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Artículo de método

Un modelo de rechazo de injerto de rata para trasplante intestinal con ileostomía exteriorizada para la evaluación del pronóstico longitudinal

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DOI:

10.3791/68412

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10 de junio de 2025

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1Department of Pediatric Surgery, Graduation School of Medicine, The University of Osaka, 2Department of Stem Cell Therapy Science, Graduate School of Medicine, The University of Osaka

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un modelo de trasplante intestinal basado en ratas con ileostomía para la evaluación de la evolución temporal de la intervención farmacológica en el rechazo del injerto.

Resumen

Hasta la fecha, el trasplante de órganos sigue siendo el tratamiento principal para la insuficiencia orgánica. Entre los diversos órganos sólidos, el pronóstico de los pacientes tras el trasplante intestinal sigue siendo insatisfactorio, principalmente debido al rechazo del injerto. Este reto requiere una mayor mejora de las técnicas quirúrgicas o el desarrollo de nuevas intervenciones farmacológicas postquirúrgicas. Este artículo presenta un modelo de rata de rechazo del injerto de trasplante intestinal para que sirva de plataforma para este tipo de investigaciones. Un segmento del íleon aislado de la cepa Fischer 344 (F344) se injertó en una rata Lewis (LEW), seguido de la administración de tacrolimus a una dosis y un horario definidos. Se construyó una ileostomía exteriorizada para permitir la monitorización longitudinal no invasiva del estado tisular del aloinjerto. Se entrenó un modelo de regresión lineal tricromática utilizando imágenes de ileostomía y se utilizó para construir un esquema de evaluación basado en imágenes capaz de evaluar el estado de la ileostomía en una escala de 0 a 10. La evaluación indicó un deterioro de la salud del aloinjerto a partir de la tercera semana después del trasplante. Los análisis histológicos del aloinjerto confirmaron signos de rechazo crónico a partir del día postoperatorio (POD) 28 en adelante, similares a los observados en pacientes humanos, y validaron los resultados de la evaluación de imagen de ileostomía no invasiva. Se espera que el modelo de aloinjerto intestinal y los métodos de evaluación asociados presentados aquí faciliten el desarrollo de tratamientos para el trasplante intestinal.

Introducción

La insuficiencia orgánica es una afección en la que uno o más órganos vitales funcionan de manera subóptima y no pueden mantener la salud. La demora en la atención médica suele ser mortal o se asocia a complicaciones secundarias, como infecciones1. Para la mayoría de los órganos, el reemplazo del órgano que funciona mal es la única opción viable para una recuperación prolongada. Desde el descubrimiento de la readquisición de la madre por las células somáticas2, se ha postulado que estas células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) pueden permitir la organogénesis completa y proporcionar una fuente prácticamente ilimitada de órganos para el reemplazo. Al combinar el conocimiento del desarrollo embrionario con un control cuidadoso de las señales de señalización, se ha logrado el éxito en la generación de múltiples tejidos a escala de organoides. Para la generación de órganos a gran escala, aunque recientemente se han realizado avances significativos en órganos específicos como los ojos 3,4, el alotrasplante de donantes humanos sigue siendo el enfoque principal para la mayoría de los órganos vitales.

Entre los órganos internos, el trasplante intestinal continúa mostrando resultados pronósticos insatisfactorios y requiere un mayor refinamiento quirúrgico o intervención farmacológica5. Las intervenciones novedosas rara vez se prueban directamente en sujetos humanos y, a menudo, se evalúan primero en modelos animales de trasplante intestinal. El presente artículo detalla un modelo de rata de rechazo de injerto intestinal para que sirva como plataforma de evaluación de estos posibles avances terapéuticos.

Para imitar el sutil desajuste del antígeno leucocitario humano (HLA) observado en los seres humanos, se trasplantó un segmento de íleon masculino y de sexo emparejado aislado de una rata Fischer 344 (F344) a una rata Lewis (LEW), seguido de la administración de dosis subóptimas del inmunosupresor tacrolimus durante la fase aguda para inducir el rechazo del injerto en la fase crónica. Este par donante-receptor comparte los mismos loci del complejo principal de histocompatibilidad, pero difiere en los antígenos menores de histocompatibilidad6. En este método, una porción de la mucosa injertada se exteriorizó como una ileostomía para permitir el seguimiento visual en el tiempo del pronóstico del trasplante y el estado de rechazo. Además, se presenta un método complementario basado en imágenes de ileostomía para la cuantificación del estado de rechazo, validado por los cambios histológicos correspondientes en el injerto trasplantado.

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Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Graduados de Medicina de la Universidad de Osaka, bajo el número de referencia 04-018-003 y se realizaron de acuerdo con las directrices de la Universidad de Osaka. Se utilizaron ratas Lewis macho (LEW) receptoras (de 200-250 g, 7-9 semanas de edad) y ratas macho donantes Fischer 344 (F344) (de 200-250 g, 10-12 semanas de edad). Antes de la cirugía, el área abdominal se afeitó y esterilizó con etanol al 70%. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cirugía de donante

  1. Ayuna a la rata donante durante 12 h antes de la cirugía.
  2. Anestesiar a la rata donante con isoflurano inhalado (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Coloque la rata perpendicular al operador. Ajuste el microscopio estereoscópico a un aumento de 5x durante el procedimiento. Use seda 5-0 para la ligadura.
    NOTA: El caudal de isoflurano fue de 1,5 L/min. El isoflurano se administró al 2,5% durante la incisión abdominal inicial y se mantuvo al 1,5% durante la cirugía. La anestesia adecuada fue confirmada por la ausencia de reflejo del dedo del pie al pinzar del dedo del pie. Si es necesario, aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad después de confirmar la anestesia.
  3. Realizar una incisión de 8 cm en la línea media para abrir la cavidad abdominal. Extienda la incisión superior hasta la apófisis xifoides para garantizar una visualización clara de la vena porta (PV).
  4. Diseccionar el ligamento de Treitz y rotar el intestino delgado 180 grados en el sentido de las agujas del reloj para invertir la rotación intestinal.
  5. Observar las asas vasculares mesentéricas y seleccionar un sitio de injerto bien vascularizado, de aproximadamente 10 cm de longitud desde el íleon (Figura 1A1).
  6. Diseccionar el mesenterio distal y ligar la arteria mesentérica superior (AME) y la vena mesentérica superior (VMS) del íleon distal. Asegúrese de que la AME/SMV esté separada de la ligadura proximal. Una ligadura inadecuada puede causar sangrado y comprometer la perfusión del injerto.
  7. Desplazar el estómago y el bazo cranealmente para exponer claramente la VP.
  8. Diseccionar y ligar la arteria/vena del colon medio y la arteria/vena del colon derecho, ubicadas en el lado izquierdo de la AME/SMV.
  9. Diseccionar el mesenterio en el lado derecho de la AME/SMV y ligar la rama yeyunal. Evite ligar demasiado cerca del SMV para evitar que se doble (Figura 1A2).
  10. Separe suavemente la base de la AME con un bastoncillo de algodón y lige el mesenterio entre la aorta por encima de la AME y la VP. Esta área contiene los ganglios linfáticos mesentéricos superiores y numerosos vasos linfáticos.
  11. Identificar y ligar la arteria renal derecha, ubicada en el lado derecho de la aorta (Figura 1A3).
  12. Inyectar solución salina heparinizada (200 U/2 mL) en la vena del pene.
  13. Determinar la longitud final del injerto y ligar el exceso de ramas mesentéricas. Ligar arterias rectas en los extremos proximal y distal del injerto.
  14. Lime la aorta por debajo de la AME, luego lige la aorta por encima de la AME y extirpe la base de la AME junto con un parche circular de la aorta. Cortar la vena porta en el hilio hepático, asegurando un corte oblicuo para crear una gran abertura anastomótica.
    1. Proceda a cortar las asas vasculares proximales y distales y el intestino. Colocar el injerto extraído en suero fisiológico frío (4 °C) (Figura 1A4).
  15. Retirar la ligadura aórtica proximal para inducir la exanguinación y sacrificar a la rata donante (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).

2. Procesamiento de injertos

  1. Identificar la arteria mesentérica superior (AME) y la vena porta (VP).
  2. Perfundir suavemente el injerto con 15 mL de solución salina fría a través de la AME (Figura 1B1). Confirme que se reemplaza toda la sangre y que el color del injerto se vuelve pálido o blanco.
  3. Lave la luz del injerto intestinal y elimine el contenido fecal.
  4. Mantenga el injerto sumergido en solución salina fría fresca hasta el trasplante.

3. Cirugía del receptor

  1. Anestesiar a la rata receptora con isoflurano inhalado (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Coloque la rata perpendicular al operador.
    1. Ajuste el microscopio estereoscópico a 5× para procedimientos generales y a 12,5× durante la anastomosis vascular. Usar seda 5-0 para la ligadura y 8-0 Sutura de polipropileno sintético para anastomosis vascular. Coloque la rata sobre una almohadilla térmica para evitar la hipotermia durante la operación.
      NOTA: El caudal de isoflurano fue de 1,5 L/min. El isoflurano se administró al 2,5% durante la incisión abdominal inicial y se redujo al 1,5% durante la cirugía. La anestesia se confirmó por la ausencia de reflejo del dedo del pie después de un pinzamiento del dedo del pie. Si es necesario, aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad después de la confirmación de la anestesia.
  2. Antes de la cirugía, inyectar 0,5 mg/kg de tacrolimus por vía intramuscular. Haga una incisión en la línea media (~5 cm) y abra la cavidad abdominal.
  3. Mueva el intestino y el colon cranealmente y diseccione el ligamento de Treitz. Envuelve el intestino y el colon en una gasa húmeda y colócalos sobre el cuerpo de la rata.
  4. Diseccionar el peritoneo sobre la vena cava inferior (VCI) y la aorta (Figura 1B2). Identificar y ligar la arteria y la vena gonadal derecha. Localiza el uréter correcto.
  5. Gire la rata 90° en sentido contrario a las agujas del reloj para que la cabeza mire hacia la izquierda del operador. Pinza la VCI por encima de la vena renal derecha con una pinza vascular Bulldog curva.
  6. Haga una incisión en la pared de la VCI con unas tijeras para crear una abertura ovalada. Enjuague con solución salina y coloque una sutura de soporte en el borde caudal de la VCI (Figura 1B3-1). Asegúrese de que la abertura anastomótica venosa sea grande (~ 1 cm) y estire la pared VP adecuadamente en la anastomosis.
  7. Coloque el injerto en el lado izquierdo de la rata, colocando la PV y la AME cerca de la VCI y la aorta. Orienta el íleon distal hacia la cabeza. Envuelva el injerto en una gasa fría y húmeda y aplique hielo para mantener una temperatura baja.
  8. Pasar la aguja de sutura de estancia (sutura de polipropileno sintético 8-0) a través del borde caudal del PV. Use una pinza para mosquitos para controlar la tensión de la sutura.
  9. Suturar y atar el borde craneal de la VP a la VCI (VP a VCI). Anastomosa de la pared posterior de la VP (IVC a VP) (Figura 1B3-2). Ate la sutura del tirante en el borde derecho del PV. A continuación, anastomosa la pared anterior de la VP (PV a la VCI).
    1. Antes de completar la anastomosis, pinzar el injerto PV e inyectar solución salina heparinizada. Ate la sutura y suelte la pinza IVC (Figura 1B3-3).
      NOTA: Puede producirse un sangrado inicial en la anastomosis, pero normalmente se controla de forma espontánea.
  10. Pinza la aorta por encima de la bifurcación de la arteria ilíaca con una pinza Bulldog curva.
  11. Incisión en la pared aórtica. Colocar una sutura de tirante (sutura de polipropileno sintético 8-0) en el borde craneal de la aorta y la AME (~4-5 mm) (Figura 1B4-1). Sujete la sutura del tirante con una pinza antimosquitos para controlar la tensión.
  12. Pasa otro 8-0 aguja a través del borde caudal de la AME y la aorta. Ate y comience la anastomosis en el lado derecho de la rata (Figura 1B4-2). Ata la sutura del tirante.
  13. Gire la rata 180° para que la cabeza mire hacia la derecha del operador. Complete la anastomosis de la AME a la aorta en el lado izquierdo. Antes de la sutura final, pinzar el injerto PV e inyectar solución salina heparinizada. Amarre la sutura (Figura 1B4-3).
  14. Suelte las pinzas aórticas y VP para la reperfusión (Figura 1B5). Puede producirse un sangrado inicial, pero puede controlarse con una presión suave con un bastoncillo de algodón. La mucosa del injerto debería volverse rosada en cuestión de minutos (Figura 1B6).
  15. Gira la rata 90° para que la cabeza mire hacia el lado opuesto. Realizar dos incisiones cutáneas de 8 mm en el abdomen derecho y exteriorizar los extremos proximal y distal del injerto ileal.
    1. Suturar la piel e injertar serosa con polidioxanona 5-0 (PDS) (Figura 1B7). Cierre la incisión de la línea media con PDS 5-0 para completar la cirugía.
      NOTA: Las ratas postoperatorias deben ser monitoreadas cuidadosamente hasta la recuperación completa de la conciencia. No regrese a la jaula hasta que se logre la decúbito esternal.

4. Manejo postoperatorio

  1. Para mantener el injerto durante la fase aguda, inyectar tacrolimus a 0,5 mg/kg por vía intramuscular en los días postoperatorios (POD) 1-13, 20 y 277.
    NOTA: Administre inyecciones consecutivas en piernas alternas. Alternativamente, el tacrolimus puede administrarse por vía subcutánea.
  2. Inyectar meloxicam a 0,4 mg/kg por vía subcutánea en POD 1-3.
    NOTA: Las ratas receptoras suelen perder peso hasta el POD 7, con recuperación hasta el POD 14. Se pueden administrar inyecciones subcutáneas de solución salina para mitigar la deshidratación debida a la pérdida de líquido de la ileostomía. La mortalidad inesperada ocurre en aproximadamente el 20% de los casos antes de la POD 7. La supervivencia y la salud general suelen ser estables a partir de entonces.

5. Evaluación por imagen del estado de salud del injerto intestinal

  1. Abra una imagen de la ileostomía en ImageJ. Convierta la imagen en una pila RGB seleccionando Tipo de > de imagen > pila RGB.
    NOTA: Si la imagen aún no está en formato RGB, primero conviértala a color RGB usando Tipo de imagen > > Color RGB.
  2. Seleccione una región de interés (ROI) que incluya solo el área mucosa visible de la ileostomía.
  3. Mide la intensidad de cada canal (Rojo, Verde y Azul) dentro del ROI seleccionado.
  4. Calcule la puntuación de salud del injerto utilizando la siguiente fórmula:
    Puntuación = figure-protocol-1
    NOTA: Normalice la puntuación final de modo que: Si Puntuación > 10, asigne un valor de 10; Si Puntuación < 0, asigne un valor de 0.

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Resultados

En la Figura 1 se muestran imágenes representativas de los puntos de control quirúrgicos clave. La tasa de éxito de la reperfusión fue de casi el 100% y la tasa de supervivencia postoperatoria fue del 80,0% (20 de 25 cirugías). Cuando los procedimientos se realizaron correctamente y el tacrolimus se administró en la dosis y el horario especificados, la ileostomía exteriorizada generalmente se volvió blanquecina, una indicación de rechazo del injerto, a partir de la tercera semana después de ...

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Discusión

Si bien los estudios en animales son esenciales para el desarrollo de mejores intervenciones quirúrgicas y farmacológicas para obtener mejores resultados a corto y largo plazo del trasplante intestinal, ha sido empíricamente difícil establecer la técnica de cirugía de trasplante intestinal en ratas. Aquí se describen en detalle los procedimientos quirúrgicos del trasplante intestinal heterotópico. En este método, los tiempos de operación del donante y del receptor fueron de aproximadamen...

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Divulgaciones

Ka.T. es fundadora científica, accionista y recibió fondos de investigación de StemRIM Inc. Todos los demás autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

El Centro de Investigación y Educación Médica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Osaka proporcionó los instrumentos necesarios para la obtención de imágenes microscópicas confocales de los aloinjertos. El trabajo fue apoyado por un fondo de investigación de StemRIM a Ka.T.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
5-0 seda trenzada 40cm negro Alfresa Pharma62-9965-34
5-0 seda trenzada 40cm blanco Alfresa Pharma62-9964-99
8-0 PROLENE BV130-5 45cmETICÓNEP8730H
Alexa Fluor 594 cabra anti-ratón IgG (H + L)InvitrogenReferencia A11005Contacto de trabajo: 2ug/ml
Alexa Fluor 647 cabra anti-conejo IgG (H + L)InvitrogenReferencia A21245Contacto de trabajo: 2ug/ml
Portaagujas Barraquer Micro, mandíbula CVD de 8mm, 6"
Pinza vascular Bulldog 35mmNatsumeC-42-S-2
Fischer 344 (F344)   Japón SLC (Shizuoka, Japón)donante, macho, de 10 a 12 semanas de edad
Ratas Lewis (LEW) Japón SLC (Shizuoka, Japón)Receptores, hombres, de 7 a 9 semanas de edad
MicrotijerasYDMCC06C
Pinzas de sutura para microcirugía - Curvas, plataformas, mangos redondos: 15 cm/6 in
Ms mAb a colágeno IabcamAB90395Contacto de trabajo: dilución 1000x
SASOLUCIÓN NORMAL 500 mLOTSUKA Referencia: 3311401A8024
Pinza doble vascular de plásticoCapacitación en microcirugía ltd
Prograf inyectable 5 mgAstellas Pharma3999416A1028
Rb pAb a lamininaabcamAB11575Contacto de trabajo: 2ug/ml
Anestesista de animales pequeñosMuromachi kikaiMK-A100
Microscopio quirúrgico OPMI-1FRCarl ZeissOPMI-1FR
SUTURA, 5/0 18 PDS II CLR MONO P, VAETICÓNZ493G

Referencias

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