Técnicas eficientes para el muestreo exhaustivo de tejidos accesibles en xenopus adulto

Resumen

Esta es la primera parte de un protocolo integral de muestreo de Xenopus . Los tejidos muestreados son el ventrículo cardíaco, el tronco arterial, el lóbulo hepático izquierdo, la vesícula biliar, el pulmón, el páncreas, el bazo, la laringe, el esófago, el estómago, los intestinos, los testículos, los cuerpos grasos, el oviducto, los riñones pareados, el plexo ciático, la piel, el timo y todo el ojo.

Resumen

Xenopus ha sido durante mucho tiempo un organismo modelo fundamental para investigar el desarrollo y las enfermedades de los vertebrados, ofreciendo información profunda sobre los procesos celulares y la función de los genes. A pesar de la gran cantidad de información sobre el Xenopus embrionario, sigue habiendo una brecha significativa en los métodos estandarizados para el muestreo de tejidos adultos, especialmente para los enfoques modernos como la proteómica cuantitativa. Este estudio presenta un protocolo integral para el muestreo rápido, preciso y eficiente de múltiples tejidos en Xenopus adultos. El protocolo aborda los desafíos asociados con las sutiles diferencias anatómicas en comparación con otros anuros, lo que garantiza la reproducibilidad incluso para aquellos con experiencia limitada en la disección de ranas. Este protocolo está optimizado para análisis bioquímicos de alta calidad al priorizar la frescura de la muestra. Facilitamos la recolección rápida de hasta 18 tejidos en una hora. Además, los métodos se aplican a condiciones perfundidas y no perfundidas, lo que proporciona flexibilidad para una serie de necesidades experimentales. Este trabajo no solo llena un vacío metodológico crítico para Xenopus laevis y tropicalis , sino que también sirve como un recurso valioso para los investigadores que adaptan técnicas a modelos de anfibios similares, mejorando así el alcance y la confiabilidad de los estudios biológicos y evolutivos comparativos.

Introducción

Xenopus ofrece ventajas únicas sobre ratones, peces cebra y otros organismos modelo para el estudio de enfermedades humanas, particularmente en contextos evolutivos y de desarrollo. Su desarrollo embrionario externo y sus embriones grandes y fácilmente manipulables permiten la observación en tiempo real y las intervenciones experimentales (por ejemplo, injertos de tejido, edición de genes) que son difíciles en ratones, que se desarrollan internamente y requieren procedimientos invasivos. Además, el corazón de tres cámaras y las extremidades tetrápodas de Xenopus proporcionan un puente evolutivo más directo para el estudio de los defectos congénitos¹, la regeneración de extremidades² y el desarrollo cardíaco³. A diferencia de los ratones, los renacuajos de Xenopus pueden regenerar extremidades y órganos, modelando procesos regenerativos ausentes en los mamíferos, mientras que su etapa de vida acuática permite el estudio no invasivo de los impactos ambientales o de toxinas. Combinado con una cría más rápida, costos más bajos y menos restricciones éticas, Xenopus es superior para estudios mecanicistas de alto rendimiento de la organogénesis y las respuestas al estrés que son difíciles de replicar en los sistemas de mamíferos.

Este artículo tiene como objetivo ofrecer una guía clara para el muestreo preciso y reproducible de órganos de tejidos adultos de Xenopus, como está disponible para los renacuajos de Xenopus ⁴. Si bien se dispone de una "disección digital"⁵ y una "micro-TC"⁶ de Xenopus adultos, sigue siendo difícil lograr un muestreo consistente de órganos y tejidos en Xenopus adulto sin las instrucciones detalladas proporcionadas para otros modelos adultos, como los ratones^7,8,9.

Aunque se dispone de una guía de muestras para seis tejidos cruciales¹⁰, actualmente no se dispone de una guía específica y extensa de disección y muestreo para Xenopus . Existe una guía de disección completa para Rana ^sp.11 y varios manuales de disección en el aula están disponibles para otros anuros¹², Sin embargo, para las personas que no tienen experiencia en técnicas de muestreo o anatomía de anfibios, las sutiles diferencias entre Xenopus y otros anuros hacen que los recursos existentes sean inadecuados para un muestreo de tejido consistente y replicable.

Esta guía se desarrolló para priorizar la frescura de los tejidos para la proteómica y la inmunoquímica. Para un usuario experimentado, todos los tejidos se pueden recolectar de una persona en menos de una hora. Se recomienda que si un usuario carece de experiencia, intente este protocolo en especímenes que fueron sacrificados por otras razones antes de sacrificar cualquier animal que sea más difícil de reemplazar.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados y realizados de acuerdo con las reglas y regulaciones de la Escuela de Medicina de Harvard IACUC (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales IS 00001365_3). Si se sigue el protocolo de perfusión¹³ antes de la toma de muestras, pase al paso 2.3.

1. Preparación (sin perfusión)

1. Asegurarse de que la institución de investigación ha aprobado la técnica de eutanasia descrita en este protocolo.
2. Prepare una solución de 5 g/L de MS-222 (metanosulfonato de tricaína) y 5 g/L de bicarbonato de sodio (ver Tabla de Materiales). Verifique el pH para asegurarse de que esté ≥7.
   NOTA: El volumen debe ser mayor que el volumen requerido para cubrir completamente a los animales que se sacrifican.
3. Realizar la eutanasia primaria colocando el Xenopus en la solución MS-222 (del paso 1.2), manteniendo al animal sumergido durante un total de 1 h¹⁴.
4. Coloque la superficie de disección (bandeja o lámina de espuma) inclinada dentro de un recipiente secundario o dispóngala de otra manera para facilitar el drenaje de la sangre.
5. Una vez que la rana ha estado en la solución durante 1 h, se ha completado la eutanasia primaria. Retire la rana y verifique la pérdida de respuesta al dolor realizando un pellizco en el pie.
6. Registre la edad (si se conoce), el sexo y el estado de salud del animal que se está muestreando, así como si ha sido perfundido. Pesa el Xenopus y toma las medidas adicionales necesarias antes de tomar la muestra.
7. Coloque la rana boca arriba y sujete las extremidades anteriores proximales al cuerpo (Figura 1A).
8. Con unas tijeras de disección, corte la piel, suba por la línea media y luego lateralmente, haciendo dos solapas.
9. Identifique la línea alba (Figura 1B). Use fórceps para agarrar la línea alba y alejarla de la cavidad celómica. Use con cuidado unas tijeras para cortar hacia la cabeza, a través de la musculatura. Haga dos solapas fuera de la pared de la cavidad y corte o sujete con alfileres todas las solapas para que no estorben.
10. Identifica el corazón, que aún debería estar latiendo. Si el corazón no es fácilmente accesible, use tijeras de disección para reducir los huesos coracoideos (Figura 1B).
    NOTA: Si el corazón ha dejado de latir antes de la toma de muestras, la frescura de la muestra se ha visto comprometida.
11. Si lo desea, complete el protocolo de perfusión rápida⁹.

2. Muestreo

NOTA: Si el animal ha sido perfundido, vaya al paso 2.3. Todos los márgenes deben ser de aproximadamente 25 mm. Las pinzas y las tijeras deben limpiarse o reemplazarse entre muestras. Todos los tejidos deben ser muestreados dentro de 1 h después de la eutanasia, para obtener la máxima frescura.

1. Con una pipeta de transferencia, enjuague la cavidad celómica con PBS frío o PBS¹⁵ 0,7x para eliminar la sangre y mantener la visibilidad.
2. Identifique el pericardio delgado (Figura 2A) y tire de él con pinzas de tejido. Con la punta de las tijeras de iridectomía, perfore suavemente, teniendo cuidado de no cortar los tejidos subyacentes. Retire el pericardio de las tres cavidades del corazón (Figura 2B).
3. Recorte las aurículas cortándolas donde se unen con el ventrículo y el tronco arterial.
4. Use fórceps para agarrar el ventrículo por el ápice y cortarlo por debajo de donde se une con el tronco arterial, dejando un margen (Figura 2C).
5. Inspeccione visualmente el ventrículo con aumento para asegurarse de que no haya tejidos no deseados adheridos.
   NOTA: El centro del ventrículo puede incluir tejido valvular espiral de color claro; Esto se puede mantener. En los animales no perfundidos, la extirpación del ventrículo puede calificarse como eutanasia secundaria (también llamada anestesia terminal).
6. Inmediatamente después de la toma de muestras, enjuague las muestras de tejido en PBS refrigerado o 0,7x PBS, dependiendo de las necesidades experimentales¹⁵.
   NOTA: En animales perfundidos, se espera que todos los tejidos, excepto el hígado, se enjuaguen limpiamente. Si este no es el caso, entonces se debe hacer una nota. En los tejidos no perfundidos, todos los medios de enjuague estarán saturados de sangre. Se deben seguir los pasos 2.5 a 2.6 después de tomar la muestra de cada tejido.
7. Obsérvese que el tronco arterial se bifurca en dos troncos aórticos (también llamados aortas laterales) y que cada uno se divide en tres arcos arteriales (Figura 2D). Tire del tronco arterial para tensarlo y corte los troncos aórticos inmediatamente después de donde se dividen estos arcos.
8. Observar los tres lóbulos del hígado (Figura 3A). Agarre el labio del lóbulo izquierdo (a la derecha del espectador) y levántelo suavemente para que los conductos hepático y cístico sean visibles. Tome muestras de los 2/3 inferiores del lóbulo, debajo de estos accesorios (Figura 3B).
9. Identifica la vesícula biliar, que puede variar drásticamente de color. Agarre la vesícula biliar, retírela del lóbulo derecho del hígado y corte su unión (Figura 3C). Si no revienta, rómpelo con unas tijeras de iridectomía.
10. Agarra el ápice del pulmón y tira de él para tensarlo. Observa la textura de los alvéolos y determina dónde termina esa textura y comienza el bronquio. Corte en este margen (Figura 3D). Si el pulmón está fusionado con el peritoneo, sepárelo con cuidado.
11. Identifica el ovario, que está envuelto en una capa de peritoneo visceral llamada epitelio germinal. Mueva suavemente los lóbulos hasta que estén de sus lados respectivos para hacer visible el área de inserción (Figura 4A); Estas uniones son directamente ventrales al riñón pareado. Con unas tijeras, extraiga los ovarios lo más cerca posible de los riñones, sin dañarlos (Figura 4B). Durante este proceso, si los ovocitos se filtran, tome muestras de ellos y luego enjuáguelos.
    NOTA: La extirpación del ovario es útil para obtener un mejor acceso a los tejidos de una rana hembra.
12. Inspeccione el lóbulo anterior (también llamado lóbulo mediano) del hígado y observe cómo se conecta con el estómago y el duodeno a través del mesenterio (Figura 3A y Figura 4C). Cortar el mesenterio y el ligamento hepatoduodenal con unas tijeras de iridectomía. La masa carnosa restante es el páncreas y el conducto biliar común.
13. Cortar la conexión del páncreas y el conducto biliar común con el lóbulo anterior del hígado, dejando un margen. Agarre el estómago con pinzas dentadas y un extremo del páncreas con pinzas de tejido. Con aumento, separe suavemente el páncreas del estómago (Figura 4D).
    1. En caso de que el páncreas no se desprenda limpiamente, retire el tejido pancreático restante. Alternativamente, separe el páncreas metódicamente con tijeras de iridectomía y pinzas de tejido.
       NOTA: Además del colédoco, se espera que en esta muestra se incluya algo de mesenterio y el conducto pancreático.
14. Identifique el bazo y tome muestras cortando su unión al peritoneo (Figura 4E).
15. Retire y deseche los tejidos hepáticos restantes.
16. Extirpar el otro pulmón y el bronquio restante donde se unen a la laringe. Agarrando la laringe por su extremo inferior, comience a levantarla fuera de la cavidad, cortando las inserciones claras a medida que se hacen evidentes.
17. A medida que se levanta la laringe, su unión al esófago se hará notable. Pelar y cortar cuidadosamente el tejido esofágico de la laringe con unas tijeras de iridectomía curvas (Figura 5A). Luego, tira de la laringe hacia abajo y recórtala lejos de la cavidad bucal. Corta cualquier accesorio transparente que se haga evidente.
18. Nótese la curvatura del estómago, que lo diferencia del esófago, así como la restricción pilórica que diferencia el estómago de los intestinos (Figura 5B). Corta el canal alimentario inmediatamente anterior a la curvatura del estómago, separándolo del esófago.
19. Abra la boca e identifique la abertura compartida de las trompas de Eustaquio en su techo¹⁶. Con la boca abierta, tire del esófago para notar su inserción (Figura 5C). Levanta el esófago fuera de la cavidad, cortando los inserciones transparentes a lo largo del camino. Separe el esófago de la cavidad bucal inmediatamente debajo de la abertura de Eustaquio.
20. Agarre el estómago y córtelo donde se encuentra con el duodeno, en la restricción pilórica (Figura 5A, B).
21. Tire del colon y córtelo lo más cerca posible de la cloaca (Figura 5D). Tire de los intestinos, cortando cualquier inserción peritoneal clara.
22. Si la rana es macho, identifique los testículos y extraiga uno con unas tijeras de iridectomía, teniendo cuidado de no dañar el riñón subyacente (Figura 6A).
23. Separa los cuerpos gordos para que queden de lado respectivo; El área sobre el riñón, donde el cuerpo graso se conecta con el peritoneo, será visible. Agarre la base de cualquiera de los cuerpos grasos y use unas tijeras para cortarla del peritoneo, dejando un margen (Figura 6B).
24. Identifique y extraiga la vejiga urinaria, cortando lo más cerca posible de la cloaca (Figura 6C).
25. Si la rana es hembra o tiene un oviducto vestigial distintivo, agarre el extremo inferior del oviducto, retírelo de la cloaca y córtelo lo más cerca posible de la cloaca (Figura 6D). Extraiga el oviducto de la cavidad celómica, cortando las inserciones peritoneales a medida que se hagan evidentes (Figura 6E).
26. Retire y deseche los cuerpos grasos restantes y los testículos o el oviducto.
27. Utilice fórceps para agarrar los riñones por su base inferior y observe que están cubiertos por el peritoneo transparente (retroperitoneal)¹⁷. Cortar el peritoneo en la base del riñón (Figura 7A) y luego levantar los riñones fuera de la cavidad celómica (Figura 7B), usando tijeras para cortar el peritoneo según sea necesario.
28. Con aumento, corte el exceso de peritoneo y cualquier resto de tejido graso del cuerpo, ovario o testículos.
29. Observe el haz de nervios periféricos que unen el extremo de la columna vertebral a cada pierna; Este es el plexo ciático. Agarre el haz de nervios con fórceps y córtelos donde salgan de la cavidad celómica (Figura 7C). Levante el haz fuera de la cavidad y córtelo donde los nervios salen de la columna vertebral (Figura 7D).
30. Retira los alfileres del animal, colócalo en su ventrum y vuelve a sujetar las extremidades del animal. Seleccione cualquiera de las extremidades traseras para tomar muestras y fije el pie de esa extremidad.
31. Retire un colgajo de piel en forma de almendra sobre el gastrocnemio/tibiofíbula (Figura 8A,B).
32. Agarre la piel del dorso y corte lateralmente para que haya un corte continuo alrededor de la sección media del animal (Figura 8C).
33. Retire los clavos, asegure las patas con una mano y agarre la piel dorsal anterior con pinzas dentadas. Despellejar al animal tirando de la piel dorsal hacia arriba sobre la cabeza y los brazos, usando fuerza (Figura 8D).
34. Identifique la masa grasa que cubre la articulación de la mandíbula, corte el margen posterior de la masa desde donde se fusiona con los tejidos musculares rosados y luego use tijeras de iridectomía para cortarla del hueso subyacente (Figura 9A). Dependiendo de la edad y madurez del animal, se hará evidente un grupo de melanóforos (Figura 9B). Recorta la masa para que no queden inserciones musculares ni cartílagos.
35. Vuelva a sujetar al animal y seleccione un ojo. Inserte unas tijeras de iridectomía curvas en la órbita alrededor de la curvatura del ojo (Figura 9C). Corta suavemente alrededor del ojo, cortando las inserciones musculares.
36. Deslice las tijeras más profundamente en la órbita y separe el nervio óptico, detrás del ojo. Use estas tijeras para desalojar el ojo fuera de la órbita y luego reducir aún más las inserciones musculares.

Resultados

Al seguir todos los pasos de este protocolo, el ventrículo cardíaco, el tronco arterial, el lóbulo del hígado izquierdo, la vesícula biliar, el pulmón, el páncreas, el bazo, la laringe, el esófago, el estómago, los intestinos, los testículos, los cuerpos grasos, el oviducto, los riñones emparejados, el plexo ciático, la piel, el timo y todo el ojo se extirparon limpiamente dentro de una hora después de la eutanasia (ver Figura 1, Figura 2,

Discusión

El protocolo presentado aquí está diseñado para proporcionar flexibilidad a los usuarios en varios niveles de experiencia, al tiempo que garantiza la recolección de tejidos esenciales de manera oportuna y eficiente. Se recomienda a los nuevos usuarios que sigan cada paso del protocolo como se describe para garantizar la recolección sistemática de tejidos. Sin embargo, los usuarios más experimentados pueden optar por saltarse ciertos pasos y tomar muestras solo de los tejidos que necesita...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1x PBS	Corning	21-040-CV
5x Lupa con luz LED y soporte	amazon.com	B08QJ6J8P1	luz no debe producir calor
Pipetas de transferencia desechables	VWR	414004-036
Pinzas de disección de punta fina	Fisher Scientific	08-875
Tijeras de disección piont afilado, rectas 6.5"	VWR	76457-374
Bandeja de disección	Fisher Scientific	14-370-284 hojas de	espuma de poliestireno son una alternativa aceptable
Contenedor de eutanasia	US Plastic	Artículo  2860	contenedores opacos alternativos aceptables
Tapa de contenedor de eutanasia	US Plastic	Artículo  Tijeras de iridectomía 3047
6"	VWR	470018-938	tijeras de iris son una alternativa aceptable
MS-222: Sinciína (anteriormente tricaína)	Pentair AES	TRS1
tejido de diente de rata 5.5 in., Acero inoxidable	Fisher Scientific	S08100
Bicarbonato de sodio, polvo, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Pinzas para especímenes, dentadas	VWR	82027-442
T-Pins para disección	Fisher Scinetific	S99385

Pinzas de