Muestreo eficiente del espacio de diseño de biosensores codificados genéticamente habilitado con un diseño de experimentos y flujo de trabajo de automatización

Summary

Este protocolo proporciona un método para la optimización global sistemática de biosensores codificados genéticamente a través de la generación y evaluación de bibliotecas genéticas asistidas por automatización. Esto se combina con metodologías de diseño de experimentos para agilizar la experimentación y permitir la selección de componentes genéticos para ajustar los biosensores a resultados de diseño específicos.

Abstract

Los biosensores codificados genéticamente son herramientas poderosas para el procesamiento de información de alto rendimiento, lo que permite la transducción de señales de entrada ambientales o químicas en una variedad de salidas. Esto permite la detección dinámica, el control directo y la regulación ajustada de la expresión génica en una amplia gama de aplicaciones biotecnológicas, incluida la optimización de enzimas, el desarrollo de cepas y el control de procesos microbianos. Para que sean adecuados para su propósito, el rendimiento del biosensor se puede refinar modificando la estequiometría de los componentes del circuito del biosensor (por ejemplo, transportadores, módulos de entrada y salida) y / o ajustando las interacciones intermoleculares huésped-biosensor asociadas (por ejemplo, ADN-proteína, proteína-proteína). Sin embargo, aquí, la gran cantidad de posibles permutaciones de biosensores crea un espacio de diseño combinatorio complejo, lo que requiere una optimización cuidadosa de las estrategias de detección para identificar configuraciones que brinden el rendimiento fenotípico deseado. Esta complejidad se ve agravada por los rasgos de rendimiento de los biosensores, como la capacidad de ajuste, que requieren un análisis de valoración del efector en condiciones de cribado monoclonal. En consecuencia, la necesidad de explorar diversas secuencias y espacio experimental hace que los métodos de muestreo fraccionado sean particularmente adecuados para este propósito. Apuntalando este flujo de trabajo están los algoritmos de diseño de experimentos (DoE), que están bien posicionados para permitir un mapeo estructurado eficiente basado en estadísticas y un muestreo fraccionado de este espacio de diseño experimental combinatorio.

En el interior se informa de una automatización combinada de alto rendimiento y un enfoque computacional para muestrear de manera eficiente el espacio de diseño de biosensores basados en factores de transcripción alostéricos para permitir configuraciones distintas con curvas de dosis-respuesta digitales y analógicas. El protocolo comienza con la creación y selección automatizada de bibliotecas de sitios de unión de promotores y ribosomas. Estas bibliotecas, y sus correspondientes datos de expresión, se transforman en entradas estructuradas adimensionales, lo que permite el mapeo computacional de todo el espacio de diseño experimental. A continuación, el muestreo fraccionado se realiza mediante un algoritmo DoE y se combina con el análisis de valoración del efector mediante una plataforma de automatización de alto rendimiento. Este flujo de trabajo proporciona un marco agnóstico para el desarrollo y la optimización de futuros sistemas de biosensores y circuitos genéticos, proporcionando un conjunto de herramientas regulatorias para la comunidad de biología sintética.

Introduction

La capacidad de regular la expresión de genes es una función esencial en todas las formas de vida, facilitando respuestas dinámicas y en tiempo real a influencias internas y externas, que van desde efectores químicos hasta estímulos biofísicos¹. La miríada de sistemas reguladores transcripcionales que se encuentran en la naturaleza tiene un enorme potencial en el aumento y la aceleración de la ingeniería metabólica y la investigación biotecnológica habilitada por la biología sintética. En procariotas, gran parte de la regulación que ocurre en la célula se controla a través de mecanismos reguladores de un componente impulsados por las interacciones de los factores de transcripción alostéricos (aTF) con una serie de efectores de moléculas pequeñas². Por lo general, consisten en un dominio de unión a efectores (EBD) y un dominio de unión al ADN (DBD), los aTF actúan como interruptores moleculares al unirse a efectores específicos de moléculas pequeñas, modulando la afinidad de su DBD por secuencias operadoras de ADN específicas ubicadas en las regiones promotoras del genoma, lo que resulta en la activación o represión de la transcripción³. Este mecanismo engañosamente simple ha dado lugar a una serie de estrategias de regulación diversas, que van desde sistemas de represión / desrepresión hasta activadores capaces de detectar y responder a un número asombroso de efectores de moléculas pequeñas o estímulos ambientales⁴. En consecuencia, la biología sintética ha aprovechado esta diversidad para construir biosensores codificados genéticamente capaces de acoplar una gran cantidad de señales de entrada en salidas a medida, es decir, la producción de proteínas reporteras fluorescentes y la regulación de vías sintéticas. Cuando se aplican en flujos de trabajo biotecnológicos, estos sistemas permiten el monitoreo en tiempo real de las concentraciones intracelulares de metabolitos, la regulación dinámica de las vías y las lecturas fáciles que ayudan en el desarrollo de vías, cepas y bioprocesos más eficientes 5,6,7,8.

Fundamentalmente, los biosensores se caracterizan de acuerdo con una serie de parámetros, que incluyen especificidad, rango operativo, rango dinámico, sensibilidad y pendiente, con la curva de respuesta a la dosis de un biosensor que describe estos parámetros a través de la señal de salida en función de la concentración de ligando (Figura 1)9,10,11,12 . La ecuación de Hill se puede utilizar para ajustar las características de rendimiento de un biosensor, proporcionando evidencia semiempírica para cada uno de los parámetros descritos anteriormente, proporcionando así un medio para caracterizar el sistema de biosensores y al mismo tiempo permitir la evaluación de los esfuerzos necesarios para ajustar el sistema hacia resultados basados en la aplicación. La especificidad se puede definir como las diferencias relativas en la salida de señal inducida por un efector en comparación con una matriz de otras moléculas efectoras potenciales y generalmente se modula en el nivel EBD del aTF. El rango operativo se define como el rango de concentraciones de ligandos que el biosensor puede detectar, dictando el rango de concentraciones a las que el biosensor podrá responder. El rango dinámico, por el contrario, describe la relación entre el estado de activación medible más alto (ON) y el estado inactivado (OFF) y es un parámetro importante para garantizar que el biosensor informe de manera confiable las concentraciones de efectores por encima de la autofluorescencia de fondo¹⁰. La sensibilidad de la molécula efectora se describe como la concentración requerida para obtener una determinada señal de salida, medida por la mitad de la concentración máxima (EC₅₀) del efector¹³. Finalmente, la pendiente de la curva se denota por la cooperatividad (n_H) del aTF para su sitio de operador en el promotor y da como resultado un perfil de salida de respuesta más digital o analógico. La cooperatividad surge de las interacciones proteína-proteína entre aTF unidos al ligando formando complejos multiméricos que fortalecen la afinidad por el sitio del operador, lo que resulta en aumentos bruscos en la capacidad de respuesta del circuito con concentraciones saturantes de ligando y un perfil de respuesta más digital¹⁴.

Las características de respuesta a la dosis de un biosensor pueden afectar significativamente la idoneidad de sus aplicaciones y, a menudo, son un punto de "éxito o fracaso" para cualquier aplicación conceptual. El rendimiento del biosensor puede variar enormemente de un sistema a otro, con un rango operativo que generalmente varía de 0.1 nM a 10 mM¹³, mientras que los rangos dinámicos pueden ser de 1.4 a 2000 veces¹⁵. Además, si bien el número de compuestos efectores notificados para los aTF es amplio (productos metabólicos, aminoácidos, metales, antibióticos, detección de quórum, etc.)¹¹, no lo abarca todo, lo que presenta desafíos a los investigadores cuando aún no existe un biosensor adecuado para su efector en la literatura. La biología sintética permitió la ingeniería de biosensores que abordan tales desafíos, lo que permite ajustar el alcance del efector y las características de dosis-respuesta para alinearse más estrechamente con los resultados de la investigación de la aplicación, y se ha utilizado para abordar los dos problemas antes mencionados, respectivamente^16,17. Dos áreas clave para la ingeniería son orientables a través de la biología sintética, la región promotora del biosensor y el propio aTF, mediando sus efectos a nivel transcripcional y proteico. Los enfoques que se centran en los elementos genéticos del biosensor para modular el rendimiento a nivel del promotor, incluyen la ingeniería del RBS, los sitios del operador y -35, -10 (cajas hexagonales) para ajustar la sensibilidad, los rangos operativos y dinámicos, y son el foco de la metodología descrita en este manuscrito (Figura 1). Alternativamente, modificar la selectividad y sensibilidad del biosensor mediante el análisis de su dominio de unión al efector y la mutación de los residuos involucrados en la coordinación del efector (utilizando homología de secuencia y / o biología estructural) puede modular su respuesta a un efector afín ^18,19,20 o cambiarlo por completo hacia un efector no afín de interés 16,17,21 . Estos esfuerzos de ajuste pueden dirigir los biosensores hacia aplicaciones específicas, que suelen ser controladores metabólicos (bucles de retroalimentación, circuitos de control), herramientas de cribado primario (descubrimiento de enzimas o cepas), herramientas de cribado secundario (cribado de variantes enzimáticas, ingeniería metabólica) y bioprospección de transportadores^22,23,24. Un ejemplo de ello implica el uso de un aTF sensible al ácido mucónico, CatM, combinado con una secuencia promotora diseñada para mejorar el rango dinámico y operativo. Este sistema se integró con la clasificación celular activada por fluorescencia para aislar las cepas de producción de ácido mucónico más efectivas basadas en la fluorescencia GFP siguiendo la evolución adaptativa del laboratorio²⁵.

Si bien el éxito de las estrategias de ingeniería descritas anteriormente es evidente, las interdependencias de las palancas disponibles para que un biólogo sintético ajuste los biosensores pueden complicar el proceso de diseño y prolongar el período dedicado al desarrollo de biosensores, lo que puede disuadir a algunos investigadores de implementar biosensores en sus propios flujos de trabajo. Como se ilustra en la Figura 1, los intentos de ajustar un biosensor hacia un resultado particular mediante la modificación de los hexboxes pueden atenuar inadvertidamente otros parámetros, siendo esta interdependencia un desafío reconocido en la ingeniería de biosensores¹². Los enfoques comunes de la sintonización de biosensores consisten en el diseño racional y la ingeniería de evolución dirigida, y el primero se basa en la comprensión a priori de las características estructurales y mecanicistas del sistema para centrar la experimentación en componentes con una alta probabilidad de éxito; mientras que este último se basa en la mutagénesis aleatoria y la evolución natural junto con una pantalla de alto rendimiento para seleccionar variantes que exhiben características optimizadas 26,27,28,29,30. Si bien son efectivas, ambas técnicas también sufren algunos inconvenientes: la ingeniería dirigida, por ejemplo, a través de su enfoque en elementos estructurales o funcionales específicos, es propensa a una exploración limitada de todo el espacio experimental y puede ignorar los efectos alostéricos o secundarios³⁰. La generación y el cribado de bibliotecas no dirigidas, aunque son ideales para optimizar los diseños de forma no guiada, requieren poco trabajo de diseño inicial (es decir, diseño y generación de bibliotecas), sí requieren un sesgo hacia la mutación útil. Sin tal sesgo, se espera que un porcentaje mucho mayor de mutaciones pueda ser deletéreo, requiriendo más cribado³¹. Como tal, los enfoques holísticos que consideran no solo el efecto primario de las partes constituyentes del biosensor (aTF, RBS, sitios del operador y cajas hexagonales), sino también cómo estos componentes interactúan entre sí para influir en los parámetros del biosensor son muy atractivos.

La experimentación multivariada estructurada y las metodologías de modelado estadístico se han adoptado ampliamente en los flujos de trabajo de ingeniería de procesos para interrogar el espacio experimental multidimensional utilizando el mínimo número posible de experimentos. Este enfoque, que combina la experimentación y el modelado, denominado diseño de experimentos (DoE), permite a los investigadores optimizar procesos multivariables complejos hacia resultados definidos sin requerir un amplio conocimiento a priori ^23,30. Si bien normalmente se aplica a la optimización de variables continuas para las cuales la exploración experimental estructurada es más fácil, DoE también se ha utilizado en la optimización de vías metabólicas a nivel genético 31,32,33. Esto implica un paso de selección inicial en el que se seleccionan los factores que se consideran más importantes para el resultado deseado, seguido de un paso de optimización mediante el cual los factores seleccionados se ajustan para obtener el resultado deseado, en este caso para optimizar parámetros específicos del biosensor con el fin de aumentar su ámbito de aplicación. Fundamentalmente, esta técnica se puede acoplar a plataformas automatizadas de manipulación de líquidos para aumentar el rendimiento de cribado hasta bibliotecas medianas de 10³ - 10⁴ para optimizar globalmente el rendimiento de los biosensores sobre una base basada en datos²³. A continuación, describimos un protocolo para la implementación de un enfoque impulsado por DoE para la optimización de biosensores, asistido con robótica de manejo de líquidos para agilizar la generación de bibliotecas, la detección y la recopilación de datos para la optimización global de la sensibilidad de los biosensores.

Protocol

1. Diseño de piezas RBS/promotor

1. Identificar elementos reguladores específicos de biosensores que puedan ajustarse sistemáticamente como variables continuas en el proceso de DoE. Agrupe estos elementos normativos en distintos módulos. Esto puede incluir módulos que regulan el transporte de efectores, la expresión del factor de transcripción y / o la expresión génica de salida. Asegúrese de que cada módulo sea ajustable a nivel transcripcional y/o traduccional por un promotor o RBS (por ejemplo, RBS_trans, P_reg, RBS_out y P_out, respectivamente).
2. Determine los sitios funcionales clave dentro de las regiones promotoras y RBS seleccionadas, como cajas hexagonales, sitios de operador y secuencias RBS.
   NOTA: Existen muchos promotores y RBS caracterizados en la literatura para crear bibliotecas de 34,35,36. Sin embargo, para secuencias promotoras no caracterizadas (típicamente el promotor P_reg), consulte a continuación los pasos adicionales para localizar elementos de secuencia genética sintonizables si no hay ninguno disponible en la literatura.
   1. Localice otros operones que contengan las secuencias de biosensores de interés a través de búsquedas BlastP del aTF con la entrada de detección deseada. Extraer la región intergénica del aTF y sus genes regulados para obtener secuencias promotoras.
      NOTA: La ubicación y el número de secuencias promotoras variarán según la clase de aTF utilizada.
3. Utilice múltiples herramientas de alineación de secuencias y otro software de motivos para buscar en los promotores putativos motivos conservados, como cajas hexagonales y sitios de operadores. Con base en el análisis de la secuencia del promotor, seleccione secuencias de nucleótidos para aleatorizar con bases degeneradas, por ejemplo, N = cualquier cosa, R = cualquier purina, Y = cualquier pirimidina, etc.
   NOTA: Se dirige a los lectores a la publicación fuente para obtener más detalles sobre el análisis del promotor y la aleatorización de bases²³.

2. Ensamblaje y validación de la biblioteca de piezas

1. Diseñe y ordene cebadores que amplifiquen específicamente el vector de expresión deseado para permitir la inserción de variantes de secuencia promotora/RBS aguas arriba de un marcador fluorescente (por ejemplo, GFP). Diluir los cebadores liofilizados a su llegada a una concentración final de 100 μM en H₂O desionizado estéril.
   1. Ensamble la mezcla de reacción de PCR en hielo en tubos de PCR de acuerdo con los parámetros de la polimerasa específica. Asegúrese de que se use una polimerasa de alta fidelidad para evitar el arrastre de mutaciones a la columna vertebral del vector de expresión. Ajuste la temperatura de recocido y el tiempo de extensión de acuerdo con las necesidades de los cebadores y la longitud del producto de PCR deseado.
   2. Analice el producto de PCR mediante electroforesis en gel y purifique el vector linealizado mediante purificación por PCR o un kit de extracción en gel. Mida la concentración de ADN vectorial linealizado y guárdelo a -20 °C.
2. Ordene las bibliotecas de variantes diseñadas (RBS o promotores) para su inserción en el vector linealizado como oligonucleótidos degenerados monocatenarios con brazos de homología de plásmidos de 30 pb en los extremos 5 'y 3' para la recombinación homóloga dirigida en el vector de expresión.
   1. A su llegada, vuelva a suspender los oligonucleótidos liofilizados a una concentración final de 100 ng/μl en H₂O desionizado estéril.
3. Determine los volúmenes para cantidades equimolares de la biblioteca de vectores y variantes linealizados utilizando calculadoras en línea. Asegúrese de que el volumen final de la reacción ascenderá a 20 μL y que se utilice una relación molar de 2:1 entre inserto y vector.
   1. Descongelar una alícuota de mezcla maestra de ensamblaje comercial de Gibson (X2) sobre hielo y ensamblar la reacción en un tubo de PCR de acuerdo con los volúmenes proporcionados por la calculadora elegida.
      NOTA: La mezcla maestra de Gibson también se puede hacer en el laboratorio^37,38.
   2. Añadir 10 μL de mezcla maestra 2x Gibson a los fragmentos de ADN e incubar durante 1 h a 50 °C en un termociclador o similar.
   3. Aplique los 20 μL de producto de ligadura a 200 μL de E. coli competente en un tubo de microcentrífuga. Incubar en hielo durante 30 min seguido de un choque térmico durante 45 s a 42 °C.
   4. Vuelva a poner las células en hielo durante 2 min, agregue 800 μL de caldo súper óptimo con medios de represión de catabolitos (SOC) al tubo y deje que las células se recuperen durante 1 h a 37 ° C en una incubadora agitadora.
   5. Extienda 50 μL de células transformadas en múltiples placas de Petri de agar Luria-Bertani (LB) de 60 mm con la selección de antibióticos relevante. Incubar placas a 37 °C durante 18 h.
4. Verifique las placas en busca de transformadores, calcule el número de colonias que representan 3 veces la diversidad teórica de la biblioteca para capturar una representación suficiente de cada variante. Optimice el ensamblaje isotérmico si el número de colonias es bajo/cero.
   NOTA: Se requiere sobremuestreo cuando se considera una biblioteca ideal generada a partir de reactivos o síntesis de alta fidelidad. Esto suele ser 3 veces mayor que el tamaño total de la biblioteca. Por ejemplo, 4 posiciones de degeneración (NNNN) = 4⁴ = 256 secuencias únicas. Por lo tanto, raspe ~ 768 colonias.
   1. Raspe el número requerido de colonias en un solo matraz estéril de 125 ml que contenga 25 ml de medios LB suplementados con antibióticos apropiados. Incubar el matraz a 37 °C durante 18 h en una incubadora agitadora (180 rpm), asegurándose de que el cultivo sea visiblemente denso después de que haya transcurrido este tiempo.
   2. Utilice un kit de purificación midi-prep de plásmidos para purificar la biblioteca de variantes del cultivo transformador preparado. Determinar la concentración del ADN de la biblioteca de plásmidos; Se requieren de 1 a 10 μg para los pasos posteriores. Asegúrese de que el ADN de la biblioteca se eluya utilizando H₂O desionizado estéril.
      NOTA: Los pasos más allá de este punto se centrarán en la clonación y validación de bibliotecas de variantes en el host de expresión de Pseudomonas putida (P. putida); La adaptación del protocolo a otros huéspedes puede requerir la modificación de los tiempos de incubación, las temperaturas de incubación y los métodos de transformación.
5. Preparar una placa de agar LB del huésped de expresión deseado P. putida extrayendo de un stock de glicerol e incubando la placa a 30 °C durante 18 h.
   1. Recoger una sola colonia de P. putida de la placa de agar LB, inocular 10 mL de medios LB y crecer a 30 °C durante 18 h, a 180 rpm agitando.
   2. Preparar las células para la electrocompetencia centrifugando el cultivo cultivado a 4000 x g a 18 °C durante 2 min. Vierta el sobrenadante, vuelva a suspender en 1 ml de H₂O desionizado estéril y transfiera las células resuspendidas a un tubo de microcentrífuga estéril.
      NOTA: Las células de P. putida deben aparecer rosadas cuando se granulan.
   3. Centrifugar las células durante 1 min a 4 x g en una microcentrífuga, verter el sobrenadante y volver a suspender en 1 ml de H₂O desionizado estéril. Repita los pasos de centrifugación y resuspensión 4 veces más.
      NOTA: La pérdida de células puede ocurrir al verter sobrenadante durante el lavado; Esto es normal y no debería afectar los rendimientos.
   4. Transfiera 100 μL de células lavadas a una cubeta de electroporación de 0,2 cm, agregue 1-10 μg de ADN de biblioteca de plásmidos a la cubeta y mezcle.
   5. Encienda el electroporador, asegúrese de que el voltaje esté ajustado a 2,5 kV para la cubeta de 0,2 cm, inserte la cubeta en la cámara de electroporación y pulse.
   6. Agregue 900 μL de medios SOC a la cubeta, mezcle y transfiera las celdas a un tubo de microcentrífuga estéril. Deje que las células se recuperen durante 2 h a 30 °C en una incubadora agitadora.
6. Extender 50 μL de células transformadas en placas de Petri cuadradas grandes (230 mm) de agar LB suplementado con el antibiótico correspondiente e incubar a 30 °C durante 18 h.
   NOTA: Asegure una densidad moderada de colonias en las placas de la biblioteca (2-3 UFC/cm²). Esto dependerá de la competencia bacteriana y del volumen de la siembra. Si es demasiado bajo, la optimización de la transformación, o las rondas sucesivas de transformación, pueden usarse para aumentar el número de colonias.
7. Seleccione entre 25 y 50 colonias de todas las placas transformadoras para la validación de la secuencia. Utilice cebadores que amplifiquen a través de la secuencia degenerada, amplifiquen la región por PCR y envíenla para la secuenciación de Sanger para evaluar la diversidad de secuencias, así como la policlonalidad.
   NOTA: Si la policlonalidad se vuelve problemática, la distribución de transformaciones en múltiples lotes de cubetas con 1 μg de ADN puede ayudar a reducir este efecto.

3. Cribado clonal de la biblioteca de piezas - automatización

1. Configuración del manipulador de líquidos
   1. Cree 7 programas en una plataforma de manipulación de líquidos para garantizar que se trivialicen los pasos intensivos de pipeteo.
   2. Cree un programa de "transferencia de líquidos MTP", asegúrese de que el manipulador de líquidos esté configurado para pipetear un volumen ajustable desde un depósito preparado en placas de microtitulación (MTP) vacías en su diseño.
   3. Cree un programa "Agregar glicerol a MTP", asegúrese de que el manipulador de líquidos esté programado para pipetear un volumen de 100 μL de glicerol al 50% en placas, asegúrese de que la velocidad de dispensación y aspiración sea de 5-20 μL/s.
      NOTA: Se crea un programa separado para tener en cuenta la mayor viscosidad del glicerol al 50%, lo que puede provocar la formación de burbujas, aspiración incompleta o contaminación cruzada de los pozos vecinos debido a salpicaduras si no se controla.
   4. Cree un programa de "transferencia de líquido DWB", configure el manipulador de líquidos para pipetear en bloques de pocillos profundos (DWB) con un ajuste de volumen ajustable y asegúrese de que el manipulador de líquidos pipetee desde un depósito precargado.
   5. Cree un programa de "Inoculación a partir de MTP descongelado", asegúrese de que el manipulador de líquidos esté programado para aspirar 5 μL de MTP descongelado que contenga las colonias seleccionadas y transfiéralo a las placas DWB correspondientes en el diseño.
      NOTA: Preste mucha atención a la disposición de MTP y DWB en el diseño, asegurando un orden lógico de eventos para evitar la doble inoculación accidental o la falta de placas.
   6. Cree un programa de "Transferencia a DWB de ensayo", asegúrese de que el manipulador de líquidos esté configurado para transferir 5 μL de células de una posición de placa DWB a otra posición de placa DWB. Luego, el programa debe repetir esta acción 4 veces con cada transferencia inoculando una posición diferente de la placa, es decir, P1 -> P2, P1 -> P3, etc.
      NOTA: Este programa garantiza el subcultivo sin problemas de 96 variantes en diferentes concentraciones de ensayo.
   7. Cree un programa de "Configuración de ensayo - Resuspensión de PBS (DWB)", asegúrese de que el manipulador de líquidos pipetea cada DWB en el diseño con 500 μL de PBS, el programa también debe incluir un paso de mezcla para garantizar que los gránulos celulares se resuspendan correctamente.
   8. Cree un programa "Configuración de ensayo: adición de células y PBS (MTP)", asegúrese de que este programa incluya un paso para transferir 200 μL de las células resuspendidas de una posición de placa DWB a una posición MTP vacía.
      NOTA: Para todos los pasos de 3.1, la programación y los diseños del manipulador de líquidos variarán; Los investigadores deben consultar los manuales de manipuladores de líquidos comerciales específicos para modificar los programas anteriores para adaptarlos a la capacidad y las necesidades del experimento.
2. Cultivo de bibliotecas de variantes y códigos de barras
   1. Determine el tamaño teórico de la biblioteca y calcule el número de variantes individuales para garantizar > cobertura de la biblioteca del 95% (se recomienda 3 veces el tamaño de la biblioteca) (consulte la nota del paso 2.5.).
   2. Calcule el volumen requerido de medios LB suplementados con antibióticos de acuerdo con el número de colonias que se van a examinar (200 μL por colonia + 10% más).
   3. Abra el software del manipulador de líquidos y haga clic en Ejecutar junto al programa MTP Liquid Transfer (consulte el archivo complementario 1). Coloque los medios preparados en la posición del depósito correspondiente y llene la plataforma con MTP vacíos de acuerdo con el diseño. Configure el programa para dispensar 200 μL de medios. Haga clic en Aceptar para confirmar el inicio del programa.
      NOTA: Asegúrese siempre de que los depósitos y las puntas se suministren adecuadamente a la plataforma del manipulador de líquidos antes de confirmar el inicio del programa para evitar interrupciones.
   4. Repita el programa tantas veces como sea necesario, selle los MTP llenos con una membrana transpirable para mantener la esterilidad.
   5. Transfiera las placas MTP llenas a una plataforma de selección de colonias y desclasifique, también transfiera las placas cuadradas de P. putida transformadas con ADN de la biblioteca de variantes de plásmidos a la plataforma de selección de colonias. Utilice el selector de colonias para inocular cada uno de los pocillos de placa de microtitulación precargados con una sola colonia de las placas de la biblioteca de transformadores.
      NOTA: Asegúrese de que la profundidad mínima de agar sea de 25 ml para evitar dañar el cabezal del recolector de colonias.
   6. Vuelva a sellar y transfiera las placas inoculadas a una incubadora fuera de línea a 30 °C (800 rpm), asegurando que el control de la humedad esté habilitado al 75% para evitar la evaporación del cultivo. Déjalos crecer durante 16 h.
      NOTA: Después de la incubación, los cultivos aparecerán visiblemente densos a simple vista, si este no es el caso, vuelva a verificar los requisitos de medios y antibióticos.
   7. Después de 16 h de crecimiento, devuelva las placas cultivadas a la plataforma de manipulación de líquidos y abra el sellado. Haga clic en Ejecutar junto al protocolo Agregar glicerol a MTP (consulte el Archivo complementario 1), asegúrese de que el diseño de la placa en la pantalla coincida con el del muelle del manipulador de líquidos. Haga clic en Aceptar y permita que se ejecute el protocolo.
   8. Una vez terminado, vuelva a sellar las placas y mezcle brevemente en una incubadora de agitación fuera de línea (800 rpm) durante 5 minutos antes de codificar y almacenar a -80 °C.
   9. Repita los pasos 3.2.7. y 3.2.8. hasta que a todos los MTP se les haya agregado glicerol, se hayan mezclado, se hayan marcado con códigos de barras y se hayan almacenado a -80 ° C.
      NOTA: El protocolo se puede pausar en este punto para prepararse para los pasos de caracterización a continuación. Además, se puede planificar el bloqueo de las placas en diferentes ciclos experimentales para adaptarse a la capacidad de la plataforma de manipulación de líquidos en uso o para reducir la carga de trabajo en una sola sesión.
3. Selección de bibliotecas de variantes
   1. Calcule el volumen requerido de medios suplementados con antibióticos para el número de DWB que se llenarán (~ 495 μL por pocillo + 10% más).
   2. Haga clic en Ejecutar junto al programa DWB Liquid Transfer (consulte Archivo complementario 1), asegúrese de que los medios se agreguen al depósito correcto en el diseño del programa. Asegúrese de que se agreguen DWB vacíos a las posiciones de diseño correspondientes y que haya un suministro adecuado de puntas disponibles. Configure el programa para dispensar 495 μL de papel. Cuando esté listo, haga clic en Aceptar para iniciar el programa.
   3. Selle los DWB llenos con una membrana transpirable y transfiéralos al almacenamiento temporal a 4 °C, repita el paso 3.3.2. hasta que se haya llenado el número requerido de DWB con medios.
   4. Haga clic en Ejecutar junto al programa Incoculado de MTP descongelado (consulte el Archivo complementario 1), asegúrese de que los criostocks MTP y los DWB llenos se transfieran a la plataforma de manejo de líquidos de acuerdo con el diseño. Asegúrese de que se proporcione un suministro suficiente de propinas. Haga clic en Aceptar para inicializar el programa.
      NOTA: Descongele las placas madre en hielo durante 30 minutos, solo cuando se hayan preparado los programas y placas de requisitos previos para garantizar la viabilidad óptima de las células.
   5. Cuando el programa haya terminado, selle los DWB inoculados durante la noche con una membrana transpirable y transfiéralos a una incubadora agitadora de placas fuera de línea con un control de humedad del 75% y déjelos crecer durante la noche durante 16 h a 30 °C (180 rpm).
   6. Vuelva a sellar, mezclar y devolver los MTP criogénicos al congelador a -80 °C según el paso 3.2.8.
   7. Repita los pasos 3.3.4. a 3.3.6. tantas veces como sea necesario hasta que se haya inoculado y transferido a la incubadora el número requerido de DWB durante la noche.
      NOTA: Se recomienda registrar cuándo se agrega cada lote de placas a la incubadora para tener en cuenta el retraso entre las ejecuciones durante la inoculación y usar el mismo orden para los pasos posteriores.
   8. Calcule el volumen requerido de medios suplementados con diferentes concentraciones de efector y antibiótico de acuerdo con el número de DWB nocturnos que se van a analizar (495 μL por pocillo + 10% más). Cada concentración efectora requiere su propio depósito separado en el manipulador de líquidos.
      NOTA: Para la caracterización inicial, como el cribado ON/OFF, dos concentraciones efectoras son suficientes (por ejemplo, concentración final de 0 y 1000 μM). Con el fin de generar datos de dosis-respuesta para una caracterización más sólida, este rango se incrementa a un mínimo de cuatro concentraciones (por ejemplo, 0, 1, 25 y 1000 μM de concentración final). Los sistemas represores no requieren la adición de un efector para determinar la función, mientras que para los activadores, como el sistema descrito, se requiere un efector.
   9. Haga clic en Ejecutar junto al programa DWB Liquid Transfer (consulte Archivo complementario 1). Asegúrese de que los depósitos que contienen medios suplementados con efectores estén en las posiciones correctas, de acuerdo con el diseño. Agregue DWB vacíos a la plataforma del manipulador de líquidos. Asegúrese de que haya suficientes consejos disponibles para la plataforma. Cuando esté listo, haga clic en Aceptar para iniciar el protocolo para generar los DWB de ensayo.
   10. Después del llenado, selle los DWB de ensayo con una membrana transpirable y transfiéralos al almacenamiento temporal a 4 °C, y vuelva a llenar la plataforma del manipulador de líquidos con más placas vacías.
   11. Repita los pasos 3.3.9 y 3.3.10 tantas veces como sea necesario hasta que se llene el número requerido de DWB.
   12. Haga clic en Ejecutar junto al programa Transferir a DWB de ensayo (consulte Archivo complementario 1). Asegúrese de que los DWB de ensayo no sellados que contienen medios suplementados con efectores se agreguen a las ubicaciones correctas en el diseño del manipulador de líquidos.
   13. Transfiera y desprecinta los DWB nocturnos que contengan P. putida cultivada inoculada en el paso 3.3.4. a la plataforma de manipulación de líquidos, asegurando nuevamente que el diseño se cumpla estrictamente. Asegúrese de que haya suficientes consejos disponibles para la plataforma. Cuando esté listo, haga clic en Aceptar para iniciar el protocolo.
       NOTA: La transferencia y la disposición de los subcultivos en las placas de ensayo generalmente deberán realizarse en lotes según el tamaño de la plataforma del manipulador de líquidos.
   14. Una vez finalizado el programa, aplicar sellos y transferir las placas de ensayo a una incubadora fuera de línea a 30 °C, con un 75% de humedad durante 16 h (180 rpm), el volumen final del ensayo será de 500 μL en esta etapa.
   15. Deseche los DWB durante la noche después de la inoculación y repita los pasos 3.3.12 a 3.3.14 según sea necesario hasta que todos los DWB de ensayo requeridos hayan sido inoculados y estén creciendo en incubadoras fuera de línea.
   16. Retire los DWB de la incubadora, transfiéralos a una centrífuga y peletice las celdas a 4000 x g, 18 ° C durante 5 min. Vierta el sobrenadante y coloque los DWB centrifugados en la plataforma del manipulador de líquidos.
       NOTA: Los volúmenes de gránulos celulares pueden variar según la concentración o variante del efector, además, algunos gránulos pueden parecer más visiblemente fluorescentes a simple vista que otros.
   17. Calcule el volumen de 1x PBS requerido en función del número de DWB a cribar (500 μL por pocillo + 10% más).
   18. Haga clic en Ejecutar junto al programa Configuración del ensayo - Resuspensión de PBS (DWB) (consulte el archivo complementario 1), establezca el volumen de dispensación en 500 μL, asegúrese de que se agregue 1x PBS al depósito correcto y, a continuación, coloque las placas centrifugadas de acuerdo con el diseño del manipulador de líquidos. Asegúrese de que haya suficientes consejos disponibles. Haga clic en Aceptar para iniciar el programa.
       NOTA: El lavado de las células se realiza para eliminar los medios de crecimiento residuales, que pueden producir cierta autofluorescencia.
   19. Vuelva a sellar y retire las placas resuspendidas del manipulador de líquidos. Asegúrese de que los gránulos estén completamente resuspendidos revisando la parte inferior de la placa. Continúe transfiriendo DWB granulados al manipulador de líquidos y repita el paso 3.3.18. hasta que se hayan vuelto a suspender todas las placas.
   20. Haga clic en Ejecutar junto al programa Configuración del ensayo - Adición de células y PBS (MTP) (consulte el archivo complementario 1). Transfiera los DWB resuspendidos del paso 3.3.18. en el manipulador de líquidos de acuerdo con el diseño sugerido. Transfiera los MTP vacíos al manipulador de líquidos de acuerdo con el diseño. Asegúrese de que el volumen de dispensación esté ajustado a 200 μl y de que haya suficientes puntas disponibles. Haga clic en Aceptar para iniciar el programa.
   21. Transfiera MTP llenos (volumen de ensayo final de 200 μL) a un lector de placas multimodo fuera de línea, mida la fluorescencia relativa a una longitud de onda de emisión de excitación adecuada (por ejemplo, sfGFP lEx/lEm = 488/520) y OD₆₀₀ para cada pocillo en la placa.
       NOTA: La configuración de la longitud de onda de la emisión de excitación dependerá de la elección del gen fluorescente codificado en el vector de expresión. Asegúrese de que los ajustes de ganancia en el lector de placas sean consistentes en todo momento y permita la discriminación entre variantes bajas y altas sin saturar el detector.
   22. Repita los pasos 3.3.20. y 3.3.21. hasta que todos los DWP de ensayo se hayan transferido a MTP y medido.

4. Procesamiento/transformación de datos y clasificación diferencial

1. Realice una normalización de los datos recopilados dividiendo la fluorescencia GFP (RFU) registrada por la medición de OD₆₀₀ registrada para cada variante para cada una de las concentraciones efectoras evaluadas (0 y 1000 μM).
   NOTA: La mayoría de los lectores de placas se pueden programar para normalizar automáticamente la fluorescencia por OD₆₀₀ durante la recopilación de datos.
2. Calcule ON/OFF para obtener el rango dinámico de cada variante dividiendo el RFU/OD₆₀₀ a 1000 μM (ON) por el RFU/OD₆₀₀ a 0 μM (OFF). Represente todos los valores de ON/OFF de variantes como un diagrama de dispersión utilizando el ON/OFF de la construcción del biosensor base para determinar las variantes que exhiben actividad por encima del nivel base.
   NOTA: Se determinó que el ON/OFF de la construcción inicial del biosensor utilizado en el protocolo era 3,6 veces basado en la caracterización inicial de la secuencia de tipo salvaje²³.
3. Para una caracterización en profundidad, ajuste los datos de dosis-respuesta utilizando una función de colina con una pendiente variable para extraer los valores de EC50 y/o pendiente de colina utilizando software analítico.
   NOTA: Para estimar la sensibilidad y la EC₅₀, recopile al menos cuatro puntos de datos que abarquen el rango donde la respuesta pasa de activación baja a alta, generalmente la parte más pronunciada de la curva. Si bien más puntos de datos mejoran la resolución y la precisión, cuatro puntos son suficientes para estimar la clasificación de sensibilidad.
4. Del conjunto completo de variantes, seleccione un subconjunto de variantes (por ejemplo, N = 100) asegurando una cobertura equilibrada de las clasificaciones deseadas, en este caso EC₅₀. Para ello, identifique las variantes que abarcan un amplio rango en EC₅₀, asegurando que las variantes de alto y bajo rango estén representadas proporcionalmente. Elimine las variantes que son redundantes (por ejemplo, aquellas con clasificaciones similares y un impacto mínimo en la cobertura de distribución).
5. Después de seleccionar la biblioteca de muestras de variantes final (por ejemplo, N = 100), transforme los datos utilizando la siguiente ecuación de transformación lineal-logarítmica (lin-log) (Ec.1).
   Ec.1:
   
   Dónde
   
   
   
6. Para los valores de EC50, asigne +1 para el más alto (menos sensible) y -1 para el más bajo (más sensible). Un promedio geométrico de 0 corresponde a niveles de expresión intermedios.

5. Generación de diseño de cribado definitivo / DoE

1. Para explorar sistemáticamente el espacio de diseño de biosensores, utilice un diseño de cribado definitivo (DSD). Se prefiere este diseño debido a su capacidad para explorar el espacio de diseño de manera eficiente mientras adapta el estudio a las necesidades específicas del sistema.
2. Haga clic en la categoría DOE y luego seleccione el botón Diseño de cribado definitivo en el software estadístico (consulte el Archivo complementario 2).
3. Defina los factores experimentales (por ejemplo, RBS_trans , P_reg , RBS_out y P_out) como variables continuas haciendo clic en el botón Continuo y nombrándolos, asegurándose de establecer los valores en +1 y -1 (consulte el Archivo complementario 3).
4. Defina las respuestas deseadas (por ejemplo, ON, OFF, ON/OFF, EC50, Slope) haciendo clic en el botón Agregar respuesta y personalizando el nombre (consulte Archivo complementario 4).
   NOTA: Establezca el objetivo de la respuesta haciendo clic en el menú desplegable del objetivo, seleccione Ninguno o Maximizar según el objetivo del diseño (por ejemplo, exploración versus optimización).
5. Una vez definidos los factores y las respuestas, haga clic en Continuar para abrir la pestaña de opciones de diseño. Seleccione No se requieren bloques, luego haga clic en el botón Crear diseño (consulte el Archivo complementario 5).
   NOTA: Se pueden agregar bloques para aislar el diseño de factores molestos (factores que no son de interés principal). Esto puede agregar complejidad a los experimentos; sin embargo, se utiliza a discreción del investigador.
6. El software generará una tabla de diseño experimental que describe las combinaciones específicas de factores que se probarán. Las partes genéticas de las bibliotecas transformadas lin-log correspondientes se utilizarán para generar las 17 construcciones correspondientes. Guarde y exporte la tabla de diseño haciendo clic en Crear tabla (consulte Archivo complementario 6).

6. Repita el paso 2 - Diseño y ensamblaje de diseños genéticos informados por el DoE

1. Comience a construir los plásmidos multivariables de acuerdo con el plan de diseño de detección definitivo (DSD).
   1. Identifique una variable inicial (por ejemplo, promotor, RBS, etc.). Diseñe y ordene cebadores para linealizar el vector de expresión, asegúrese de que los cebadores flanqueen la región de la variable objetivo, asegurando la eliminación de cualquier elemento de secuencia preexistente.
   2. Diseñe y ordene cebadores que amplifiquen específicamente las secuencias variantes correspondientes a los niveles de biblioteca predefinidos (por ejemplo, -1, 0, +1) para cada nodo regulador (P_out P_reg RBS_out RBS_trans). Asegúrese de que cada cebador incluya brazos de homología de 30 pb que sean complementarios al sitio de inserción del vector de expresión.
   3. Purifique el ADN plasmídico del cultivo criogénico relevante correspondiente a los niveles de biblioteca +1, 0 y -1 para la variable identificada a través de miniprep.
2. Configure las reacciones de PCR para el vector de expresión linealizado y los fragmentos de biblioteca en hielo y determine la concentración del producto como se describe en los pasos 2.1.1 y 2.1.2.
   1. Repita los pasos 2.3 a 2.4 del protocolo para realizar el ensamblaje de Gibson del vector de expresión linealizado y los fragmentos de biblioteca. Asegúrese de que se utilicen placas de Petri de tamaño estándar en esta etapa.
   2. Examine las colonias utilizando la secuenciación de Sanger para confirmar el ensamblaje correcto de la construcción para cada uno de los diseños DSD sugeridos, luego proceda a la transformación de P. putida (pasos 2.5 - 2.6).
   3. Mediante PCR, confirme la presencia del plásmido correcto en colonias transformadas. Elija transformadores confirmados e inoculételos en 10 ml de LB suplementados con antibióticos para un crecimiento nocturno a 30 ° C durante 18 h (180 rpm). Cree criostocks (25% de glicerol final) y guárdelos a -80 °C.

7. Selección y racionalización de datos

1. A partir de crio-stocks, rayar la P. putida transformada con las construcciones de diseño DSD relevantes en agar LB suplementado con antibiótico, incubar a 30 °C durante 18 h durante la noche para hacer crecer las colonias.
   1. Recoger tres colonias individuales de cada placa correspondientes a los diseños DSD sugeridos y cultivar durante la noche en 10 mL de medios LB suplementados con antibiótico a 30 °C durante 18 h.
   2. Al día siguiente, cargue un DWB con un gradiente de concentración de efector que oscile entre 0 mM y 1 mM (concentración final) por fila hasta un volumen total de 50 μL por pocillo. Diluya los cultivos nocturnos 1/100 en LB fresco y agregue 450 μL de cultivo al DWB a través del gradiente de concentración.
   3. Repita manualmente los pasos 3.3.14 y 3.3.16 para obtener DWB ampliados, luego salte y realice manualmente los pasos 3.3.18, 3.3.20. y 3.3.21. para obtener datos de RFU/OD para cada variante sugerida.
2. Ajuste los datos de respuesta a la dosis (RFU/OD) utilizando una función de colina (con pendiente variable), extrayendo los parámetros (factores) apropiados para la optimización, como EC₅₀, pendiente de colina, rango dinámico o rango operativo. Transforme los datos resultantes en log10 e ingrese los parámetros extraídos en la tabla DSD para cada uno de los diseños probados.
   1. Realice un análisis de detección de dos niveles para identificar factores significativos que afectan el rendimiento del biosensor. Utilice la relación t de Leth y el análisis de gráficos seminormales^{23, 30} para determinar qué factor se desvía de la distribución esperada y retenerlo en el modelo. Mantener el efecto de la herencia, asegurando que cualquier factor significativo solo en la interacción también se incluya individualmente.
   2. Realice modelos de regresión de mínimos cuadrados estándar (SLSR)³⁰ para cada variable de respuesta de forma independiente, incorporando solo los factores significativos identificados. Evalúe los diagnósticos del modelo de regresión, incluidos los gráficos residuales, las pruebas de falta de ajuste y los valores de R², para garantizar un ajuste adecuado de los datos.
   3. Utilice un generador de perfiles de respuesta para determinar la configuración óptima del factor en función de las características deseadas del biosensor. Defina funciones objetivo para cada respuesta (por ejemplo, maximizar el rango dinámico mientras se minimiza EC₅₀) para generar configuraciones de factores que logren el mejor equilibrio en todas las respuestas mientras se consideran las restricciones y compensaciones del sistema.
3. Regrese a las bibliotecas de variantes y construya el biosensor optimizado de acuerdo con los módulos sugeridos por el perfilador de respuesta, siguiendo los pasos 6.1 a 6.2 del protocolo. Valide el rendimiento de la construcción optimizada mediante la caracterización de dosis-respuesta.

Results

Inicialmente, los módulos que se cree que afectan la función del biosensor deben seleccionarse para variar; esto puede incluir la regulación de las proteínas de transporte, que pueden afectar la concentración intracelular de ligandos y, por lo tanto, la salida del biosensor, pero también incluye los niveles relativos de transcripción y traducción del propio aTF, así como el indicador fluorescente o el gen de salida (Figura 1). La Figura 2 muestra un flujo de trabajo típico utilizado en el desarrollo de un experimento basado en DoE para la optimización de biosensores; comenzando con la organización de elementos reguladores en distintos módulos susceptibles de manipulación a través de la biología sintética a través de cambios a nivel de secuencia, específicamente en sitios de operadores, cajas hexagonales o RBS (Figura 2A). Como tal, el siguiente paso en el flujo de trabajo de DoE es la aleatorización de sitios de secuencia para generar bibliotecas de variantes (Figura 2B). El grado de aleatorización debe considerarse cuidadosamente, ya que el número de colonias seleccionadas debe escalar con el grado de aleatorización 4^N, donde N es igual al número de posiciones base aleatorizadas. Tratar cada promotor único o secuencia RBS como una variable categórica única en DoE aumentaría el número de construcciones requeridas a niveles experimentalmente inviables, ya que dicha conversión a variables continuas a través de la caracterización de las bibliotecas es un paso de clasificación necesario para medir el rango de función adquirida a través de la aleatorización y para definir la parte superior, media, y límites inferiores de funcionalidad. Esto se logra primero mediante el análisis de la producción de las bibliotecas como una medida de la fuerza de la variante RBS o promotora a través de un gen reportero (Figura 2C). Se realiza una transformación lin-log, como se muestra, para discretizar las variables continuas en niveles que pueden ser utilizados por DoE para explorar diferentes combinaciones y desarrollar un modelo que describa los efectos de estas variantes. Luego se implementa un diseño de detección utilizando 3 niveles que describen el rango de actividad para cada factor de manera combinatoria (Figura 2D). A través del ensamblaje y la prueba de los diseños sugeridos, se explora eficientemente el espacio experimental y se revelan las interacciones entre los factores. El análisis estadístico de los datos resultantes se utiliza para determinar qué combinación de factores tiene el efecto más significativo en la salida del biosensor, y SLSR se utiliza para predecir el comportamiento del sistema bajo diferentes criterios, lo que facilita la optimización del biosensor hacia resultados específicos como un mayor rango dinámico o sensibilidad (Figura 2D).

Figura 3 demuestra el ensamblaje y la selección de una biblioteca promotora regulada por aTF. Se realizó un ensamblaje isotérmico utilizando un oligonucleótido degenerado para crear una biblioteca codificada por plásmidos, mediante la cual cada plásmido se aleatoriza de forma única en posiciones específicas. El grado de diversidad de la biblioteca determinará en última instancia el número de colonias que se examinarán, y los tamaños teóricos de biblioteca más grandes se beneficiarán enormemente de la automatización. El análisis de la secuencia promotora de operones homólogos a TphR proporcionó un mapa de conservación de bases que se utilizó para informar las ubicaciones de aleatorización, específicamente las bases que mostraron cierto grado de variación y, por lo tanto, pueden modular la actividad sin ser absolutamente esenciales²³. Se seleccionaron tres bases en cada una de las cajas hexagonales -35 y -10 para una aleatorización completa, además de seis bases en el sitio del operador (Figura 3A), lo que da como resultado una biblioteca de promotores teóricos de ~ 500,000. La biblioteca de plásmidos se utilizó posteriormente para transformar la cepa huésped. En esta etapa, una buena eficiencia de transformación es crucial para obtener una cobertura de biblioteca suficiente con los enfoques comunes de resolución de problemas que se muestran en Figura 3B. La optimización de las concentraciones de ADN, el método de transformación y el diseño de clonación pueden mejorar significativamente los rendimientos de los transformadores. Figura 3C Demuestra un flujo de trabajo típico Al obtener transformadores, las colonias individuales correspondientes a variantes únicas primero deben cultivarse en medios antes de que pueda comenzar cualquier trabajo de caracterización. Para cubrir el tamaño teórico de la biblioteca, será necesario seleccionar una gran cantidad de variantes y colocarlas en placas. Aprovechar los sistemas automatizados como los manipuladores de líquidos y los recolectores de colonias puede trivializar este paso que requiere mucha mano de obra. Paso 1 de Figura 3C ilustra la transferencia de medios de crecimiento a MTP que se han cargado manualmente en el muelle de manipulación de líquidos, seguida de la inoculación automatizada por parte de un recolector de colonias. Algunas etapas, como sellar las placas y transferirlas a incubadoras fuera de línea, son manuales, pero también se pueden automatizar si se desea. Tras el crecimiento de los cultivos, los manipuladores de líquidos también se pueden utilizar para generar crioexistencias mediante la adición de glicerol, como se muestra en Figura 3C. En esta etapa, el código de barras de las placas garantizará que cada variante seleccionada se vincule a una placa específica y a la ubicación del pozo, lo que permitirá una fácil referencia para una mayor caracterización posterior. Una de las principales ventajas de los enfoques automatizados, además de la reducción de la mano de obra, es la reducción del error humano, y es menos probable que se lleven a cabo errores en la etapa de preparación de la biblioteca. Paso 2 de Figura 3C ilustra la fase de caracterización automatizada de la preparación de la biblioteca. Esto comienza via el llenado de DWB con medios utilizando la plataforma de manejo de líquidos, seguido de la inoculación utilizando crio-stocks con código de barras. La automatización en esta etapa garantiza nuevamente que se minimicen los errores de pipeteo y la mano de obra. Luego, las placas se sellan y se transfieren manualmente a incubadoras fuera de línea para su crecimiento, momento en el que se puede iniciar la disposición de compuestos efectores en placas de pocillos profundos frescas. A los efectos de una pantalla inicial de bibliotecas de piezas, puede ser deseable una pantalla de ENCENDIDO/APAGADO simple, ya que se puede utilizar para preseleccionar variantes no funcionales que exhiben una actividad igual o peor que la construcción base y enriquecer el grupo de variantes para aquellas que exhiben una actividad mejorada. Esto tiene el beneficio adicional de reducir los costos de material de las puntas y las placas que pueden volverse prohibitivos en los protocolos de detección de grandes bibliotecas. Sin embargo, cuando se requiere la optimización de métricas de rendimiento de biosensores más complejas (por ejemplo, EC₅₀), se requerirán concentraciones de efectores adicionales. Tras el crecimiento de los cultivos, las placas se devuelven a la plataforma de manipulación de líquidos, que comienza a inocular las placas que contienen compuestos efectores antes de ser devueltas manualmente a la incubadora una vez más durante la duración del ensayo. Figura 3D Muestra el paso final de la automatización antes de la recopilación de datos. Después del período transcurrido para el crecimiento y la activación del biosensor, las placas se retiran de la incubadora fuera de línea y se devuelven a la plataforma de manipulación de líquidos. Para eliminar los medios de crecimiento residuales, que pueden interferir con la recopilación de datos de fluorescencia, se requiere centrifugación, eliminación de sobrenadante y lavado de las células con 1x PBS. El uso de manipuladores de líquidos puede trivializar nuevamente este proceso, con la resuspensión automatizada de cultivos que permite un procesamiento rápido de las placas, incluida la transferencia de las células lavadas a MTP de formato de 96 pocillos para su detección. La recopilación de datos se puede realizar de forma manual o automatizada, y algunos lectores cuentan con pilas de placas que pueden interactuar con los manipuladores de líquidos para automatizar aún más el proceso de recopilación de datos. Al comparar la relación de activación del biosensor en presencia de efector (ON) con su ausencia (OFF), se evaluaron 5.000 variantes utilizando el grado de activación del biosensor (cambio de pliegue) para determinar la función del biosensor; Solo las variantes con actividad superior a la del constructo base (3,6 veces) se llevaron adelante para una mayor caracterización, como lo indica la región sombreada rojo-rosa del diagrama de dispersión (Figura 3D). Sobre la base de las posiciones de la placa y el pocillo del grupo de variantes enriquecidas, se puede llevar a cabo una caracterización robusta utilizando réplicas biológicas o diferentes concentraciones de efectores consultando las placas criogénicas originales con código de barras generadas en el Paso 1 del flujo de trabajo.

La Figura 4 demuestra el cribado de las variantes clasificadas desde el cribado inicial de la biblioteca con el objetivo de desarrollar una biblioteca promotora para optimizar la sensibilidad. Utilizando los datos de las 5.000 variantes examinadas en el flujo de trabajo anterior, un grupo de 226 variantes de la pantalla inicial de encendido / apagado, que se determinó que eran más activas que la secuencia parental, se caracterizaron y clasificaron de acuerdo con su sensibilidad, para actuar como niveles alrededor de los cuales se podría diseñar un DSD. Como primer paso, las variables categóricas, en este caso las variantes P_out top, deben convertirse en variables continuas que abarquen un amplio rango de sensibilidad. Para detectar la sensibilidad, se requieren curvas de respuesta a la dosis para obtener datos de EC₅₀ de una función de Hill trazada; esto aumenta drásticamente el trabajo de recubrimiento y es muy adecuado para la automatización mediante manipuladores de líquidos para simplificar el proceso de configuración y cribado del ensayo, como se muestra en la Figura 4A. Siguiendo el flujo de trabajo establecido en el Paso 2 de la Figura 3C, se utilizaron códigos de barras de placas y posiciones de pocillos correspondientes al conjunto enriquecido de variantes para inocular DWB llenos de medios de crecimiento y antibióticos. Para mejorar la robustez experimental, las variantes se examinaron por triplicado biológico. Después de la transferencia de las placas a la incubadora fuera de línea para crecer, los DWB frescos se llenaron con medios de crecimiento suplementados con efectores de 0, 1, 25 y 1000 μM utilizando los manipuladores de líquidos para reducir la mano de obra. Para reducir el número de placas requeridas para el ensayo, se eligió un rango de concentración que abarca la parte inferior, media y superior de la curva, y las concentraciones del punto medio revelan las sensibilidades relativas de cada variante, como se ilustra en la Figura 4A. Después de la inoculación de los grupos variantes en cada concentración efectora y el análisis de fluorescencia y OD₆₀₀, se trazaron curvas de respuesta a la dosis, con análisis de regresión no lineal utilizado para determinar EC₅₀. En esta etapa, se generó una biblioteca sin procesar de cada variante con un valor EC₅₀ único, con las 100 variantes más robustas como se muestra en la Figura 4B para reducir aún más el tamaño de la biblioteca. Sin embargo, antes de que esta biblioteca se pueda usar en DoE, se debe generar la conversión de las variantes únicas en una biblioteca clasificada, que represente el rango de sensibilidad que contiene. Esto se logró realizando una transformación lin-log de los datos, que clasifica y reescala los datos para que cada variante se clasifique de la más sensible (-1) a la menos sensible (+1), así como definiendo un valor de punto medio (0), que representa la media geométrica del conjunto de datos Figura 4C. La transformación de los datos brutos produjo el gráfico azul que se muestra en la Figura 4D, a partir del cual las secuencias discretas de P_{de salida} correspondientes a +1, 0 y -1 se llevaron al diseño de detección definitivo como niveles de factor de_salida de P.

Figura 5 demuestra el flujo de trabajo completo después de la generación de la biblioteca desde la generación de DSD hasta el modelado y la optimización global de un biosensor basado en los aprendizajes asistidos por DoE. Figura 5A presenta un desglose de un biosensor típico en 3 módulos con 1 (módulos de transporte y regulador) o 2 (módulo de salida) nodos de regulación. Siguiendo el ejemplo de Figura 4, se habrán desarrollado bibliotecas RBS o promotoras, y se habrán seleccionado niveles que van desde +1, 0 y -1 para abarcar la mayor variación de cada factor. El tamaño de las bibliotecas seleccionadas normalmente determinaría el número de experimentos necesarios para explorar completamente el espacio de diseño, por ejemplo, si cada biblioteca tuviera un tamaño de 22, esto equivaldría a 22⁴ (234,256) combinaciones. DoE tiene como objetivo simplificar la carga de trabajo experimental al reducir el número de combinaciones a través de diseños de detección estructurados. Si bien son posibles muchas metodologías, DSD es ideal para el desarrollo de biosensores, ya que permite identificar los factores principales y las interacciones de dos factores, al tiempo que evita efectos confusos de segundo orden. Además, como los diseños DSD utilizan 3 niveles, es posible estimar la curvatura (no linealidad). Figura 5A demuestra una salida DSD típica donde cada uno de los 4 módulos está configurado en diferentes niveles; como cada nivel corresponde a un promotor particular o variante de RBS, se utiliza el ensamblaje isotérmico para generar las construcciones genéticas correspondientes a los diseños recomendados del DSD. Después de ensamblar y transformar la cepa huésped con las construcciones recomendadas, se obtienen curvas de respuesta a la dosis utilizando un rango completo de concentraciones efectoras para proporcionar más confianza en el rendimiento de cada una de las construcciones Figura 5B. Como DSD reduce drásticamente el número de construcciones, este paso a menudo se puede realizar a mano o utilizando manipuladores de líquidos automatizados si se prefiere. Figura 5C presenta el resultado del perfil de predicción obtenido después de construir y probar las combinaciones sugeridas a partir de la pantalla DSD y construir modelos predictivos basados en el coeficiente de Hill (n_H) y EC₅₀ salida de cada combinación probada. El objetivo del experimento era desarrollar una construcción de biosensor que se optimizara globalmente tanto para n_H y EC₅₀ a través de la modulación de la expresión de los 4 nodos reguladores para maximizar ambos parámetros. Cada factor regulador se muestra en su propia columna con el grado de expresión indicado a lo largo del eje x correspondiente al promotor transformado lin-log y las bibliotecas de piezas RBS (-1 a +1). El efecto de cambiar la expresión de los nodos en ambos EC₅₀ y n_H se indica mediante las curvas de las subgráficas. Los gráficos de perfil destacan la naturaleza a menudo poco intuitiva de la optimización de biosensores, por lo que el ajuste de un nodo regulador puede tener efectos opuestos en los parámetros de salida. Por ejemplo, RBS_Trans no tiene una correlación fuerte con n_H,_{sin embargo, se correlaciona positivamente con la CE50} de manera no lineal. Las interacciones de orden superior (no lineales) también están implícitas, en el caso de RBS_fuera Un aumento en la resistencia aumentará la pendiente (mayor n_H) con un aumento concomitante de la sensibilidad (menor CE₅₀), lo que da como resultado una curva con una pendiente más digital y una respuesta más aguda al aumento de la concentración del efector. A partir de estos modelos, las facetas poco intuitivas del ajuste de biosensores se pueden representar con mayor claridad, lo que permite la optimización de los nodos de regulación hacia un óptimo global. Los modelos se utilizaron para predecir los óptimos globales tanto para EC₅₀ y n_H , con las líneas rojas en el gráfico que indican los niveles óptimos de cada nodo regulador (Figura 5C). Figura 5D demuestra el perfil de dosis-respuesta de la construcción inicial del biosensor parental (azul) en comparación con el diseño DSD de alto rendimiento (verde) y la construcción optimizada globalmente (lila). Uso del modelo para predecir las fortalezas ideales del módulo para maximizar la EC₅₀ y n_H, avariante correspondiente a RBS_Trans (-1), P_Reg (-0,7), P_fuera (-0,3) y RBS_fuera (+1) se ensamblaron y caracterizaron con la construcción optimizada que muestra mejoras en EC₅₀ y n_H (Figura 5D). Mientras que tanto el DSD como los biosensores optimizados globalmente muestran una CE similar₅₀ (0,8 frente a 0,7 μM), n_H se mejoró significativamente sin comprometer la CE₅₀ ganancias que ya se habían logrado. Los resultados demuestran claramente las ventajas del diseño basado en datos sobre los enfoques basados en la intuición y sirven para validar DoE como un medio para agilizar y simplificar el proceso de ajuste de biosensores.

Figura 1: Ajuste de parámetros de biosensores codificados genéticamente. Diseño de módulos genéticos de un biosensor codificado genéticamente, incluidos aTF, sitios de operador (OS), cajas hexagonales (-35, -10) y componentes RBS. Los cuadros de colores corresponden a interacciones que normalmente afectan a los parámetros del biosensor, tales como: afinidad ligando-aTF (gris), operador aTF (rosa), RNAP-Hexbox (verde) y RBS (naranja). Los efectos de cada parámetro sobre las características dosis-respuesta se indican en los gráficos representativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Descripción general de un flujo de trabajo típico de optimización de biosensores DoE. (A) Descripción general de la modularización de componentes de biosensores que muestra un módulo de transporte que codifica una proteína de transporte para importar el efector objetivo, un módulo regulador perteneciente al aTF y un módulo de salida que codifica una proteína indicadora como sfGFP. También se muestran nodos de regulación, como RBS_trans, P_reg, P_out y RBS_out, que corresponden a los nodos genéticos que se someterán a aleatorización para explorar los parámetros del biosensor. (B) Una selección de elementos de secuencia susceptibles de aleatorización de base, incluidos los promotores y RBS. La secuencia parental del promotor se muestra en la línea superior, con la secuencia mutante finalizada que se muestra a continuación, las estrellas indican bases sin cambios, mientras que K, M y N se refieren a guanina / timina, adenina / citosina o cualquier nucleótido, respectivamente. Los promotores ofrecen un mayor potencial de aleatorización al apuntar a cajas hexagonales o sitios de operadores y también pueden incluir la duplicación o la modificación del espaciado de las secuencias. Las bibliotecas RBS ofrecen opciones de aleatorización más limitadas, sin embargo, son significativamente más fáciles de filtrar debido a su menor diversidad máxima. (C) Los niveles de expresión de las variantes se caracterizan y luego se convierten en una biblioteca lin-log clasificada para convertir los factores variantes categóricos en 3 niveles discretos que son más susceptibles de análisis a través de DoE. (D) El mapeo del espacio experimental se realiza utilizando combinaciones multiplexadas de los tres niveles de cada módulo para generar un modelo que se puede usar para informar las opciones de diseño para ajustar el rendimiento del biosensor hacia los resultados deseados, esto podría ser hacia el rango dinámico o hacia la sensibilidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Modularización de biosensores, construcción de bibliotecas de promotores y flujo de trabajo automatizado. (A) Ejemplo de aleatorización de secuencias específicas en el promotor aTF e inserción en la construcción del biosensor mediante ensamblaje isotérmico. Las letras en negrita indican posiciones que se aleatorizaron en el sitio del operador o en los hexboxs de acuerdo con la clave proporcionada durante la síntesis de oligonucleótidos degenerados. (B) Panel que describe la transformación de la biblioteca de variantes de biosensores resultante en un huésped clonador como E. coli, y los próximos pasos en función del rendimiento del transformador. La baja eficiencia de transformación puede resultar en una cobertura deficiente de la biblioteca teórica y una exploración inadecuada del espacio de diseño. La resolución de problemas en esta etapa es imperativa para garantizar que una parte significativa de las variantes esté disponible para la caracterización, con medidas comunes de solución de problemas descritas. (C) Flujo de trabajo de los pasos 1 y 2 como se describe en el protocolo, con el símbolo de la mano roja que indica los pasos manuales y el engranaje que indica los pasos automatizados. El flujo de trabajo del paso 1 destaca los pasos clave en el protocolo, desde la selección de colonias hasta la generación de criostocks. El flujo de trabajo del paso 2 demuestra la reactivación y el reordenamiento de crio-stocks para el ensayo por curva de respuesta a la dosis. (D) El panel que demuestra el procedimiento final antes de la selección, incluido el lavado de las células y la transferencia a las placas de ensayo antes de la medición de la fluorescencia y la OD. En el panel se muestra un grupo de variantes examinadas de 5000, con las variantes que muestran ENCENDIDO / APAGADO por encima de la secuencia promotora parental (3.6 veces) resaltada en el cuadro naranja. Se puede ver que muchas de las variantes se agrupan alrededor de 1, lo que indica un rendimiento deficiente y una baja variabilidad, probablemente debido a la aleatorización a nivel de secuencia que causa pérdida de función. Las 226 variantes que se muestran en el cuadro de la trama se llevaron adelante para una caracterización sólida. Los datos fueron adaptados de la publicación original de Álvarez González et al²³. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Cribado y discretización de variantes principales de la biblioteca promotora mediante transformación lin-log. (A) Esquema del procedimiento estándar para generar datos de expresión para una biblioteca RBS o promotora. Utilizando las variantes clasificadas que representan un buen rango de niveles de expresión, los manipuladores de líquidos se utilizan para generar placas de ensayo precargadas con una concentración predeterminada de efector a partir de las cuales derivar las curvas de respuesta a la dosis de las variantes 226 clasificadas. (B) Después de la determinación de EC₅₀ y una mayor reducción de la biblioteca caracterizada a 100 variantes, los datos se trazan como un gráfico de barras que muestra la combinación de diferentes sensibilidades generadas a partir de la aleatorización del promotor. (C)Los datos EC₅₀ se transforman utilizando la ecuación de velocidad lin-log para convertir el conjunto de datos continuo en uno categórico más adecuado para la factorización en un DSD. (D) Los datos de la variante EC₅₀ transformados se muestran ahora reducidos a una escala simplificada y clasificados de alta a baja actividad EC₅₀ . A partir de esto, se seleccionan 3 niveles correspondientes a las variantes de media geométrica superior (+1) (0) e inferior (-1) y se llevarán al DSD para explorar el espacio experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Diseño experimental DSD, pruebas y resultados de aprendizaje basados en modelos. (A) Flujo de trabajo esquemático que muestra la generación de una tabla de diseño DSD basada en las bibliotecas clasificadas transformadas lin-log de los módulos RBS_trans, P_reg, P_{out y RBSout} . La tabla de diseño DSD sugiere el menor número de combinaciones para mapear eficientemente el espacio experimental. Se proporciona un ejemplo de salida en el que +1, 0 y -1 hacen referencia a las variantes de rendimiento superior, medio e inferior para cada nodo regulador como se describe en las transformaciones lin-log. Estos se construyen mediante ensamblaje isotérmico y se confirman mediante secuenciación antes de transformarse en el huésped de expresión para su caracterización. (B) Después de la transformación, las células crecen y se analizan contra una amplia gama de concentraciones efectoras, y la salida fluorescente se mide para generar curvas de dosis-respuesta. Varios parámetros, como nH y EC50, se extraen de las curvas de dosis-respuesta y se introducen en el DSD para generar modelos predictivos para cada factor. (C) Usando los modelos, se pueden hacer predicciones sobre el impacto de modular un parámetro del biosensor mediante el cambio del nivel de expresión de cualquier módulo regulador. Es importante destacar que es posible el ajuste global de los nodos reguladores, lo que permite maximizar uno o más parámetros del biosensor simultáneamente, indicados por las líneas rojas discontinuas en cada subgráfico. (D) La optimización del modelo hacia la máxima sensibilidad da como resultado la construcción optimizada globalmente (lila), cuya curva de respuesta a la dosis se traza contra la construcción DSD de mayor rendimiento (verde) y la construcción del biosensor parental (azul). Los parámetros n_H y EC₅₀ extraídos se muestran debajo del gráfico, lo que demuestra la mejora de ambos parámetros por encima de la construcción DSD de alto rendimiento, validando la eficacia de los modelos predictivos generados a partir del DSD. Los datos fueron adaptados de la publicación original de Álvarez González et al²³. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Pasos del protocolo de manejo automatizado de líquidos utilizados para la preparación de la biblioteca de biosensores y la configuración del ensayo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2 a Figura complementaria 6: Generación paso a paso de un diseño de detección definitivo (DSD). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Las bibliotecas de elementos genéticos que abarcan una amplia variabilidad genética son cruciales para el éxito de una metodología basada en DoE. Como se demuestra en la Figura 2A, el número de variantes teóricas aumenta con el número de posiciones a las que se dirigirá la mutagénesis, así como con el grado de aleatorización, y este tamaño de biblioteca cada vez mayor crea importantes cuellos de botella de detección. Reducir el número de posiciones objetivo o el grado de aleatorización puede reducir el número de variantes que deben examinarse y es un enfoque atractivo si se requiere un enfoque más específico para el ajuste o si existe un conocimiento significativo a priori del sistema como guía. Sin embargo, en el caso de sistemas como los biosensores, que presentan muchas características superpuestas o pueden no tener elementos genéticos bien caracterizados, es difícil eludir el requisito de tamaño de la biblioteca. El uso de manipuladores de líquidos automatizados puede trivializar el trabajo de recolección de colonias y el cultivo de variantes, específicamente cuando se requiere una mayor recopilación de puntos de datos para trazar funciones más avanzadas como curvas de respuesta a la dosis frente a dos comparadores de puntos de datos, como ON/OFF. Si bien es difícil cuantificar específicamente el tiempo ahorrado al incluir flujos de trabajo automatizados, El principal beneficio de su implementación está en el tiempo que se puede dedicar a otros experimentos paralelos³⁸.

A pesar de esto, en muchos casos en los que el tamaño de las bibliotecas supera 10⁴, incluso las metodologías asistidas por manipuladores de líquidos se vuelven poco prácticas³⁹. En tales casos, un cribado preliminar de variantes utilizando citómetros de flujo es un enfoque muy atractivo, con una capacidad de clasificación mucho mayor de hasta 10⁷ células por h⁴⁰. El uso de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) con dos rondas de selección positiva y al menos una ronda de selección negativa se ha empleado de forma rutinaria en la clasificación de las variantes de biosensores de mayor rendimiento antes de una caracterización más extensa 16,26,42. El desarrollo y la ejecución de dichos protocolos utilizando FACS se han revisado en detalle en otra parte³¹. Las cribas de clasificación iniciales son posibles utilizando ensayos de manipulación de líquidos basados en placas, como se describe en el protocolo anterior; al comparar los datos de ON/OFF utilizando una sola concentración de efector como se muestra en la Figura 3D, solo se pueden seleccionar biosensores variantes con una ganancia de función apreciable (3,6 veces como se proporciona en los métodos) para una caracterización más detallada, agilizando el desarrollo de bibliotecas y el tiempo de ejecución experimental. Sin embargo, tanto las plataformas FACS como las de manipulación de líquidos conllevan una importante inversión de capital para el laboratorio y, a menudo, requieren un nivel de experiencia técnica para operar y mantener. Las pantallas basadas en placas de agar proporcionan una barrera de entrada técnica y financiera más baja, y se han utilizado en combinación con gfp o detección de colonias azul-blancas para seleccionar variantes de la biblioteca RBS, así como mutantes enzimáticos basados en la intensidad de la fluorescencia^43,44. Sin embargo, estos también están limitados en el número de variantes que se pueden detectar de manera efectiva, pero también requieren una diferencia significativa en la fluorescencia para ser detectables⁴⁴. Como un compromiso entre la mutación simultánea totalmente combinatoria de múltiples elementos a la vez, una metodología de "divide y vencerás" tiene como objetivo dividir grandes bibliotecas de variantes en bloques de detección más manejables⁴¹. Si bien un enfoque modularizado puede ser pragmático, no explora de manera efectiva el espacio de diseño combinatorio, ya que se sabe que el rendimiento de los componentes biológicos depende en gran medida del contexto, especialmente en bacterias, donde prevalece el acoplamiento transcripcional y traslacional. Esto tiene el potencial de dar lugar a opciones de diseño que se dirijan a los máximos locales en lugar de a los óptimos globales.

El transporte y el reconocimiento de inductores específicos representan otra característica importante del desarrollo de biosensores que merece mención, a pesar de no ser el foco principal del protocolo descrito. La falta de un aTF apropiado para la molécula diana representa un desafío importante para los investigadores. La selección racional de un aTF existente que se une a un análogo estructural del efector objetivo puede proporcionar una plantilla ideal sobre la cual aplicar la aleatorización de codones para ajustar la especificidad del aTF al efector deseado¹⁷. La alineación de la secuencia diana con estructuras resueltas o predicciones de Alphafold puede permitir la identificación de sitios de unión efectores con residuos de aminoácidos sospechosos sometidos a aleatorización y clasificación semirracionales, adaptables al protocolo¹⁷. Del mismo modo, la selección y modulación de los transportadores responsables de la importación/exportación de efectores puede alterar significativamente las características dosis-respuesta de los biosensores. Se encontró que la expresión génica del transportador es un actor importante en la respuesta del biosensor, con una biblioteca diversificada de promotores P_tac y RBS que controlan la expresión de un transportador MucK utilizado para estabilizar su expresión en múltiples rondas de FACS, mejorando la robustez de la respuesta del biosensor¹⁷. De manera similar, la detección de diferentes proteínas transportadoras puede modular la especificidad de los biosensores, con la detección de un conjunto putativo de transportadores de PcaK utilizando un biosensor sensible a PCA que conduce a la identificación de dos transportadores excepcionalmente capaces de absorber sustratos 3,5-hidroxilados, ampliando el conjunto de compuestos detectables por ese sistema²⁴.

Las plataformas automatizadas pueden convertirse en herramientas aún más poderosas para la caracterización y exploración al combinar los principios de DoE con modelos de aprendizaje profundo^46,47. Después de explorar por primera vez el espacio de diseño de un biosensor con una plataforma de alto rendimiento, se han aprovechado los algoritmos de aprendizaje automático para predecir la función de secuencias no caracterizadas con buena precisión ⁴⁷. Los métodos descritos en este protocolo podrían aplicarse fácilmente en la prueba de nuevos modelos de aprendizaje de idiomas para el diseño de promotores, similares a los modelos que se han desarrollado basados en la predicción de secuencias RBS cruzadas⁴⁸. Además, la integración de dichos modelos puede aprovechar los datos de función de secuencia contenidos en los diseños de promotores no funcionales y proporcionar información crítica sobre la funcionalidad más amplia del biosensor en su conjunto. Es decir, esto tendría el potencial de abordar una limitación crucial del flujo de trabajo de DoE, que los falsos positivos, por ejemplo, un promotor no funcional, no necesariamente equivalen a una salida medida de cero, con fenómenos como la transcripción espuria o la introducción de un elemento de ruido en los datos de DoE, que es difícil de identificar y controlar. Fundamentalmente, para abarcar el espacio total de diseño experimental, cualquier biblioteca generada debe exhibir una amplia gama de actividades, ya que un rango de actividad insuficiente dará como resultado resultados de diseño sesgados y creará falta de confiabilidad en cualquier modelo estadístico generado a partir del conjunto de datos³⁰. Si la baja variabilidad de la biblioteca se convierte en un problema, se puede implementar la exploración de otros elementos de secuencia o aumentar el grado de aleatorización, y la variación entre las bibliotecas se puede comparar hasta que se logre un grupo de variantes adecuado.

Un aspecto crucial del proceso de DoE implica la estimación y selección correctas de los efectos primarios y secundarios obtenidos del DSD que luego se incorporarán al análisis estadístico. DoE, al ser un enfoque basado en modelos, es muy propenso al sobreajuste y al sesgo, lo que puede complicar rápidamente el proceso de optimización al guiar los esfuerzos de ingeniería iterativa hacia secciones subóptimas del espacio de diseño⁴⁹. Como tal, es fundamental garantizar que cualquier diseño esté sólidamente aislado de tales efectos, tanto en la etapa de concepción como en el análisis de datos. En la fase inicial de diseño de cribado, las ejecuciones centradas en las que todos los factores se establecen en la media geométrica (es decir, 0,0,0,0) pueden ayudar a reducir el sesgo del modelo al tener en cuenta mejor las interacciones no lineales, sin añadir una carga experimental significativa (1-3 ejecuciones adicionales)⁴⁹. Además, incluir diseños aleatorios puede ayudar a tener en cuenta variables extrañas que no están incluidas en el diseño experimental pero que aún podrían influir en las variables de respuesta que se están midiendo. En un contexto biológico, la aleatorización aborda problemas como los efectos espaciotemporales, como la posición de la placa o la variación de lote a lote, evitando que dichos efectos afecten significativamente la interpretación de los datos. La atención a estos detalles en esta etapa temprana puede mejorar la solidez de los modelos y conducir a conclusiones más confiables. Después de realizar los experimentos sugeridos por DSD, se requiere un análisis estadístico de los datos para dilucidar aquellos factores que tuvieron un impacto significativo en los parámetros de salida. Los gráficos seminormales ofrecen una representación visual intuitiva de las magnitudes de los efectos, con efectos sin importancia que generalmente caen a lo largo de una línea recta, mientras que los efectos con un impacto significativo se desviarán de esta línea, lo que permite una selección simple de los factores más importantes en la optimización del biosensor. Teniendo esto en cuenta, se debe adoptar un enfoque conservador para la selección del efecto, como con todos los modelos, para reducir el riesgo de sobreajuste del modelo.

La capacidad de diseñar y optimizar rápidamente biosensores y otros circuitos genéticos acelerará enormemente el ritmo de la investigación en el campo de la biotecnología, como en el desarrollo de cepas y enzimas, pero también en el diagnóstico en tiempo real. La aparición de metodologías de cribado basadas en DoE en este campo es particularmente prometedora, facilitando el uso eficiente del tiempo y los recursos mientras se explora el máximo espacio de diseño posible, y ya se ha utilizado con gran efecto en la optimización de circuitos genéticos para vías metabólicas y para biosensores 31,33,34,51. DoE es particularmente adecuado para problemas de optimización multifactorial en los que funcionan muchas interacciones de primer, segundo o incluso tercer orden que de otro modo serían difíciles de interrogar con el enfoque típico de diseño experimental de un factor a la vez. Además, los esfuerzos para diseñar un aspecto de un biosensor a menudo resultan inadvertidamente en el sacrificio de otro parámetro, como mejorar la sensibilidad a expensas del rango dinámico⁵¹. A través de la capacidad del DoE para mapear tales interacciones ocultas, así como para crear modelos que predicen el comportamiento de los biosensores, el ciclo de aprendizaje de la prueba de construcción se acelera enormemente.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µ L CO-RE Puntas, estériles sin filtro	Hamilton	235939
Placa de pocillos profundos de 96 ml de 2,2 ml, pocillos cuadrados con fondos en forma de V	Termo	11594754
300 µ L CO-RE Puntas, NTR apiladas, estériles	Hamilton	235985
Fondo transparente de 96 pocillos, placas de microtitulación negras	Greiner	655097
Agarosa	Invitrogen	16500100
ADN plasmídico ensamblado	Suministrado por el usuario	NA
Lector de microplacas ClarioStar Plus	BMG	NA
Mezcla de solución de dexinucoleida (dNTP)	NEB	N0447L
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Fisher BioReaggents	BP231-100
Escalera de ADN 100bp	NEB	N3231L
Escalera de ADN 1KB	NEB	N3232L
Secuenciación de ADN	Fuente: Bioscience	NA
Síntesis de ADN	IDT	NA
Escherichia coli DH5α Células compotentes	NEB	C2987H
Tinte de carga de gel, púrpura x6 sin SDS	NEB	B7025S
Cubetas de electroporación de pulso genético/micropulsador, espacio de 0,2 cm	Biorad	1652082
Pad gráfico Prism 10	Teclado gráfico	NA
Manipulador de líquidos Hamilton Star	Hamilton	NA
HT multitron Incubadora de agitador de placas	Infors HT	NA
JMP Statistical Analysis Suite	JMP	NA
Caldo LB (Miller)	Molinero	L3522
LB Caldo (Molinero) con agar	Sigma	L3147
Electroporador MicroPulser	Biorad	1652100
Mezcla maestra de ensamblaje de ADN de alta fidelidad NEBuilder	NEB	E2621S
Q5 ADN polimerasa de alta fidelidad	NEB	M0491S
QIAprep Spin Midiprep Kit	QIAGEN	12143
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
Kit de extracción de gel QIAquick	QIAGEN	28706X4
Kit de purificación de PCR QIAquick	QIAGEN	28104
Qpix 420 Selector de colonias	Dispositivos moleculares del Reino Unido	NA
SOC Outgrowth Medium	NEB	B9020S
SYBR Tinción de gel de ADN segura	Invitrogen	S33102
Tampón TAE (Tris-acetato-EDTA, 50X)	Termo Fisher	B49
UltraPureTM Agua destilada sin DNASA/ARNas	Invitrogen	10977015