Artículo de método

Fabricación reproducible de SPOT como plataforma de cultivo basada en andamios de alto rendimiento

DOI:

10.3791/68405

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29 de julio de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, University of Toronto, 3Division of Engineering Science, University of Toronto

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo documenta la fabricación y el montaje de SPOT, una plataforma de cultivo basada en andamios de alto rendimiento, en formatos de 96 y 384 pocillos. También detalla el proceso de siembra para SPOT, tanto manual como utilizando un manipulador de líquidos disponible comercialmente.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los organoides derivados de pacientes (PDO) se utilizan cada vez más en el campo de la investigación del cáncer para modelar tumores. Combinan los beneficios de los modelos in vivo e in vitro tradicionales, recapitulando la complejidad y heterogeneidad de los tejidos sin dejar de consistir en células humanas. El aumento de los modelos PDO fisiológicamente representativos ha provocado la necesidad de dispositivos que permitan un análisis directo del comportamiento de los organoides. Este protocolo explica cómo ensamblar y utilizar la plataforma soportada por andamios para tejidos basados en organoides (SPOT), un dispositivo de cultivo de organoides tridimensional (3D) de alto rendimiento. Esta plataforma elimina el menisco típicamente formado por hidrogeles sembrados para permitir imágenes precisas y rápidas, similar al proceso de imágenes para cultivos bidimensionales (2D). Como resultado, los organoides y cocultivos sembrados en SPOT se pueden visualizar fácilmente mediante microscopía de alto rendimiento. Diseñado para uso comercial, SPOT es accesible para investigadores con experiencia básica en cultivo de tejidos y es compatible con flujos de trabajo de siembra manuales y automatizados. Este protocolo detalla la fabricación de SPOT en formatos de 96 y 384 pocillos, incluidas instrucciones paso a paso para el montaje, la siembra, el control de calidad y la resolución de problemas. Si bien la fabricación requiere de 3 a 4 h, excluyendo el tiempo de inactividad, se pueden producir varias placas simultáneamente, lo que mejora la escalabilidad. Al optimizar el cultivo y el análisis de PDO, SPOT proporciona una herramienta sólida para la detección de fármacos de alto rendimiento y la investigación traslacional del cáncer.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A pesar de los avances en la investigación biomédica, el desarrollo de ensayos in vitro fisiológicamente relevantes sigue siendo un desafío. Un ensayo ideal debe adaptarse a una amplia gama de tipos de células, formulaciones de tratamiento, escalas de tiempo, instrumentación comercial y lecturas analíticas para satisfacer las necesidades de los investigadores en diversas disciplinas. Sin embargo, debido a la falta de herramientas adecuadas, los investigadores a menudo confían en modelos simplistas, como monocapas 2D de líneas celulares inmortalizadas, que no recapitulan la complejidad y la relevancia clínica, particularmente en la investigación del cáncer 1,2. Para abordar esto, el biobanco de tumores a gran escala y la colaboración de los médicos han impulsado el desarrollo de modelos in vitro de alta fidelidad, como los organoides tumorales derivados de pacientes (PDO), que conservan perfiles genéticos y terapéuticos más específicos del paciente en comparación con las líneas celulares 3,4,5. Mientras tanto, los avances en la automatización de laboratorios y el descubrimiento de fármacos exigen plataformas que se integren a la perfección en flujos de trabajo de alto rendimiento. Si bien las plataformas existentes abordan la fidelidad biológica o la escalabilidad, pocas han podido resolver ambos desafíos simultáneamente 6,7,8. El desarrollo de modelos automatizados de alto rendimiento que repliquen las características clave de la enfermedad es crucial para avanzar en la investigación biomédica y acelerar la generación de datos para aplicaciones traslacionales.

Numerosos modelos emergentes tienen como objetivo abordar los desafíos asociados con el cultivo de tipos de células especializadas, como las PDO, con un alto rendimiento (Figura 1). Las plataformas estándar, donde los organoides se mezclan con hidrogel en placas de 96 o 384 pocillos, presentan varias limitaciones: (i) el alto volumen de gel celular conduce a un acceso inconsistente a los nutrientes, (ii) la curvatura del menisco del pocillo crea artefactos de imagen y gradientes celulares, (iii) la siembra de hidrogel carece de uniformidad entre lotes y personal, (iv) incompatibilidad con la fabricación automatizada y la microscopía automatizada, y (v) el uso de matriz extracelular (ECM) que suele ser una muestra de riesgo suave y frágil destrucción a densidades fisiológicas de tejido o incorporación de tipos de células contráctiles 1,9. Actualmente, la mayoría de los estudios de PDO basados en placas se llevan a cabo sembrando manualmente el gel celular en la placa10,11, o un método de recubrimiento de gel, donde el hidrogel se diluye con un medio menos viscoso y las células se centrifugan hasta el fondo del pocillo para colocarlas en el plano óptico apropiado12,13. Ambos enfoques no brindan soporte mecánico para el cultivo a largo plazo. Según nuestras observaciones anteriores (datos no publicados), el hidrogel comercial mezclado con células en placas de pocillos estándar se contrae desde las superficies del pocillo durante 9 de cada 12 pocillos durante 12 días, mientras que el método de superposición de gel carece de interacciones fisiológicas entre la célula y la matriz. Además, los cultivos resultantes no se pueden mantener durante largos períodos debido a limitaciones de espacio dentro del pocillo y son incompatibles con ensayos que requieren una alta relación reactivo-medio-célula 14,15,16. Estas barreras prácticas dificultan la adopción de modelos 3D y limitan la reproducibilidad experimental en todo el campo.

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Figura 1: Evaluación de modelos de cultivo basados en escalabilidad y relevancia biológica. El posicionamiento relativo de varios sistemas de cultivo in vitro e in vivo a lo largo de la escalabilidad (eje y), definido por el rendimiento de la placa, y la relevancia biológica (eje x), destacando las compensaciones entre el potencial de rendimiento y la fidelidad fisiológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Motivados por estos desafíos, la alta porosidad y el refuerzo mecánico de un andamio de celulosa delgada se aprovecharon para desarrollar la plataforma soportada por andamios para tejidos basados en organoides (SPOT), disponible en formatos de 96 y 384 pocillos. SPOT incorpora un andamio de polímero preestampado utilizando un método de infiltración desarrollado previamente17 que coincide con el diseño de la placa, lo que permite una colocación precisa de las gotas de gel celular y proporciona soporte estructural para la fase de hidrogel (Figura 2A). La absorción capilar en el andamio guía la solución de gel celular, formando una red de biocompuestos aplicada mecánicamente (Figura 2B). Debido a la estructura porosa del andamio, el gel celular se infiltra y forma una capa delgada (aproximadamente 70 μm de espesor), lo que requiere una cantidad diez veces menor de gel celular para cubrir el fondo del pocillo14. La compatibilidad de SPOT con PDO de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) de siembra también se demostró mediante la evaluación de su crecimiento mediante ensayos metabólicos y mediciones basadas en imágenes. Desde su desarrollo, SPOT ha demostrado una versatilidad y facilidad de uso significativas para los investigadores que se dedican al cultivo de organoides. Además, el diseño de SPOT se adapta a una escalabilidad fácil de usar, con volúmenes de reactivos reducidos y capacidades de imagen mejoradas a través de su geometría de microgel plana y sin meniscos, lo que garantiza una penetración uniforme de la luz y una imagen precisa de alto contenido14 (Figura 2C, D). SPOT también apoya el cocultivo con otros tipos de células relevantes, como los fibroblastos, para recapitular mejor el microambiente tumoral18.

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Figura 2: Descripción general del dispositivo 96-SPOT y flujo de trabajo de análisis de imágenes. (A) Representación esquemática de la fabricación de placas SPOT: el dispositivo se ensambla mediante la clasificación de una placa de pocillos sin fondo comercial (arriba), un andamio con patrón de PMMA (que se muestra en azul) y una película de policarbonato (abajo) utilizando capas de adhesivo poliacrílico de doble cara (que se muestra en amarillo). (B) Siembra celular en pozo de andamio: las células se suspenden en un hidrogel no polimerizado (que se muestra en rosa) y se pipetean en cada pocillo donde se infiltra en el andamio. Luego, se permite que el hidrogel se gelifique para encapsular las células dentro del hidrogel soportado por andamios. (C) Microscopía: el microtejido resultante se puede visualizar utilizando microscopía automatizada de campo amplio. (D) Análisis basado en imágenes: Las imágenes adquiridas de células fluorescentes (verdes) suspendidas en gel se pueden analizar utilizando tuberías estándar de análisis de imágenes. Imagen representativa de microscopía de epifluorescencia de células KP4 que expresan GFP en un pocillo 96-SPOT. La barra de escala es de 500 μm. Esta cifra ha sido modificada de14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Otra ventaja de SPOT es que el sistema se puede integrar con un manipulador de líquidos de código abierto, lo que facilita la fabricación automatizada y reproducible de cultivos PDO. Este avance reduce la variabilidad del usuario y respalda diseños experimentales complejos, incluido el cribado de fármacos de alto rendimiento y los enfoques de medicina personalizada18. SPOT también demostró previamente ser compatible con la caracterización multiplexada basada en una sola célula de fenotipos celulares en entornos tumorales heterogéneos y la recuperación de las células a demanda de SPOT por digestión18. Estas características posicionan a SPOT como una herramienta versátil para aplicaciones de detección, donde los datos longitudinales de alta resolución son esenciales para evaluar la eficacia de los medicamentos y el comportamiento celular en condiciones fisiológicamente relevantes14,18. Al combinar estas innovaciones técnicas, SPOT aborda las limitaciones críticas de los sistemas tradicionales de cultivo 3D.

Este protocolo proporciona una guía completa para la fabricación de componentes SPOT, placas de ensamblaje y métodos de siembra para cultivos de organoides 3D robustos y reproducibles. Incluye instrucciones detalladas para la siembra manual de placas mediante una micropipeta y flujos de trabajo de siembra automatizados con un manipulador de líquidos, que admite formatos de 96 y 384 pocillos. Además, este protocolo describe medidas esenciales de control de calidad, como verificar la distribución uniforme del gel y la integridad del andamio, para mantener altos estándares experimentales. También se proporcionan estrategias de resolución de problemas para abordar problemas comunes, como la infiltración incompleta del gel, la evaporación durante la siembra y el desprendimiento del andamio, equipando a los investigadores con soluciones prácticas para optimizar sus flujos de trabajo y lograr resultados confiables.

SPOT está diseñado para llenar los vacíos que enfrentan los ensayos de organoides tradicionales, incluidos los desafíos relacionados con la realización de ensayos y el cambio de medios, al tiempo que preserva la integridad del gel 10,11,12,13. El objetivo general de este método es fabricar una plataforma soportada por andamios que admita el cultivo de organoides durante un período de 12 días. Además, este método también cubre la generación de matrices de tejidos en SPOT a través de la siembra manual o asistida por manipulador de líquidos para permitir a los usuarios realizar cualquier perturbación posterior, incluidos los ensayos IC50 de fármacos y la detección de moléculas pequeñas.

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Protocolo

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En este protocolo, se utilizaron organoides de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) como ejemplo. Esos organoides se establecieron a partir de pacientes con PDAC, comprados en el Biobanco UHN en el Centro Oncológico Princess Margaret (identificador PMLB PPTO.46 de la Red de Salud de la Universidad, Canadá) bajo un protocolo de conformidad con las pautas de la Junta de Ética de la Investigación de la Universidad de Toronto (protocolo # 36107). Consulte todos los materiales, reactivos y equipos necesarios en la Tabla de materiales.

1. Hacer una solución de PMMA-acetona (Tiempo: 20 min + ~ 8-16 h inactivo)

NOTA: La solución de polimetilmetacrilato (PMMA)-acetona se usa en SPOT para delinear pozos y evitar fugas entre pozos. El procedimiento general es disolver el PMMA sólido en acetona. Anteriormente, la solución de PMMA-acetona se usaba para modelar un andamio de papel similar para bloquear el intercambio de medios y gases para lograr hipoxia en un modelo de cultivo 3D diferente17. Aquí, la fórmula de PMMA-acetona se adapta para generar andamios infiltrados en PMMA para la fabricación de SPOT.

  1. En un tubo de centrífuga cónico de 50 ml etiquetado, agregue 1,75 g de polvo de PMMA. Luego, en una campana extractora, agregue 7,84 ml de acetona y cierre bien el tubo para evitar la evaporación del solvente.
  2. Si se necesita visualizar el patrón de polímero, agregue de 5 a 10 gotas de esmalte de uñas a la solución. Cierre bien el tubo de centrífuga. Agite manualmente el tubo para comenzar a mezclar el esmalte con la solución de PMMA y acetona.
    NOTA: Para que sea consistente en múltiples lotes de trazado, diluya una cantidad conocida de esmalte de uñas en acetona, luego pipetee esta solución como 7,84 ml de acetona.
  3. Coloque la solución de PMMA-acetona en el mezclador de vórtice durante la noche para asegurarse de que la solución se disuelva. Conservar la solución de PMMA-acetona a 4 °C durante un máximo de 2 semanas, si no se ha abierto.

2. Fabricación de andamios infiltrados en PMMA

(Tiempo: para patrones 96-SPOT: 15 minutos de configuración + 6 minutos por andamio; para patrones 384-SPOT: 15 minutos de configuración + 10 minutos por andamio)

NOTA: La fabricación de andamios infiltrados en PMMA para 96-/384-SPOT se realiza exclusivamente en un banco de trabajo (ambiente no estéril). Para hacer andamios 96/384-SPOT, asegúrese de que se haya instalado el software de trazado de edición de gráficos respectivo o la biblioteca de control de trazador vectorial.Tenga en cuenta que algunas subsecciones del procedimiento se aplican tanto a 96-SPOT como a 384-SPOT, mientras que otras son específicas para un tamaño de placa. En este último caso, se presentarán las opciones A (para 96-SPOT) y B (para 384-SPOT). Para el patrón (A) 96-SPOT, hay tres capas; en primer lugar, las líneas de cebado establecen un flujo constante de la solución de PMMA-acetona; segundo, el conjunto de 96 círculos; por último, un patrón de vendedor ambulante (TSP) traza los espacios entre pozos. Para el patrón (B) 384-SPOT, el primer módulo contiene líneas de cebado; segundo, el borde que rodea la placa del pozo; Por último, se traza una cuadrícula tal que quedan 384 regiones. Para ambos patrones, los tamaños de los pozos pueden controlarse alterando el código fuente, como lo demuestran Li et al.14.

  1. Configuración para el proceso de infiltración de andamios
    1. Deje que la solución de PMMA-acetona (almacenada a 4 °C) se agite durante 10 min a temperatura ambiente. Deje el soporte del tubo hasta que comience el trazado.
    2. Conecte el plotter a la alimentación mediante el cable de alimentación. Una luz verde intermitente indica que el dispositivo está encendido. Conecte el cable USB del trazador al ordenador designado para trazar.
    3. Cubre el caballete con un trozo de papel pergamino. Asegúrese de que toda la superficie del caballete esté cubierta.
      1. Para guiar el trazado de patrones 96-/384-SPOT, prepare una plantilla 96-/384-SPOT en una hoja de papel de impresora. Realice los pasos 2.2-2.3 con un bolígrafo en lugar de una jeringa y papel de impresora en lugar del papel pergamino y el filtro de té. Una vez que la plantilla esté lista, colóquela en el caballete de clip y cúbrala con papel pergamino. Continúe con el paso 2.2 y siga el protocolo para hacer andamios 96-/384-SPOT.
    4. Sujete el papel pergamino en el caballete con clips de carpeta (Figura 3A). Tome una hoja de andamio (es decir, papel de filtro de té) y corte a lo largo de los lados donde se fusionan las dos capas (Figura 3B).
    5. Coloque el filtro de té cortado, llamado andamio de papel en adelante, en el caballete de clip, con el lado liso (lado exterior del filtro de té) hacia arriba. Sujétalo por tres lados. Asegúrese de que el andamio de papel esté completamente aplanado en el caballete de clip; No debe haber arrugas en el área de trazado.
  2. Trazando el patrón 96/384-SPOT
    1. Para configurar el software del trazador y el archivo para 96-SPOT, siga la opción 2.2.2; para configurar el software y el archivo para 384-SPOT, siga la opción 2.2.3.
    2. Configuración del software del plotter y del archivo de trazado 96-SPOT
      1. En la aplicación de software, abra el archivo SVG para 96-SPOT (Archivo complementario 1; Figura 4A). En la barra de menús, vaya a Extensiones > Control de trazador (Figura 4B).
      2. Cuando aparezca la nueva ventana, ajuste la configuración para que coincida con la Figura complementaria 1. Vuelva a la ficha Trazar de la ventana Extensión de control de trazador. Deja esto abierto para más tarde.
    3. Configuración de la API de la biblioteca de control del trazador vectorial y el archivo de trazado 384-SPOT
      1. Abra la ventana del símbolo del sistema (Windows) o Terminal (Mac). Introduzca el comando para iniciar el cuaderno informático interactivo designado. Asegúrese de que el bloc de notas se abre en un navegador.
      2. Seleccione el archivo de código 384-SPOT (Archivo complementario 2) para abrir. Con una punta de 20G (o una punta de 16G para el patrón 384-SPOT), aspire 1 ml de solución de PMMA-acetona con la jeringa de trazado de 3 ml (Figura 3C).
        NOTA: La válvula de control de flujo entre la jeringa de carga de 10 ml y el tubo de EVA debe estar abierta (paralela al barril). Como el proceso de infiltración se basa en la gravedad, asegúrese de que la jeringa de trazado de 3 ml esté siempre llena entre la marca de 0,5 y 1,5 ml para mantener un volumen de dispensación constante durante el trazado.
    4. Mientras la punta de la jeringa de trazado de 3 ml todavía está dentro de la solución de PMMA-acetona, cierre la válvula de control de flujo entre la jeringa de carga de 10 ml y el tubo de EVA (llévela perpendicular al barril).
    5. Cierre rápidamente el tubo de solución de PMMA-acetona. Cargue la jeringa de 3 ml en el portalápices. Ajuste la altura de la jeringa con respecto al soporte para lograr la siguiente alineación (Figura 3D).
    6. Ajuste la posición del caballete de clip para que la punta de la jeringa de 3 ml descanse en el origen del patrón trazado (es decir, el punto oscuro en la parte superior izquierda del patrón de plantilla). Levante el soporte del rotulador con la jeringa conectada a él, para deslizar el caballete de clip debajo.
    7. Desconecte rápidamente la jeringa de 10 ml del tubo para permitir que la presión atmosférica ejerza presión sobre la solución de PMMA-acetona almacenada en la jeringa de trazado de 3 ml. Abra la válvula de control de flujo.
    8. Para comenzar a trazar el patrón 96-SPOT, siga los pasos 2.2.9; para comenzar a trazar 384-SPOT, siga el paso 2.2.10.
    9. Inicie el trazado de 96-SPOT en el trazador designado como se describe a continuación.
      1. En el software, haga clic en Aplicar en las extensiones de control del trazador. El trazador comenzará a ejecutarse, trazando el patrón PMMA. No es necesario realizar ninguna otra acción hasta que se realice el trazado y el soporte del rotulador vuelva a su posición inicial.
      2. Para pausar el trazador durante el trazado, pulse el pequeño botón plateado situado en el lado izquierdo del trazador. A continuación, a través de la pestaña Extensiones de control del trazador > Reanudar en el software de gráficos, elija reanudar el trazado desde donde se detuvo o devolver el portaplumas a la posición inicial (Figura complementaria 1C (iii)).
    10. Inicie el trazado de 384-SPOT en la interfaz informática designada como se describe a continuación.
      1. En la interfaz, haga clic en Reiniciar kernel y volver a ejecutar (flecha doble en la barra de herramientas). El código ahora comenzará a ejecutarse, trazando el patrón PMMA. No se necesitan más acciones hasta que el patrón termine de trazarse y el portaplumillas vuelva a su posición inicial.
      2. Para pausar el trazador durante el trazado, pulse el botón Plata pequeña situado en el lado izquierdo del trazador. Mueva manualmente el cabezal de impresión completamente hacia atrás y hacia la izquierda para que llegue a su posición inicial. Vuelva a conectar el trazador a la alimentación. A diferencia de la representación gráfica de 96-SPOT, no hay forma de reanudar la representación gráfica de 384-SPOT desde donde se detuvo; Reemplace el andamio de papel e inicie el código desde el principio.
  3. Descarga de la jeringa y limpieza
    1. Una vez que haya terminado el trazado, vuelva a conectar la jeringa de 10 ml al tubo. Retire la jeringa de 3 ml del soporte de la pluma del plotter y transfiera cualquier solución restante de PMMA-acetona nuevamente al vial de reserva o deséchela si se ha producido una evaporación significativa durante los pasos anteriores.
    2. Lave el cilindro de la jeringa de 3 ml pipeteando en acetona. Deje que el sistema de tubos de jeringa se seque al aire antes de devolverlo a su lugar de almacenamiento.
    3. Suelte con cuidado el andamio SPOT del caballete Clip.
    4. Inspeccione los andamios SPOT trazados para asegurarse de que puedan usarse para experimentos (Figura 3E, F). Consulte la Tabla 1 de solución de problemas y la Tabla 2 y la Tabla 3 de control y garantía de calidad para obtener orientación.
    5. Guarde todos los andamios con estampado de PMMA en una bolsa con cierre hermético en un lugar fresco y seco.

3. Corte de cinta de 96/384 pocillos

(Tiempo: para patrones 96-SPOT: 15 min por 5 piezas de cinta; para patrones 384-SPOT: 30 min por 5 piezas de cinta)

NOTA: Esta es una de las formas más eficientes de cortar cintas de manera precisa y eficiente, particularmente para patrones de cinta de 384 pocillos. Este método también ofrece la posibilidad de grabar con láser una capa de la cinta (plástico de la cubierta superior) para mejorar la usabilidad durante el proceso de montaje. Alternativamente, las cintas también se pueden cortar con cortadores de papel a un ritmo más lento sin el proceso de grabado.

  1. Abra el archivo de corte por láser de patrón de cinta de 96/384 pocillos (Archivo complementario 3, Archivo complementario 4) y cargue el patrón de impresión codificado con tres colores diferentes en el software de corte por láser haciendo clic en Trazar con la siguiente configuración en la Figura complementaria 2A.
  2. Cargue un trozo de cinta adhesiva en la superficie del cortador láser y asegúrese de que la cinta esté aplanada suavemente sobre la superficie. Use cintas de papel o pesos pesados para sujetar las cintas durante el corte.
    NOTA: Asegúrese de que la cinta esté plana sobre la superficie del cortador láser. Cualquier golpe puede afectar la calidad de las cintas cortadas, particularmente las cintas de 384 pocillos.
  3. Ajuste la ubicación del patrón de impresión para alinearlo con la ubicación de la cinta según el manual de la cortadora láser.
  4. Corte ambas cintas de 96/384 pocillos con la misma configuración de cortador láser que se muestra en la Figura complementaria 2B. El orden de las líneas con colores específicos es importante. Corta la línea roja primero antes de la línea verde. Corta el azul al final.
    Línea roja: modo Rast/Vest con 45% de potencia láser, 80% de velocidad, 1000 PPI y eje Z de 0,50 mm.
    Línea verde: modo Rast/Vest con 7% de potencia láser, 100% de velocidad, 1000 PPI y eje Z de 0,50 mm.
    Línea azul: modo Rast/Vest con 50% de potencia láser, 80% de velocidad, 1000 PPI y eje Z de 0,50 mm.
  5. Guarde las cintas estampadas correctamente hasta el ensamblaje de SPOT.

4. Ensamblaje 96/384-SPOT (Tiempo: 1 h)

NOTA: En esta sección se detalla el procedimiento para ensamblar dispositivos 96-/384-SPOT en un entorno estéril, como un gabinete de bioseguridad (BSC). Alternativamente, los dispositivos 96-/384-SPOT pueden preensamblarse en un entorno no estéril y luego esterilizarse mediante un proceso de esterilización con gas etileno.

  1. Preparación del andamio SPOT para el montaje
    1. Tome un andamio con patrón de PMMA para 96 o 384 SPOT. Corta el exceso de papel alrededor de la región azul del andamio. Deje 5 mm de espacio en blanco alrededor del perímetro de la región azul. La hoja resultante será de aproximadamente 760 mm x 1300 mm.
      NOTA: No corte la línea de cebado. Es útil para determinar qué lado del andamio es áspero/liso (Figura 3E, F).
    2. Para preparar un andamio 96-SPOT para el montaje, siga el paso 4.1.3. Para preparar un andamio 384-SPOT, siga el paso 4.1.4.
    3. Realice la perforación de espacios entre pozos en el andamio 96-SPOT.
      1. Coloque un trozo de película de polietileno (1000 mm x 1500 mm) sobre un soporte acrílico rígido (2700 mm x 2700 mm). Coloque el soporte cubierto con película de polietileno sobre la superficie de trabajo y coloque el andamio sobre la película de polietileno (Figura 5A).
      2. Alinee un borde de la regla entre las dos primeras filas de modo que el trazado a lo largo de este borde no se trace en un pozo.
      3. Coloque la rueda de trazado contra la regla en la parte inferior del andamio. Gire la rueda de seguimiento hacia arriba hasta la parte superior del andamio, usando la regla para guiar el camino de la hoja. Repita esto para todos los espacios entre hileras en el andamio (es decir, 7x).
      4. Repita los pasos 4.1.3.2 y 4.1.3.3 para cada dos espacios entre columnas, comenzando con el espacio entre las dos primeras columnas.
    4. No realice ninguna perforación de los espacios entre pozos en el andamio 384-SPOT siguiendo los pasos a continuación.
      1. No perfore los espacios entre pozos del andamio 384-SPOT. Continúe directamente con el paso 4.2.
  2. Esterilización de materiales SPOT y equipos de montaje
    1. Coloque el andamio impreso, dos cintas de 96 pocillos (o cintas de 384 pocillos), una placa sin fondo de 96 pocillos (o una placa sin fondo de 384 pocillos), una cubierta de placa de 96 pocillos (o una cubierta de placa de 384 pocillos), una película de policarbonato, una losa de polidimetilsiloxano (PDMS), una bolsa de plástico resellable, unas pinzas y un cuchillo de precisión en el BSC, UV durante 20 min por un lado (Figura 5B).
    2. Voltea todos los materiales y equipos de montaje hacia el otro lado y UV durante otros 20 min.
  3. Fijación del andamio a la primera cinta de 96/384 pocillos
    1. Coloque el andamio con el lado hacia arriba (Figura 3F) sobre la losa PDMS, de modo que las filas corran horizontalmente. Utilice la línea de imprimación para determinar qué lado es rugoso (la línea de imprimación alineada a la derecha indica el lado rugoso hacia arriba).
    2. Alise el andamio sobre la losa PDMS de modo que no haya arrugas ni burbujas en (o debajo) del andamio. Retire la capa protectora del lado no grabado de la cinta de doble cara. Abroche ligeramente el centro de la cinta y alinee las dos columnas centrales de la cinta con el andamio.
    3. Una vez alineado, presione el centro de la cinta hacia abajo. Alise la cinta en el andamio, comenzando desde el medio y moviéndose hacia afuera.
      NOTA: Un andamio alineado incorrectamente tendrá un patrón de PMMA obvio que se superpone en la región de siembra del pozo.
    4. Use las pinzas para quitar con cuidado el andamio de la losa PDMS y almacenar la losa para futuras fabricaciones.
  4. Fijación del andamio a la segunda cinta de 96/384 pocillos
    1. Coloque el andamio en el banco de trabajo. Voltee el andamio de modo que el lado liso (lado no pegado) mire hacia arriba.
    2. Retire la capa protectora central del lado grabado de la segunda cinta. Asegúrese de que las dos columnas centrales de la cinta estén expuestas. Si se utiliza el diseño de cinta no grabada, retire completamente la capa protectora de un lado.
    3. Abroche ligeramente el centro de la cinta y alinee las dos columnas centrales de la cinta con el andamio.
    4. Una vez que la cinta esté alineada con el andamio, presione el centro de la cinta hacia abajo. Si se utiliza el diseño de cinta grabada, retire las otras dos capas protectoras adyacentes a la sección central expuesta de la cinta. Alise la cinta en el andamio, comenzando desde el medio y moviéndose hacia afuera.
  5. Fijación del andamio a la placa sin fondo
    1. Retire la capa protectora de la cinta del lado rugoso del andamio. Si usa el diseño de cinta grabada, retire solo la capa protectora central.
    2. Alinee el andamio con la parte inferior de la placa sin fondo (con tapa). Una vez alineado, presione el centro del andamio sobre la parte inferior de la placa. Si utiliza el diseño grabado, retire las capas protectoras adyacentes al centro expuesto. Alise el andamio en el plato desde el medio hacia afuera.
  6. Fijación del andamio a la película de policarbonato
    1. Con unas pinzas, afloje con cuidado la capa protectora de la película de policarbonato. Una vez suelta, despegue lentamente la capa protectora de la película. No cree hendiduras en la película, ya que afectará sus propiedades ópticas para imágenes de microscopía.
    2. Repita el paso 4.6.1 con el otro lado de la película de policarbonato. Una vez que se hayan eliminado ambas capas protectoras, deje la película a un lado en el banco de trabajo.
    3. Retire la capa protectora de la cinta adherida a la parte inferior de la placa. Presione la película de policarbonato sobre el andamio, comenzando desde el medio hacia afuera.
    4. Presione firmemente la película de policarbonato sobre el fondo de la placa de modo que todos los pocillos obtengan un borde bien pronunciado.
    5. Con un cuchillo de precisión, corte con cuidado el exceso de material del fondo de la placa.
      NOTA: Preste especial atención a no cortar la placa ni ninguno de los pocillos. Si el cuchillo no corta fácilmente, verifique si está cortando la placa.
  7. Almacenamiento de 96/384-SPOT después del montaje
    1. Después de ensamblar completamente 96-SPOT, colóquelo en una bolsa de plástico transparente con cierre. Lleve la bolsa fuera del BSC.
    2. Coloque un soporte acrílico rígido en la parte inferior de la placa. Sujete el soporte acrílico a la placa en esquinas opuestas (Figura 5C). Manténgalo sujeto durante al menos 30 minutos en cada esquina antes de usarlo.
    3. Guarde la placa en un espacio limpio y seco hasta su uso.

5. Clasificación 96/384-SPOT (Duración: 2 h 45 min)

NOTA: Esta sección detalla el procedimiento para sembrar dispositivos 96-/384-SPOT para crear microtejidos 3D uniformes. El proceso de siembra implica la dispensación cuidadosa de un volumen de gel celular definido (por ejemplo, 5 μL para 96-SPOT o 2 μL para 384-SPOT) en el andamio SPOT preensamblado. Para garantizar una infiltración y una distribución uniformes del gel, la gota de gel celular se guía a lo largo de la estructura porosa del andamio a través de la absorción capilar. Este paso se puede realizar manualmente con una micropipeta o automatizado con manipulación de líquidos. Después de la siembra, las placas se incuban a 37 °C para permitir la polimerización en gel y la encapsulación celular.

  1. Preparación de la placa 96/384-SPOT
    1. Suelte la pinza 96-/384-SPOT y retire el soporte acrílico de la parte inferior.
    2. En un BSC, retire SPOT de la bolsa de plástico. Encienda el UV para esterilizar el interior de la placa y cubra durante 20 minutos antes de cerrar la tapa y voltear hacia el fondo de la placa durante otros 20 minutos de tratamiento UV.
    3. Pipetear 70 μL de PBS en cada espacio entre pocillos de la placa 96-SPOT. No pipetee PBS en la placa 384-SPOT. Enfríe la placa a 4 °C durante al menos 30 minutos antes de sembrar.
  2. Preparación de células
    1. Separe las células de los matraces de cultivo u organoides de las cúpulas de gel según el manejo recomendado y cuente la cantidad de células con el hemocitómetro según las instrucciones del fabricante. Tenga en cuenta la densidad celular de la suspensión celular (es decir, el número de celdas por ml) para calcular el volumen de suspensión celular requerido para los pasos 5.4.1-5.4.2 en función de la densidad de siembra deseada.
  3. Preparación del gel
    1. Siguiendo las instrucciones de preparación de hidrogel optimizadas anteriormente 17,19,20,21, cree el hidrogel dispensando 1 ml de colágeno bovino tipo 1 de 3 mg / ml en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
      NOTA: Los componentes y la mezcla resultante deben mantenerse en hielo durante toda la preparación.
    2. Dispense 125 μL de medio esencial mínimo concentrado (MEM) 10x en el colágeno bovino. Pipetea lentamente hacia arriba y hacia abajo para mezclar hasta que la mezcla cambie de rosa a amarillo.
    3. Dispense 8 μL de bicarbonato de sodio 0,8 M en la mezcla de colágeno bovino. Pipetea lentamente hacia arriba y hacia abajo para mezclar hasta que la mezcla se vuelva de color rosa pálido. Use la solución mezclada dentro de los 30 minutos posteriores a la preparación para garantizar una gelificación uniforme en múltiples experimentos.
      NOTA: Si la mezcla permanece amarilla, titule la solución a pH 7 agregando 0,8 M en alícuotas de 0,5 μL hasta lograr un color rosa pálido. OPCIONAL: Siguiendo el mismo procedimiento, se puede preparar gel para cultivos que requieran una mayor concentración de colágeno. Para el cultivo de organoides, utilice la mezcla de hidrogel caracterizada por Landon-Brace et al.17.
  4. Suspensión de células en gel
    1. Dispense el volumen de suspensión celular requerido para la densidad de gel celular objetivo en un tubo de microcentrífuga y centrifugue a 300 x g durante 5 min.
    2. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular en gel (el volumen varía según la concentración objetivo)
  5. Siembra manual de placas 96-/384-SPOT
    1. Coloque el plato 96-/384-SPOT en una bolsa de hielo congelada. Para sembrar 96-SPOT, siga los pasos 5.5.2. Para sembrar 384-SPOT, siga los pasos 5.5.3.
    2. Siembra manual 96-SPOT
      1. Cubra previamente una punta de pipeta de 10 μl con la mezcla de gel celular. Aspire 5 μL de gel con una pipeta de 20 μL y expulse hasta el primer tope hasta que se forme una gota en la punta. Toque la gota en el medio de un pozo.
        NOTA: La expulsión del gel presionando la pipeta hasta el segundo tope puede introducir burbujas de aire. Todos los pocillos deben sembrarse dentro de los 5 minutos para una gelificación constante entre pocillos.
      2. Después de sembrar todos los pocillos deseados, cubra la placa e incube a 37 °C durante 45 min de acuerdo con las instrucciones del fabricante para polimerizar el gel. Dispense 200 μL de medio en cada pocillo sembrado e incube durante un mínimo de 1 hora ininterrumpida antes de cualquier imagen o perturbación requerida.
    3. Siembra manual 384-SPOT
      1. Cubra previamente una punta de pipeta de 10 μl con la mezcla de gel celular. Aspire 2 μL de gel con una pipeta de 10 μL y expulse hasta el primer tope hasta que se forme una gota en la punta.
        NOTA: Se recomienda encarecidamente una pipeta multicanal de 10 μl.
      2. Toque la gota en el medio de un pozo. Después de sembrar todos los pocillos deseados, cubra la placa e incube a 37 °C durante 45 min de acuerdo con las instrucciones del fabricante para polimerizar el gel.
      3. Dispense 60 μL de medio en cada pocillo sembrado e incube durante un mínimo de 1 h ininterrumpidamente antes de cualquier imagen o perturbación requerida.
    4. Siembra 96/384-SPOT con un manipulador de líquidos
      1. Durante la preparación de la mezcla de gel celular, encienda el manipulador de líquidos y su módulo de filtro HEPA a temperatura alta. Rocíe con cuidado etanol al 70% dentro del manipulador de líquidos y límpielo con toallas de papel empapadas en etanol.
      2. Cargue el protocolo de siembra 96-SPOT o 384-SPOT (archivo complementario 5 o archivo complementario 6) antes de realizar la calibración del cabezal de la pipeta. Instale los módulos de temperatura en las ranuras 1 y 4 (Figura 6A).
      3. Para fines de calibración, use cajas designadas de puntas de filtro P20 y P200. Cárguelos en las ranuras 5 y 6, respectivamente (Figura 6B). Calibre el cabezal de la pipeta en función de las indicaciones que se muestran en el software. Después de la calibración, cambie a la caja estéril de puntas de filtro P20 y P200 para sembrar en las ranuras 5 y 6. Vuelva a rociar la superficie con etanol al 70% y cierre la puerta hasta la siembra.
        NOTA: Es esencial calibrar con precisión las puntas en la parte superior de la placa 96-/384-SPOT. Se recomienda usar cinta de sellado de placas para ayudar a visualizar las puntas del eje z en relación con la parte superior de la placa. La posición ideal es cuando las puntas del cabezal multicanal tocan la cinta de sellado de la placa y crean una pequeña abolladura.
    5. Encienda ambos módulos de temperatura y ajústelos a 4 °C mientras las células están en el último paso de giro durante la preparación de la mezcla de gel celular. Después de completar el paso 5.4, cargue la cantidad deseada de mezcla de gel celular en cada tubo de los tubos de PCR de 8 tiras de 0,2 ml dentro del BSC.
      NOTA: El volumen mínimo de mezcla de gel celular que se cargará en cada tubo es: 96-SPOT: 5 μL multiplicado por el número de columnas que se deben sembrar más el volumen muerto; 384-SPOT: 2 veces 2 μL multiplicado por el número de columnas que debían sembrarse veces y luego más el volumen muerto. Se recomienda que el volumen muerto sea de alrededor de 10 a 20 μL por tubo para evitar burbujas y columnas incompletas hacia el final.
    6. Cierre los tubos de PCR de 8 tiras de 0,2 ml con las tapas planas de 8 tiras antes de transferir la mezcla de gel celular fuera del BSC en hielo.
    7. Cargue la placa SPOT preenfriada en el módulo de temperatura en la ranura 4 con el bloque de formato de placa de fondo plano (Figura 6B).
    8. Cargue los tubos de PCR de 8 tiras de 0,2 ml con la mezcla de gel celular en el módulo de temperatura en la ranura 3 con el bloque de formato de 96 pocillos.
    9. Abra las tapas planas y la tapa de la placa SPOT y guárdelas dentro del manipulador de líquidos, pero lejos de las ranuras utilizadas. Abra la tapa de la caja de la punta del filtro P20 y P200.
    10. Ejecute el protocolo. Después de sembrar todos los pocillos deseados, cubra la placa e incube a 37 °C durante 45 min de acuerdo con las instrucciones del fabricante para polimerizar el gel.
    11. Dispense 200 μL o 60 μL (96-/384-SPOT) de medio en cada pocillo sembrado e incube durante un mínimo de 1 h ininterrumpidamente antes de cualquier imagen o perturbación requerida.

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Resultados

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El patrón de PMMA del andamio de papel sirve como una barrera física para evitar el intercambio de contenido entre pozos. Este diseño es fundamental para garantizar que los pozos adyacentes permanezcan química y biológicamente aislados, evitando la difusión involuntaria de medios, medicamentos, factores secretados o incluso células14. La incorporación de PMMA permite una compartimentación precisa, lo que convierte a SPOT en una plataforma confiable para estudios de detección y cocultivo de alto re...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este protocolo, se proporciona una guía detallada para la fabricación y el uso de SPOT de 96 y 384 pocillos, que cubre el ensamblaje, el manual y la siembra de gel celular asistida por manipulador de líquidos. A diferencia de los sistemas tradicionales de tapones de hidrogel, SPOT elimina los artefactos relacionados con el menisco, lo que facilita la obtención de imágenes in situ no destructivas de los organoides, como se describió anteriormente 14,16,22.

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen la ayuda de Jennifer Lam en la adquisición de imágenes. La Figura 1, la Figura 2 y la Figura 7A se crearon con BioRender.com. Este trabajo fue apoyado por la subvención Discovery del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) (subvención #RGPIN-2021-03488) a A.P.M.; el programa de Grandes Preguntas de Medicina por Diseño de Excelencia en Investigación de Canadá (CFREF) a A.P.M.; las Becas de Posgrado de NSERC Canadá - Programa de Doctorado a R.C.; el Premio de la Fundación Caritativa Peterborough K.M. Hunter a R.C.; la beca CRAFT del Consejo Nacional de Investigación (NRC) otorgada a N.T.L.; el NSERC CREATE TOeP a N.T.L.; el Premio de Investigación para Estudiantes de Pregrado de NSERC a Z. K.; y el Premio a la Excelencia de la Universidad de Toronto a CMT.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de PCR de 0,2 ml (tiras de 8)Sarstedt72.985.002
Tubo de centrífuga de 1,5 mlFroggaBioLMCT1.7B
1000-μ Puntas de pipeta LEclipse4-1019-260-000
Pipetas serológicas de 10 mlFroggaBio394010
Jeringa de 10 mlBD, Canadá302995
10x Medio esencial mínimo (MEM 10x)Gibco11430030
Plato de 150 mmCorning430599
Puntas dispensadoras de calibre 16 con conexión Luer lockMcMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos6699A2
20µ Gradillas de puntas de filtro LOpentrones999-00099
200µ Gradillas de puntas de filtro LOpentrones999-00081
200-μ Puntas de pipeta LEclipse4-1030-260-000
Puntas de dosificación de calibre 20 con conexión Luer lockMcMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos6699A4
Placa sin pocillos de 384 pocillos (negra)Greiner82051-544
Jeringa de 3 ml BD, Canadá309657
Tubo de centrífuga cónico de polipropileno de 50 mlVWRCA21008-940
Tubo de centrífuga cónico de polipropileno de 50 mlVWRCA21008-940
Placa sin pocillos de 96 pocillos (negro)Greiner82050-714
AcetonaFisher ScientificA18-1
Balanza analíticaN/AN/A
Extensión de AxiDraw para Inkscape (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)N/AN/A
API de Python de AxiDraw (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation) N/AN/A
AxiDraw V3 Máquina de dibujo y escritura personal de alto rendimientoCientíficos Locos Malvados, EE. UU.N/A
Colágeno bovino (PureCol 3 mg/ml)BioMatrix avanzada5005
Línea celular de elecciónN/AN/A
Caballete de clip (incluido en el paquete AxiDraw V3)Científicos Locos Malvados, EE. UU.N/A
Medios culturales de elecciónN/AN/A
Cinta de protección que atrapa la suciedad3M6851 PN36851
Cinta adhesiva poliacrílica de doble cara (800 mm x 1200 mm)Investigación de adhesivos, ARcare90106NB
Suero fetal bovino (FBS)Gibco12483-020
Filtros de té Finum XL Riensch & Held GmbH & Co. KG, Hamburgo, Alemania420.69.00
Tapones planos para tubos de PCR de 0,2 ml (tiras de 8)Sarstedt65.989.002
Abrazaderas de resorte de plástico de alta resistenciaPUNTO DE REFERENCIA1024-554
Módulo HEPA – Modelo de 110-130 V y 60 HzOpentrones999-00109
Bolsa de hielo (congelada, 1400 mm x 1800 mm)N/AN/A
Software InkscapeN/AN/A
Cortadora láserSistema láser universalVLS3.75
Tubo de acetato de vinilo (EVA) en miniatura de 0.07 pulgadas de diámetro exteriorMcMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos1883T3
Pipeta electrónica multicanal P20 (Gen2)Opentrones999-00005
Pipeta electrónica multicanal P300 (Gen2)Opentrones999-00006
EsmalteSally HansenSBS-006861Opcional, para la pigmentación de tinta PMMA
Opentrons OT-2Opentrones999-00111
Pipeta P1000GilsonFA10006M
Pipeta de 8 canales P200GilsonF144072
Pipeta P200GilsonFA10005M
Toallas de papelN/AN/A
ParafilmCompañía Bemis, Inc.52859-079
Papel pergamino   N/AN/A
Pipetas PasteurVWR14672-380
Penicilina-estreptomicina (P/S)Sigma-AldrichP4333
Poli(metacrilato de metilo) (PMMA)Sigma-Aldrich182230
Película de policarbonato (760 mm x 1300 mm)McMaster-Carr85585K102
Monómero de polidimetilsiloxano y reticulante (PDMS, 1500 mm x 2700 mm)Adhesivos Ellsworth4019862
Cuchillo de precisiónN/AN/A
Soporte acrílico rígido (tamaño ajustado a la parte inferior de la placa de pocillos)McMaster-Carr8560K239
Soporte de cartón rígidoN/AN/A
GobernanteN/AN/A
Tijeras N/AN/A
Bicarbonato de sodio (0,8 M en agua destilada)Sigma-AldrichS6014
Cubierta de temperatura con bloques de aluminio (Gen2)Opentrones999-00097
Rueda de trazado HEEPDD (Amazonas)B07YQWB284
Cinta transparente N/AN/A
Azul de tripanoGibco15250-061
TripsinaGibco25200-056
PinzasN/AN/A
Mezclador de vórtice N/AN/A

Referencias

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  1. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16 (3), 5517-5527 (2015).
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