Construcción de microarrays tisulares a base de pegamento para la investigación de tumores y enfermedades

Summary

Este protocolo describe una producción de bajo costo y un método de validación eficiente para la construcción de TMA a base de pegamento, proporcionando una plataforma de diagnóstico patológico conveniente para la investigación de tumores y enfermedades.

Abstract

La tecnología de microarrays tisulares (TMA) es una plataforma de alto rendimiento para la detección y el análisis simultáneos de múltiples muestras de tejido, lo que facilita la investigación eficiente de biomarcadores de tumores y enfermedades. Sin embargo, los métodos convencionales de construcción de TMA a menudo enfrentan limitaciones como la complejidad operativa, los procedimientos que consumen mucho tiempo y la precisión variable. Se desarrolló un método de construcción TMA basado en pegamento para superar estos desafíos, ofreciendo una mejor fijación del núcleo del tejido y una mayor estabilidad estructural. La validación sistemática incluyó evaluación histológica (tinción de HE), perfil inmunohistoquímico de proteínas diana y análisis de hibridación fluorescente in situ (FISH). Los resultados demostraron que el método basado en pegamento mantuvo una excelente integridad de corte, mejoró la relación señal-ruido y aseguró una reproducibilidad constante de lote a lote. Aunque el enfoque se limita a la operación manual, presenta una opción confiable y rentable para la producción de TMA de rendimiento moderado. Este método es particularmente adecuado para entornos de investigación que valoran la flexibilidad y la diversidad de muestras sobre la automatización a gran escala, ampliando la utilidad de TMA en entornos académicos y de diagnóstico.

Introduction

Tissue Microarray (TMA) es una técnica de alto rendimiento para analizar muestras de tejido ^1,2,3. Se obtienen múltiples núcleos de tejido donante y los bloques de parafina del donante se transfieren a bloques de tejido receptor para un análisis molecular diferencial y comparativo simultáneo en las mismas condiciones de rendimiento ^2,4. La forma clásica de construir un microarray tisular (TMA) es usar un orificio para extraer núcleos de tejido de una muestra de tejido donante y colocarlos secuencialmente en un bloque de parafina receptor. Este método es adecuado para bloques de parafina de donantes de profundidad similar y permite el análisis eficiente de múltiples muestras en una sola rebanada, mejorando en gran medida la eficiencia del estudio y la consistencia de los datos ^5,6,7. Sin embargo, este método aún posee ciertas limitaciones, incluido el manejo inadecuado del núcleo del tejido durante el proceso de inclusión, lo que puede resultar en una tinción inconsistente de las muestras en análisis posteriores⁸.

El segundo método de construcción de TMA es el método de cinta ^9,10. Este método invierte el proceso de construcción mediante la fundición del bloque alrededor de núcleos verticales invertidos que, una vez terminados, están al ras con la parte superior del TMA, independientemente de la longitud del núcleo^11,12. Sin embargo, este método requiere garantizar la colocación adecuada del núcleo de tejido y la eficacia de la cinta, y también limita el número de muestras que se pueden procesar en comparación con las técnicas tradicionales.

Este estudio propone un método innovador de pegamento para la construcción de TMA, con el objetivo de resolver problemas como la estabilidad insuficiente de los núcleos tisulares y la operación compleja que existen en las técnicas tradicionales¹³. Este método utiliza pegamento para fijar con precisión múltiples núcleos de tejido y tiene las ventajas de una operación simple y una fuerte firmeza de la muestra. En comparación con los métodos tradicionales de corte o cinta, el método de pegamento puede aumentar la tasa de retención de los núcleos de tejido y reducir los costos. Este método es aplicable a estudios clínicos con un tamaño de muestra medio y es particularmente adecuado para diseños de investigación que requieren un ajuste flexible del plan experimental. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la capacidad de procesamiento de este método no satisface las demandas de rendimiento ultra alto⁹. Mientras tanto, en el proceso de solicitud real, se debe establecer un conjunto completo de normas de operación estandarizadas y sistemas de control de calidad. Los operadores deben recibir capacitación sistemática y aprobar evaluaciones profesionales para garantizar la estandarización de las operaciones técnicas y la repetibilidad de los resultados. Un análisis exhaustivo indica que esta tecnología logra un buen equilibrio entre flexibilidad operativa, rentabilidad y fiabilidad técnica, y es especialmente adecuada para escenarios de investigación en los que los recursos son limitados pero aún debe garantizarse el control de calidad.

Protocol

Todos los bloques de donantes se obtuvieron de muestras patológicas de archivo recolectadas entre 2016 y 2018 en el Hospital Popular Afiliado Huai'an No.1 de la Universidad Médica de Nanjing. Las muestras se anonimizaron antes de su uso y se procesaron de acuerdo con los protocolos aprobados (el comité de ética del Hospital Popular Afiliado Huai'an No.1 de la Universidad Médica de Nanjing, KY-2024-250-01).

1. Evaluación y etiquetado del tejido del donante

1. Seleccione bloques de tejido con un grosor de ≥5 mm y un área de ≥15 mm × 15 mm. Asegure un margen de seguridad de 2 mm en los bordes y excluya las regiones que presenten necrosis, hemorragia o calcificación para mantener la integridad del tejido.
2. Identificación y marcado de la zona objetivo
   1. Evalúe las secciones teñidas con H&E con un microscopio óptico. Localice el área objetivo a través de un escaneo de baja potencia, luego cambie a alta potencia para confirmar las características morfológicas celulares. Marque los límites del área de destino en las diapositivas.
   2. Asigne las coordenadas del área seleccionada a la superficie del bloque de parafina para completar la conversión de marcado.

2. Extracción del núcleo del tejido

1. Preparación de punciones y pretratamiento de muestras
   1. Seleccione una perforadora manual de 2 mm de diámetro y confirme la suavidad de su filo y la facilidad de manejo.
   2. Colocar el bloque de parafina donante en una plataforma fría a 4 °C durante 15 min.
2. Alinee la aguja verticalmente con el punto marcado y aplique una presión de rotación constante para alcanzar la profundidad límite. Evite inclinarse o vibrar durante el proceso⁷ (Figura 1A).
3. Gire suavemente la aguja en sentido contrario a las agujas del reloj (≤2 rotaciones/s) para retirarla. Expulse con cuidado el núcleo de tejido de la aguja y transfiéralo a un pocillo individual de una placa de 96 pocillos preenfriada. Registre la ubicación del núcleo en cada pozo (Figura 1B).
   NOTA: Si la parte inferior del núcleo del tejido es desigual, nivele con una cuchilla. Después de recortar, vuelva a verificar la integridad.
4. Registre previamente todos los números de donantes y las posiciones correspondientes de los pocillos de placa ELISA (A1-H12) en el formulario de registro. Durante la operación, vuelva a verificar para garantizar una correspondencia estricta entre el número de donantes y las posiciones de los pocillos.
5. Inspeccione inmediatamente los núcleos para verificar su integridad. Deseche los núcleos que estén fracturados, doblados o que presenten desviaciones de diámetro >0,1 mm.
   NOTA: Asegure la consistencia de la longitud del núcleo (coeficiente de variación, CV ≤5%) y evite arañazos superficiales o artefactos de compresión.

3. Fijación del núcleo del tejido

1. Use un marcador impermeable para dibujar una cuadrícula directamente en la superficie del molde, asegurando líneas claras y espaciadas uniformemente.
   1. Utilice un molde estándar con un área inferior efectiva de 3,0 cm × 2,5 cm y reserve un área límite en blanco de 1,5 mm en cada lado.
   2. Utilice un marcador impermeable de punta fina de 0,5 mm para dibujar nueve líneas paralelas igualmente espaciadas horizontal y verticalmente, formando una cuadrícula de posicionamiento de 9 × 9 (81 puntos de intersección en total).
      NOTA: Antes de comenzar, limpie el interior del molde con un hisopo de algodón empapado en xileno para eliminar la parafina residual, que puede causar delaminación. Durante el proceso de dibujo, use una regla de acero para garantizar un grosor de línea uniforme y puntos de intersección claramente distinguibles.
2. Utilice una pipeta para extraer 5 μl de pegamento y colóquela suavemente en el centro del portaobjetos preetiquetado para formar una sola gota. Utilice inmediatamente pinzas finas para recoger verticalmente el núcleo del tejido en un ángulo de 90° y presiónelo lentamente verticalmente en la gota de pegamento (Figura 1C).
3. Inserte los núcleos en las intersecciones de cuadrícula correspondientes en el molde con unas pinzas. Aplique una presión suave durante 5 s para garantizar una adhesión segura (Figura 1D).
4. Si el núcleo del tejido se desplaza, ajústelo y vuelva a colocarlo inmediatamente con pinzas finas antes de que el pegamento se solidifique (dentro de los 30 s). Deseche los núcleos solidificados y desalineados para mantener la calidad de la preparación y conservar al máximo las muestras valiosas.

4. Instalación de casetes e inclusión de parafina

1. Coloque verticalmente el casete de tejido sobre el molde de acero, asegurando el contacto con las puntas del núcleo sin aplicar compresión. Asegure el casete con abrazaderas magnéticas en las cuatro esquinas y selle las costuras con parafina fundida.
2. Infundir parafina fundida en un ángulo de 45° en zigzag, manteniendo un caudal de 1 ml/s. Asegúrese de que el nivel de parafina exceda las puntas del núcleo en 2 mm (Figura 1E).
3. Enfríe rápidamente el bloque en una placa fría a 4 °C durante 5 minutos para formar una capa de soporte rígida. Transfiera el bloque a un ambiente de 22 °C durante 20 minutos para reducir el estrés interno. Finalmente, use una pistola de calor a 40 ° C para alisar suavemente la superficie y eliminar las marcas de contracción.
4. Caliente ligeramente la parafina para ablandarla, luego corte con cuidado a lo largo de los bordes del casete para aflojar el bloque. Levante suavemente el casete y retire cualquier parafina residual para garantizar la integridad de los núcleos de tejido (Figura 1F).

Results

En el presente estudio, se construyeron microarrays de tejido de alta calidad utilizando el método de pegamento. Para verificar la efectividad del método, se realizaron una serie de experimentos, incluida la tinción de H&E, la detección inmunohistoquímica de proteínas específicas y el análisis de hibridación fluorescente in situ (FISH). Un componente crítico del proceso de construcción es la presencia de puntos centrales de tejido en las posiciones esperadas y distancias entre sí, que se evalúa mediante insp...

Discussion

Como método innovador para construir microarrays de tejidos (TMA), el método de pegamento ha demostrado ventajas significativas debido a su facilidad de procedimientos de construcción y rentabilidad. En comparación con el método tradicional de matriz de agujas, que se basa en instrumentos sofisticados^14,15, el método de pegamento permite la fijación de muestras mediante pegamento, que se puede realizar solo con herramientas básic...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de detección de cáncer de mama HER2	Anbiping	2502001	Kit de detección de cáncer de mama HER2
Anticuerpo CDHR4	Abcam	ab166914	Anticuerpo CDHR4
Anticuerpo CDK1	Abcam	ab265590	Anticuerpo CDK1
Anticuerpo CRTAC1	Abcam	ab254691	Anticuerpo CRTAC1
DNASE1L3 anticuerpo	Abcam	ab203669
Máquina de inclusión de anticuerpos DNASE1L3 Máquina de inclusión	P.S.J MEDICAL	BM450A	Deshidratador
de tejidos totalmente automático	Leica Biosystems	ASP3005	Deshidratador de tejidos totalmente automático
Portaobjetos de microscopio de vidrio Citotest		250124A1	Portaobjetos de microscopio de vidrio
Pegamento	TIZO	200	Pegamento
GPR146 anticuerpo	Abcam	ab117104	anticuerpo GPR146
anticuerpo IGSF10	Abcam	ab197671	anticuerpo IGSF10
anticuerpo ITIH1	anticuerpo Abcam	ab233032	anticuerpo ITIH1
Cuchillas de micrótomo de perfil bajo	Thermo Fisher	3052835	Cuchillas de micrótomo de perfil bajo
Rotulador	Deli	SK109	Rotulador
Microtomo	Leica Biosystems	HistoCore BIOCUT	Microtomo
Cera de parafina	Solarbio	YA0012	Cera de parafina
Anticuerpo SMAD9	Abcam	ab262940	Anticuerpo SMAD9
Anticuerpo TARBP1	Abcam	ab115896	Anticuerpo TARBP1 Anticuerpo
ZCCHC24	Anticuerpo Abcam	ab88756	ZCCHC24