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Artículo de método

Manejo posterior al trasplante de hígado y recolección de muestras en ardillas terrestres daurias para secuenciación de ARN unicelular

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DOI:

10.3791/68443

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16 de septiembre de 2025

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1Department of Hepatic Surgery and Liver Transplantation Center of the Third Affiliated Hospital, Organ Transplantation Institute, Sun Yat-sen University; Organ Transplantation Research Center of Guangdong Province, Guangdong Province Engineering Laboratory for Transplantation Medicine, 2Guangdong Key Laboratory of Liver Disease Research, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 3Collage of Life Science, Shenyang Normal University, 4Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology; Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education, Chinese Academy of Medical Sciences, NHC Key Laboratory of Organ Transplantation, 5The School of Life Science, Peking University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe los procedimientos para el almacenamiento prolongado en frío del hígado y el trasplante ortotópico en la ardilla terrestre dauriana (DGS; Spermophilus dauricus), un hibernador estacional típico. Incluye métodos para recolectar injertos hepáticos y muestras de sangre para evaluaciones pronósticas y procesarlos para estudios unicelulares.

Resumen

La recuperación funcional del injerto y la inmunocompatibilidad injerto-huésped representan preocupaciones pronósticas importantes después del trasplante hepático. Críticamente, los modelos convencionales de roedores que utilizan ratas o ratones ofrecen una visión limitada de los mecanismos de las lesiones del injerto inducidas por hipotermia durante la preservación. Esta brecha subraya la necesidad de modelos alternativos. Dado que los injertos de hígado de la ardilla terrestre dauriana adaptable al frío (DGS; Spermophilus dauricus) puede mantener una conservación prolongada del frío y, por lo tanto, respaldar una alta capacidad de supervivencia en los DGS posteriores al trasplante, por lo tanto, este protocolo detalla el cuidado esencial de los animales posquirúrgicos y el monitoreo fisiológico requerido para los sujetos trasplantados con DGS. Además, proporciona procedimientos estandarizados para preparar muestras de injerto hepático de alta calidad para técnicas analíticas posteriores, incluida la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) para perfiles transcriptómicos y examen histopatológico. Generar con éxito muestras de injerto DGS bien preparadas es el paso inicial crucial en la aplicación de metodologías tradicionales y de vanguardia para estudiar este modelo poco convencional pero altamente relevante. Este protocolo aborda la información multiómica para DGS, lo que facilita la investigación futura sobre intervenciones quirúrgicas y modelado de enfermedades no solo en roedores en hibernación sino también en otros organismos especializados.

Introducción

En las últimas dos décadas, cada vez más investigadores han reconocido que las capacidades adaptativas superiores de las especies en hibernación ofrecen oportunidades invaluables para descubrir mecanismos novedosos en la adaptación biológica y pueden inspirar avances en varios campos médicos, como la preservación de órganos y la rehabilitación metabólica 1,2,3,4,5,6,7,8 . El primer protocolo quirúrgico integral para la preservación prolongada del frío hepático y el trasplante ortotópico en un hibernador, la ardilla terrestre dauriana (DGS; Spermophilus dauricus), se ha establecido recientemente. Aparentemente, la naturaleza adaptativa al frío del DGS permite un almacenamiento prolongado en frío de los injertos del donante y una alta supervivencia posterior al trasplante de los animales receptores. Por lo tanto, se necesita un protocolo de seguimiento para monitorear la recuperación postoperatoria de los animales y preparar muestras para diversos estudios histopatológicos y ómicos.

Dadas las diferencias fisiológicas significativas entre los DGS y los modelos estándar de roedores, y los cambios fisiológicos complejos y dinámicos posteriores al trasplante de hígado en los animales receptores, la obtención de muestras de alta calidad de ellos es crucial para los análisis posteriores y, por lo tanto, para la comprensión de la fisiología injerto-huésped posterior al trasplante. Además de obtener, procesar y examinar muestras de sangre y tejido hepático con métodos convencionales, una disociación exitosa de las células parenquimatosas hepáticas que son hepatocitos y las células no parenquimatosas (NPC) que incluyen células endoteliales, células estrelladas, células de Kupffer y otras células inmunes permitiría dilucidar las complejas interacciones celulares y moleculares postoperativas con la multiómica basada en células individuales de rápido desarrollo. Con este fin, el método clásico basado en la perfusión de colagenasa se ha desarrollado desde principios de la década de 1950 y se ha refinado continuamente 9,10,11. Sin embargo, la estructura anatómica distintiva del hígado DGS, las adherencias postoperatorias inducidas por la reconstrucción vascular y las alteraciones fisiológicas desencadenadas por la cirugía en los injertos hepáticos exigen un ajuste fino de las condiciones de extracción.

Este protocolo proporciona una guía detallada para el manejo postoperatorio y la recolección de muestras en DGS después del trasplante hepático. En concreto, este protocolo permite el aislamiento de hepatocitos a partir de injertos hepáticos de alto rendimiento y viabilidad celular, y detalla el posterior procesamiento de hepatocitos aislados para la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq).

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Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de la Universidad de Pekín para el Cuidado y Uso de Animales (LSC-WangSQ-2). Los DGS utilizados en este estudio fueron producidos en el laboratorio por DGS hembras embarazadas capturadas en los pastizales de la ciudad de Zhangjiakou. Los animales tenían entre 1 y 2 años en el momento del experimento. Se utilizaron DGS, tanto masculinos como femeninos, y con un peso entre 180 g y 400 g, como donantes y receptores. El peso de la receptora fue ligeramente superior al de la donante, con una diferencia inferior a 50 g. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Atención post-trasplante

  1. Aloje los DGS posteriores al trasplante de hígado en un ambiente cálido y limpio bajo un ciclo de luz / oscuridad de 12:12, con comida de laboratorio estándar y agua proporcionada ad libitum.
  2. Controle el peso corporal diariamente, evalúe la incisión abdominal para detectar sangrado y observe el estado mental y los niveles de actividad del receptor.
  3. Inmediatamente después de la operación, administrar inyección subcutánea de cefuroxima (16 mg/kg) y buprenorfina (0,05 mg/kg) cada 12 h durante 3 días.
  4. Inyecte tacrolimus por vía intramuscular (1 mg / kg) diariamente hasta 24 h antes de la recolección de tejido.
    NOTA: Dado que los DGS se derivan principalmente de capturas silvestres, los factores inmunológicos del trasplante siguen siendo no despreciables. El trasplante entre DGS se considera trasplante alogénico (no trasplante singénico). Si el estudio necesita excluir factores inmunológicos, como el rechazo, asegúrese de que el tacrolimus esté estandarizado en el período postoperatorio.

2. Preparación de muestras de injerto hepático

  1. Preparación de soluciones e instrumentos
    1. Preparar 50 ml de HBSS con 500 μM de EGTA (sin Ca2+- y Mg2+; pH 7,4). Precalentar en un baño de agua a 40 °C antes de su uso.
    2. Disuelva la colagenasa IV (0,4 mg/ml) en 50 ml de HBSS (con Ca2+ y Mg2+) e incube a un baño de agua a 40 °C durante 30 min.
    3. Solución de Percoll: Mezcle Percoll con 10× PBS en una proporción de 9:1 (v/v) y diluya con 1× PBS en una proporción de 9:1 (v/v) en un tubo de 15 ml. Mantenga la solución en hielo.
      NOTA: 5 ml de solución de Percoll al 90% son suficientes por DGS.
    4. Sumerja los instrumentos quirúrgicos en etanol al 70% durante 30 min antes de su uso.
    5. Ensamble el sistema de perfusión que comprende una bomba peristáltica con velocidad ajustable, tubo silástico y un baño de agua. Enjuague el tubo con solución salina tibia para purgar las burbujas de aire y conecte un filtro estéril de 0,22 μm a la salida del tubo.
      NOTA: Antes de purgar las burbujas de aire, es necesario enjuagar el tubo reutilizado haciendo funcionar bien etanol al 70% durante 15 min, seguido de un enjuague completo con ddH2O durante 15 min para eliminar el etanol residual.
  2. Procedimiento con animales
    1. Anestesiar el DGS postrasplante mediante inyección intraperitoneal de tribromoetanol al 2,5% a una dosis de 1 mL/100 g de peso corporal. Realice pruebas de pérdida de reflejos, como reacción al pellizco de los dedos de los pies, para garantizar una anestesia completa.
    2. Afeite el pelaje abdominal y sujete el DGS en la tabla quirúrgica con el lado ventral hacia arriba.
    3. Rocíe etanol al 70% sobre el área abdominal del animal y luego abra la cavidad abdominal haciendo una gran incisión cruzada de la piel y el peritoneo con unas tijeras afiladas y pinzas dentadas.
    4. Mueva suavemente los intestinos hacia la derecha fuera de la cavidad abdominal con un hisopo de algodón hasta que el injerto hepático, la vena porta (PV) y la vena cava inferior (IVC) estén claramente expuestos (Figura 1A).
      NOTA: Debido a las adherencias postoperatorias en la cavidad abdominal después del trasplante de hígado, diseccione suavemente las adherencias con un hisopo de algodón húmedo.
    5. Inserte una jeringa de 5 ml en la VCI debajo del estoma anastomótico para recolectar 1-2 ml de sangre e inmediatamente aplique una ligera presión en el sitio de punción con un hisopo de algodón seco para lograr la hemostasia después de retirar la aguja del vaso (Figura 1B).
      NOTA: Para minimizar el sangrado, la aguja se puede reemplazar con una de una jeringa de 1 ml, que es de aproximadamente 30 G.
    6. Con la orientación biselada hacia arriba, punte suavemente la PV con un catéter de 22-G en un ángulo de 15° con respecto a la superficie del vaso, seguido de la retracción de la aguja del catéter. Una vez que se confirme la punción exitosa, avance suavemente la cánula 1-1,5 cm adicionales a través del vaso. Asegure la posición de la cánula con una pinza vascular (Figura 1C).
      NOTA: Si la cánula se coloca correctamente, se verá un reflujo de sangre. Si la canulación de PV falla o encuentra desafíos técnicos, cambie a canulación de la VCI infrahepática y designe la PV como la vía de salida de perfusión.
    7. Ponga en marcha la bomba de perfusión con solución salina tibia a 6-8 ml/min, luego conecte el filtro de 0,22 μm mencionado anteriormente a la cánula.
    8. Una vez iniciada la perfusión vía PV, haga una incisión en la VCI para permitir el drenaje de la sangre. Se requieren 50-80 ml de solución salina para una perfusión adecuada (Figura 1D).
      NOTA: La perfusión exitosa se confirma cuando el hígado trasplantado pasa a un color blanco amarillento pálido durante este proceso. Algunas áreas de congestión de color rojo oscuro pueden permanecer en la superficie del hígado y no se pueden eliminar por completo, probablemente como resultado de un traumatismo hepático intraoperatorio, como una lesión por isquemia-reperfusión.
    9. Después de una perfusión adecuada con 50-80 ml de solución salina tibia, pause la bomba.
    10. Ligue el lóbulo lateral izquierdo en su base con una sutura de seda 2-0, seguida de la escisión del lóbulo distal al sitio de ligadura. De manera similar, el lóbulo mediano se liga en su base y se reseca utilizando el mismo método (Figura 1E, F).
      NOTA: La hepatectomía parcial se realiza para maximizar la utilización del hígado trasplantado para múltiples propósitos experimentales y para reducir el consumo de tampón de colagenasa al tiempo que facilita la digestión completa del hígado.
    11. Divida el tejido hepático resecado en varias partes: una porción se usa para el aislamiento de NPC seguido de scRNA-seq, las otras porciones se fijan en paraformaldehído al 4% para el corte histológico, o se congelan rápidamente en nitrógeno líquido para otros experimentos.
      NOTA: El paso 2.2.11 puede ser realizado por otra persona al mismo tiempo que los siguientes pasos para ahorrar tiempo.
    12. Aislamiento de NPC. Cortar los tejidos en trozos de aproximadamente 1-2 mm3 en el medio RPMI-1640 y digerir enzimáticamente con gentleMACS de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales). La viabilidad celular y la concentración celular se determinaron utilizando un contador celular automatizado.
      NOTA: Los pasos 2.2.12 y 2.2.13-2.3.5 se realizan simultáneamente.
    13. Corte el diafragma y sujete la VCI suprahepática (Figura 1G).
    14. Transfiera el tubo de entrada al tampón EGTA precalentado. Reinicie la bomba a una velocidad de 6-8 ml / min.
    15. Pinzar periódicamente la VCI durante 5-10 s para facilitar la distribución uniforme de la solución de perfusión en todo el parénquima hepático. El hígado se hincha visiblemente durante el pinzamiento y se relaja al soltarlo.
      NOTA: Es fundamental evitar la interrupción prolongada del drenaje, ya que la obstrucción prolongada corre el riesgo de romper el tejido conectivo delgado que rodea el hígado, interrumpiendo la perfusión o la dinámica de fluidos en el lecho capilar hepático. Además, la obstrucción sostenida puede comprometer la viabilidad celular y reducir el rendimiento debido a la sensibilidad de los hepatocitos a las fuerzas mecánicas.
    16. Después de la perfusión con 40-50 ml de solución de EGTA, inicie la perfusión del tampón de colagenasa a una velocidad de 4-6 ml / min durante 8-10 min. Pinzar brevemente el vaso sanguíneo del efluente como en los pasos anteriores (Figura 1H).
      NOTA: Después de 5-6 min de perfusión de colagenasa, el hígado se vuelve notablemente más blando y aparecen fisuras superficiales. Si estos cambios morfológicos están ausentes, reducir la velocidad de perfusión a 3-4 mL/min y extender el tiempo total de digestión a 12-13 min. Al completar 50 ml de perfusión de colagenasa, el hígado exhibe una consistencia friable, similar al tofu, que es un indicador de digestión suficiente (Figura 1I).
    17. Detenga la bomba y retire la cánula. Corta el hígado del cuerpo, colócalo en un plato de 5 cm con 10 ml de DMEM / F12 medio helado.
  3. Purificación de hepatocitos
    1. Desgarre el hígado para liberar células y transfiera la solución celular a un cónico de 50 ml con un filtro de 70 μm colocado en la parte superior.
    2. Después de centrifugar la suspensión celular a 50 x g durante 3 min a 4 °C, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento con 20 ml de PBS 1×. Repita este paso 3 veces. Vuelva a suspender el sedimento celular con 5 ml de medio DMEM/F12 después de la última centrifugación.
    3. Mezcle suavemente la suspensión celular con un volumen igual de solución Percoll al 90% en un tubo de 15 ml. Centrifugar a 200 x g durante 10 min a 4 °C.
      NOTA: Después de la centrifugación Percoll, la mezcla se separa en tres capas distintas: la capa superior (aproximadamente 0,5-1 ml) contiene células muertas, mientras que los hepatocitos viables se concentran en la capa inferior (aproximadamente 0,5-0,8 ml) (Figura 2). Con este protocolo se obtiene típicamente un rendimiento de 5-8 × 107 hepatocitos viables con >80% de viabilidad. (Figura 3A, B).
    4. Aspire las células muertas y el sobrenadante con cuidado, evitando una alteración vigorosa de las capas, y vuelva a suspender las células viables con 10 ml de medio DMEM / F12. Centrifugar a 50 x g durante 5 min a 4 °C.
    5. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los hepatocitos purificados con 1-5 ml de PBS al 1× suplementado con suero bovino fetal al 2% hasta una concentración final de 500-1200 células/μl.
    6. Mezcle los hepatocitos y las NPC en una proporción de cantidad de 1:1, es decir, la suspensión celular se preparó mezclando 10.000 hepatocitos y 10.000 NPC.
  4. ScRNA-seq
    NOTA: Los pasos 2.4.1-2.4.3 se realizaron de acuerdo con la guía del usuario del kit de preparación de la biblioteca de expresión génica de células individuales 3′ basada en gotas12. Se empleó la plataforma de partición microfluídica de células individuales y códigos de barras, que abarca pasos críticos de generación de perlas en emulsiones de gel (GEM), construcción de bibliotecas de ADNc y secuenciación de Illumina siguiendo protocolos estándar.
    1. Para realizar la generación de GEM y el código de barras, utilice una suspensión celular que contenga 20.000 hepatocitos y NPC. La eficiencia de captura de células no es inferior al 60%.
    2. Para la amplificación de ADNc, limpie las muestras posteriores a GEM-RT de acuerdo con la guía del usuario12.
    3. Construcción de bibliotecas
    4. Secuenciar bibliotecas de ARN unicelular utilizando una plataforma de secuenciación para lograr una profundidad de 150 Gb por muestra; Demultiplexar archivos de llamada base sin procesar en archivos FASTQ usando Cell Ranger (v8.0.0).
    5. Alinee los archivos FASTQ con el genoma de Ictidomys tridecemlineatus (accesión NCBI: GCF_016881025.1) para la cuantificación de la expresión, completando el flujo de trabajo experimental.

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Resultados

El examen histológico de los injertos almacenados a 4 °C durante 24 h y trasplantados a DGS reveló una arquitectura normal del lóbulo hepático con signos mínimos de inflamación, necrosis o colestasis en los días postoperatorios 3 y 6, comparable al grupo operado de forma simulada (Figura 4A-C).

El aislamiento de los hepatocitos primarios del DGS postoperatorio dura aproximadamente 1 h. Utilizando el protocolo descrito, se pueden o...

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Discusión

Siguiendo el protocolo que describe la preservación en frío del hígado del donante y el trasplante en DGS, los procedimientos descritos aquí detallan el seguimiento postoperatorio y el manejo farmacológico personalizado de los DGS trasplantados con un hígado almacenado en frío durante al menos 24 h. Este protocolo permite la supervivencia del receptor más allá de los 7 días después del trasplante, mostrando claras ventajas de los hibernadores como modelos de investigación para la preserv...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por el Proyecto Principal de Enfermedades Crónicas No Transmisibles-Ciencia y Tecnología Nacional (2023ZD0507600), las Becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82170671, 92254301, 32230048, 82371794, 32301306), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo (2024YFA0916804) y la Fundación de Talento Académico Shusen Lanjuan de la Fundación de Educación de la Universidad de Zhejiang.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1&veces; PBSServicebioG4202
10&veces; PBSServicebioG4207
4% ParaformaldehídoBiosharpBL539A
BuprenorfinaShafeiH12020276
Cánula (22 G)BBRAUN4254090B
CefuroximaSelleckE4838
Plato de cultivo celular (60 mm)NIDO705001
Colagenasa IVSigma-AldrichC5138
Tubo cónico (15 ml)NIDO601052
Tubo cónico (50 ml)NIDO602052
CotoneteTienda de artículos para el hogar
Conteo de células automatizado CountstarRuiyuEstrella del Conde Rigel S2
DMEM/F12GibicoC11330500BT
EGTASigma-AldrichE4378
FBSGibco10099-141
Filtro (0.22 μ m)Merck MilliporeSLGP033RB
Filtro (70 μ m)Biologix15-1070
gentleMACSMiltenyi130-093-235
HBSS (con Ca2+ y Mg2+)ServicebioG4204
HBSS (sin Ca2+ y Mg2+)ServicebioG4203
Kit de disociación de NPCMiltenyi130-096-730
PercollCytiva17-0891-09
Bomba peristálticaYuyanBT100
RPMI-1640GibicoC11875500BT
SalinoSRBSRB009
SecuenciadorIllumina NovaSeq X Plus
Tubos silásticosTygonE-3603
Sutura de sedaETICÓNSA845G
Jeringa (1 ml)Ciencia LigeLG05-124Solo se necesitará aguja de jeringa
Jeringa (2 ml)Ciencia LigeLG05-124Solo se necesitará un barril de jeringa
TacrolimusSelleckS5003
Pipeta de transferenciaBiologix30-0138A1
Alcohol tribromoetílicoSigma-AldrichT48402
Baño de aguaSubvenciónSAP2

Referencias

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