La reconstrucción tridimensional (3D) del daño cardíaco en el infarto agudo de miocardio reperfundido (repAMI) permite la cuantificación fiel y la colocalización de los patrones asociados que afectan a la enfermedad. Aquí, se proporciona un enfoque de imágenes automatizado guiado por hojas de luz para la medición contemporánea del daño cardíaco, el área en riesgo y la respuesta de las células inmunitarias.
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Artículo de método
Análisis 3D simultáneo del daño cardíaco y la respuesta inmune en el infarto agudo de miocardio reperfundido mediante microscopía de fluorescencia de hoja de luz
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Resumen
Resumen
Las interacciones celulares complejas determinan la remodelación funcional y estructural del tejido durante el infarto agudo de miocardio reperfundido (repAMI). Estos procesos muestran una distribución espacial distinta a medida que el músculo cardíaco lesionado se segmenta en diferentes áreas (área dañada, área en riesgo (AAR) y área remota). La visualización tridimensional (3D) de estas áreas es esencial para el análisis de diversas interacciones entre las células cardíacas residentes y las células inmunitarias infiltrantes, lo que permite identificar posibles objetivos de tratamiento. Aquí, se describe un protocolo para la visualización y cuantificación 3D simultánea y automatizable del área de daño cardíaco, AAR y células inmunitarias infiltrantes (por ejemplo, neutrófilos) después de repAMI. Esto incluye la tinción mediada por anticuerpos intravitales del área de daño cardíaco (CD31neg) y la infiltración de neutrófilos (Ly6G+) después de la visualización ex vivo de AAR mediante perfusión de anticuerpos retrógrados y una mayor limpieza de tejido no tóxico para imágenes de microscopía de fluorescencia de hoja de luz (LSFM). Esta técnica permite el análisis espacial de las células diana, por ejemplo, la infiltración de células inmunitarias y las áreas dañadas en un corazón de ratón intacto después de repAMI. La histología tradicional y la inmunohistoquímica se pueden realizar después de la limpieza de tejidos no tóxicos y la adquisición de imágenes con posprocesamiento asistido por computadora. Esto permite la multiplexación de la ganancia de información dentro del mismo corazón del ratón, fortaleciendo la robustez de los datos y siendo especialmente significativo en una lesión altamente compleja como repAMI.
Introducción
La lesión tisular en el infarto agudo de miocardio reperfundido (IAMrep) es el principal factor impulsor de la remodelación cardíaca y el desarrollo de insuficiencia cardíaca1. Múltiples mediadores locales y células cardíacas residentes, pero también células inmunes infiltrantes, afectan su expansión en una interacción compleja 2,3. Comprender la organización espacial de estos procesos es esencial para obtener un conocimiento profundo para la identificación de nuevos objetivos terapéuticos para limitar la lesión tisular después de un IAM rep y mejorar l....
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Protocolo
Todos los procedimientos de experimentación con animales fueron aprobados por la agencia gubernamental local responsable (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) y cumplieron con todas las normas éticas pertinentes para la experimentación e investigación con animales. Los experimentos se realizaron con ratones machos C57BL / 6J (9-30 semanas de edad). Los animales fueron alojados y utilizados en condiciones específicas libres de patógenos (SPF) en el establo local en el ciclo diurno y nocturno de 12 h/12 h.
NOTA: Todas las intervenciones quirúrgicas se realizaron....
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Resultados
El enfoque presentado utilizando microscopía de fluorescencia de hoja de luz (LSFM) permite el análisis simultáneo de AAR, lesión endotelial e infiltración de neutrófilos después de repAMI. La Figura 1A ilustra la tinción de anticuerpos intravital y ex vivo de ratones C57BL / 6J 24 h después de la inducción de repAMI. Los anticuerpos para la tinción de la lesión endotelial cardíaca (anti-CD31 marcado con AlexaFluor 790) y la infiltración de neutrófilos (anti-Ly6G marcado con AlexaFl.......
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Discusión
Existen varias entidades de imagen para detectar lesiones del tejido cardíaco durante el infarto de miocardio en ratones. Estas técnicas brindan diferentes ventajas, pero también tienen limitaciones. La tinción de la disminución de la actividad metabólica de las células cardíacas mediante TTC es el método más utilizado para la cuantificación de la lesión cardíaca I/R y se puede combinar con la tinción azul de Evan para la distinción de AAR 13,14,15.
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Divulgaciones
Elias Haj-Yehia informa de honorarios personales y otros de AstraZeneca, que están fuera del trabajo presentado. Simon F. Merz y Lea Bornemann trabajan actualmente en Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG. Matthias Totzeck y Tienush Rassaf informan sobre los honorarios personales, y otros de Edwards and Novartis, Bristol Myers Squibb, Bayer, Daiichi Sankyo y Astra Zeneca, que están fuera del trabajo presentado. Tienush Rassaf y Ulrike B. Hendgen-Cotta cofundaron Bimyo, una empresa centrada en el desarrollo de péptidos cardioprotectores. Matthias Gunzer recibió financiación de investigación general de Miltenyi BioTec B.V. & Co. KG. Todos los demás autores declaran no tener conflicto de intereses.
Agradecimientos
Los autores reconocen las siguientes fuentes de financiación: Fundación Alemana de Investigación (UMEA Clinician Scientist, FU 356/12-2, Elias Haj-Yehia; HE6317/2-1, Ulrike Hendgen-Cotta, RA969/12-1, Tienush Rassaf) y Sociedad Alemana del Corazón (DGK, Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V., DGK02/2022, Elias Haj-Yehia). Parte de este trabajo se realizó en el Centro de Imágenes de Essen (IMCES), una instalación central de servicios de la Facultad de Medicina de la Universidad de Duisburg-Essen, Alemania. Agradecemos al personal del IMCES por su continuo apoyo técnico y el uso de sus instrumentos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Aguja de 27 G | Becton Dickinson | 305889 | BD Eclipse |
| Procesamiento de imágenes 3D y Software de análisis | Plano de bits | Vers. 10.1.0 | Imaris |
| Sutura 5-0 | Serag-Wiessner | IC108000 | Seda |
| Sutura 6-0 | Ethicon | EH7814 | Prolene |
| Kit de etiquetado de anticuerpos AlexaFluor 546 | Invitrogen | A20183 | |
| Kit de etiquetado de anticuerpos AlexaFluor 790 | Invitrogen | A20189 | |
| Anticuerpo anti-ratón Ly6G (AlexaFluor 647) | Bioleyenda | 127610 | Clon: 1A8 |
| Filtro celular (100 µ m) | Corning | 431752 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Carl Roth | 7029.1 | |
| Etanol | Carl Roth | 0911.4 | |
| Cinnemato de etilo (ECi) | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Software de conversión de archivos | Plano de bits | Vers. 10.1.0 | Imaris |
| Gasa | Fuhrmann | 10021 | |
| Goma gellan en polvo | Sigma-Aldrich | P8169 | Phytagel |
| Heparina (25.000 IE/5 mL) | LEO Pharma | 15261203 | |
| Peróxido de hidrógeno (H2O2, 30%) | Carl Roth | 8070.2 | |
| Jeringa inyectable | B Braun | 9161502S | Omnican F |
| Ketamina (100 mg/ml) | Bela-Pharma | 402581.00.00 | |
| Sistema de microscopio de hoja de luz | Miltenyi Biotec | - | UltraMicroscope Blaze |
| Jeringa Luer lock | Becton Dickinson | 303172 | BD Plastipak |
| Agitador magnético | VWR | 444-0572 | |
| Cámara Neo sCMOS (4,2 MP) | Tecnología Andor | ZL41 Celda 4.2 | |
| Objetivo | Miltenyi Biotec | 130-133-625 | MI Plan 1.1x NA 0.1, WD 17.6 mm |
| Paraformaldehído (PFA, 4%) | Sigma-Aldrich | 1.00496 | 10% de formalina, tamponado neutro |
| Placa de Petri | Greiner Bio-One | 632181 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Gibco | 14190-094 | Sin MgCl2/CaCl2 |
| Tubo de polipropileno (15 ml) | Greiner Bio-One | 188261 | |
| Tubo de polipropileno (5 ml) | Carl Roth | EKY9.1 | Negro |
| Tubo de polipropileno (50 ml) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Plato de preparación para canulación de corazón de ratón | Hugo Sachs Elektronik | 73-4327 | Cánula incluida |
| Anticuerpo CD31 anti-ratón purificado | Becton Dickinson | 53369 | Clon: MEC13.3 |
| Bomba de rodillos | Ismatec | ISM597-230 | |
| Película de sellado | Bemis | Teléfono: PM-996 | Parafilm |
| Microscopio estereoscópico | Leica | S6D | |
| Rotador de tubos | Heidolfo | Polymax 1040 | |
| Láser de luz blanca | Fotónica NKT | SuperK extremo | 200 mW, 480– 2400 nm |
| WT cepa de ratón | Laboratorios Janvier | - | C57BL/6JRj |
| Xilacina (2%) | Ceva Tiergesundheit | 6324464.00.00 |
Referencias
- Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).
- Frangogiannis, N. G. Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration. Curr Opin Cardiol.
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Reimpresiones y permisos
