD47 blockade enhances phagocytosis of cardiac cell debris by neutrophils. IJC Heart Vasculature. 48, 101269(2023).
  16. Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., French, B. A., Rassaf, T. A practical approach to remote ischemic preconditioning and ischemic preconditioning against myocardial ischemia/reperfusion injury. J Biol Methods. 3 (4), e57(2016).
  17. Michel, L., et al. Real-time pressure-volume analysis of acute myocardial infarction in mice. J Vis Exp. (137), e57621(2018).
  18. Ojha, N., et al. Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2435-H2443 (2008).
  19. Clasen, L., et al. Cardiac ischemia and reperfusion in mice: a comprehensive hemodynamic, electrocardiographic and electrophysiological characterization. Sci Rep. 13 (1), 5693(2023).
  20. Lang, C. I., et al. Expedient assessment of post-infarct remodeling by native cardiac magnetic resonance imaging in mice. Sci Rep. 11 (1), 11625(2021).
  21. Coolen, B. F., et al. Three-dimensional T1 mapping of the mouse heart using variable flip angle steady-state MR imaging. NMR Biomed. 24 (2), 154-162 (2011).
  22. Zhong, X., et al. Comprehensive cardiovascular magnetic resonance of myocardial mechanics in mice using three-dimensional cine DENSE. J Cardiovasc Magn Reson. 13 (1), 83(2011).
  23. Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
  24. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  25. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nat Commun. 10 (1), 1944(2019).
  26. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative visualization of leukocyte infiltrate in a murine model of fulminant myocarditis by light sheet microscopy. J Vis Exp. (123), e55450(2017).
  27. Taki, J., et al. 14C-Methionine uptake as a potential marker of inflammatory processes after myocardial ischemia and reperfusion. J Nucl Med. 54 (3), 431-436 (2013).
  28. Michel, L., et al. PD1 deficiency modifies cardiac immunity during baseline conditions and in reperfused acute myocardial infarction. Int J Mol Sci. 23 (14), 7533(2022).
  29. Park, K. C., Gaze, D. C., Collinson, P. O., Marber, M. S. Cardiac troponins: from myocardial infarction to chronic disease. Cardiovasc Res. 113 (14), 1708-1718 (2017).
  30. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Curr Protoc Neurosci. 81 (2), 28.21-28.28 (2017).
  31. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using light sheet microscopy. J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).
  32. Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nat Protoc. 16 (6), 2732-2748 (2021).
  33. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  34. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  35. Merz, S. F., et al. High-resolution three-dimensional imaging for precise staging in melanoma. Eur J Cancer. 159, 182-193 (2021).
  36. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Front Immunol. 11, 599495(2020).
  37. Pichardo, A. H., et al. Optical tissue clearing to study the intra-pulmonary biodistribution of intravenously delivered mesenchymal stromal cells and their interactions with host lung cells. Int J Mol Sci. 23 (22), 14171(2022).

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