Ensayo Comet para cuantificar el daño en el ADN en células 32D que expresan mutantes FLT3 después de la exposición a inhibidores de FLT3 de tipo I y tipo II

La leucemia mieloide aguda (LMA) representa un trastorno clonal de células madre hematopoyéticas definido por la expansión patológica de progenitores mieloides indiferenciados, lo que resulta en supresión hematopoyética e insuficiencia de la médula ósea. La heterogeneidad molecular inherente de la LMA plantea importantes desafíos terapéuticos¹. De particular importancia clínica, las mutaciones en la tirosina quinasa 3 similar a FMS (FLT3) constituyen una de las alteraciones genéticas más prevalentes en la LMA, que ocurre en aproximadamente el 30% de los casos, y demuestran una fuerte correlación con resultados clínicos adversos². La tirosina quinasa del receptor FLT3 se activa en la membrana plasmática para mediar en las cascadas de señalización PI3K/AKT y RAS/MAPK, mientras que la variante mutante FLT3-ITD se retiene dentro del retículo endoplásmico, induciendo la fosforilación persistente del transductor de señal y activador de la transcripción 5 (STAT5). Estas alteraciones genéticas impulsan la leucemogénesis a través de múltiples mecanismos oncogénicos, principalmente a través de la desregulación de la transducción de señales, la señalización proliferativa incontrolada y la resistencia apoptótica³.

AC220 y gilteritinib, como inhibidores típicos de FLT3, inhiben la proliferación celular e inducen la apoptosis al suprimir la expresión de FLT3, pero con diferentes mecanismos de acción. Gilteritinib (un inhibidor de tipo I) no solo cubre un espectro más amplio de mutaciones activadoras de FLT3, sino que también inhibe la tirosina quinasa AXL, que está estrechamente relacionada con FLT3. A través de la inhibición dual, gilteritinib puede bloquear el crecimiento de células cancerosas de manera más completa⁴. AC220 (un inhibidor de tipo II) ejerce su efecto inhibidor a través de la unión competitiva a la conformación de quinasa activada, dirigiéndose específicamente al bolsillo de unión a ATP con alta especificidad⁵. Esta inhibición puede conducir a la detención del ciclo celular y al aumento del estrés de la replicación del ADN.

Gilteritinib se asocia con un riesgo bajo de resistencia y está indicado para monoterapia en LMA con mutación FLT3 en recaída o refractaria. AC220 es eficaz y selectivo para las mutaciones FLT3-ITD, con buenas tasas de respuesta clínica, pero es ineficaz para las mutaciones FLT3-TKD, y puede ser resistente a las mutaciones FLT3-TKD debido a mutaciones secundarias FLT3-TKD (por ejemplo, D835 o F691L) para desarrollar resistencia. Estos inhibidores han ganado prominencia en las terapias de LMA en función de la eficacia clínica demostrada y la mejora de los índices terapéuticos⁶. Sin embargo, el uso clínico de estos medicamentos se ve desafiado por la resistencia adquirida y los efectos fuera del objetivo. El uso a largo plazo de AC220 en la clínica conduce a resistencia debido a mutaciones FLT3-TKD, mientras que el uso a largo plazo de gilteritinib puede tener limitaciones para las mutaciones compuestas (p. ej., FLT3-ITD combinado con TKD) incluso si no da lugar a resistencia debido a mutaciones FLT3-TKD ^7,8.

Estas dos clases de inhibidores de FLT3 ejercen un doble efecto terapéutico al inducir indirectamente el estrés replicativo a través de la inhibición de FLT3 y el bloqueo de la señalización de la vía de señalización proliferativa-RAS-MAPK, PI3K-AKT-mTOR, STAT5. El bloqueo de la proliferación celular generalmente conduce a la detención del ciclo celular, alteraciones metabólicas (desregulación de la homeostasis redox) y, en última instancia, a la apoptosis ^9,10. Este mecanismo finalmente genera lesiones en el ADN que activan adaptaciones compensatorias de reparación del ADN en poblaciones celulares resistentes. El ensayo cometa permite la comparación cuantitativa de los perfiles de daño del ADN específicos del inhibidor en células mutantes FLT3. Este enfoque experimental proporciona información crítica para desarrollar terapias combinadas racionales que exploten las vulnerabilidades al daño del ADN, superando así la resistencia terapéutica adquirida.

Las metodologías contemporáneas para la detección de daños en el ADN abarcan el análisis inmunohistoquímico, la electroforesis en gel de agarosa de fragmentos de ADN, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la secuenciación de próxima generación (NGS), cada una de las cuales demuestra una alta sensibilidad analítica y especificidad¹¹. Sin embargo, estos enfoques están limitados por requisitos financieros sustanciales, duraciones de procesamiento prolongadas y condiciones experimentales estrictas. Esto subraya el imperativo de adoptar estrategias de detección que equilibren la precisión analítica con la simplicidad operativa.

El ensayo cometa se ha utilizado ampliamente en la evaluación de toxicología ambiental y genotoxicidad debido a su sensibilidad superior, accesibilidad técnica, cuantificación de daños en el ADN visualizada y amplia aplicabilidad en sistemas biológicos ^12,13. Se han establecido tres variantes metodológicas principales: ensayo de cometa alcalino para la detección de rotura de cadena simple / doble, ensayo de cometa neutro para análisis de rotura de doble cadena y ensayo de cometa modificado enzimáticamente para la identificación de lesiones específicas de ADN. ¹⁴

El principio metodológico implica: (1) Inducción de roturas de hebras de ADN a través del tratamiento experimental; (2) Disolución mediada por tampón de lisis de membranas celulares y nucleares, lo que permite la difusión de proteínas citoplasmáticas/nucleares y ARN en tampón de electroforesis, mientras que el ADN de alto peso molecular permanece inmovilizado en matriz de agarosa; (3) Desnaturalización alcalina (pH > 13) que induce el desenrollado del ADN y la liberación de fragmentos de ADN dañados; (4) Migración anódica impulsada por el campo electroforético del ADN fragmentado que crea una morfología característica del cometa, con ADN intacto que conserva la estructura nucleoide esférica^15,16. La cuantificación del daño en el ADN se logra mediante el análisis computarizado del porcentaje de ADN de la cola (TDP), lo que proporciona una medición precisa del impacto genotóxico con una resolución unicelular¹⁷.

Esta investigación empleó un marco experimental sistemático para comparar los efectos genotóxicos diferenciales de gilteritinib y AC220 en células 32D validadas con mutación FLT3. El diseño experimental comprendió dos componentes principales: (i) establecimiento de un modelo de daño del ADN específico de la mutación FLT3 y (ii) evaluación cuantitativa del daño al ADN inducido por fármacos a través de la metodología de ensayo de cometas alcalinos. La línea celular 32D con mutación FLT3 se mantuvo en condiciones estándar in vitro antes de la exposición a inhibidores de FLT3 diluidos en serie. La viabilidad celular se evaluó mediante ensayos CCK-8, con el posterior cálculo de los valores de concentración inhibitoria media máxima (IC₅₀) mediante análisis de regresión no lineal. Se eligió un valor de IC₅₀ quíntuple como umbral de inducción de daño en el ADN. Las células tratadas con fármacos se recolectaron e incrustaron en agarosa de bajo punto de fusión en portaobjetos para su posterior análisis. La separación electroforética se realizó a 24 V (~0,74 V / cm) y 300 mA durante 30 min en tampón alcalino, durante el cual el ADN fragmentado migró anódicamente para formar la morfología característica del cometa, mientras que el ADN intacto retuvo la configuración de nucleoides esféricos. La cuantificación del daño en el ADN se logró a través del análisis computarizado de imágenes del proyecto de software de ensayo cometa (CASP) que mide el momento de la cola, con valores aumentados del momento de la cola de oliva que se correlacionan directamente con la extensión de la fragmentación del ADN.

1. Construcción de un modelo de daño en el ADN en células 32D con mutaciones FLT3-ITD ¹⁸

1. Recuperación celular
   1. Con fórceps, transfiera rápidamente células 32D mutantes FLT3-ITD criopreservadas (almacenadas a -80 °C). Recupere los crioviales con fórceps y sumérjalos inmediatamente en un baño de agua con temperatura regulada (37 °C ± 0,5 °C) durante exactamente 60 s para completar la descongelación controlada.
      NOTA: Durante la descongelación, agite intermitentemente los crioviales en el baño de agua para asegurar un calentamiento uniforme.
   2. Centrifugar las muestras criopreservadas a 150 × g durante 5 min a 25 °C ± 1 °C. Aspire cuidadosamente el sobrenadante con pipetas serológicas estériles mientras retiene el sedimento celular.
   3. Agregue 1 ml de medio de crecimiento completo (RPMI 1640 + 10% de suero fetal bovino + 1% de penicilina/estreptomicina) al tubo de criopreservación. Realice una trituración suave a través de 10 ciclos de pipeteo secuenciales (volumen de 1 ml) para garantizar una resuspensión completa. Transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo celular de 100 mm y agregue 7 ml de medio completo para lograr un volumen final de 8 ml.
   4. Agite suavemente el recipiente de cultivo con cinco movimientos horizontales y cinco rotacionales. Mantenga las células en una incubadora humidificada a 37,0 °C ± 0,2 °C con un 5% de CO₂ y un 95% de humedad. Incubar durante 24 H antes del procesamiento experimental.
2. Evaluación de la viabilidad celular
   1. Seleccione células 32D mutantes FLT3-ITD en la fase de crecimiento logarítmico con buen estado celular para el experimento.
      NOTA: Las células en la fase de crecimiento logarítmico suelen tener un ciclo de división corto y una alta frecuencia de división celular.
      1. Observe la morfología y el estado de crecimiento de las células 32D con mutación FLT3-ITD utilizando un microscopio electrónico. Asegúrese de que se cumplan los criterios para los umbrales de proliferación celular: busque células che que tengan la forma de un solo glóbulo con bordes lisos, dispersión uniforme, pocos agregados, tamaño celular uniforme, integridad intacta de la membrana plasmática y desechos celulares < del 5%.
   2. Utilice un contador de células para determinar la concentración de la suspensión celular.
      NOTA: Mezcle las suspensiones celulares (10 ciclos de pipeteo secuenciales utilizando puntas estériles de 1 ml a una velocidad máxima de pipeta del 50 %).
   3. Estandarice la suspensión celular a 2.0 × 10⁵ células/ml en medio de crecimiento completo utilizando dilución iterativa. Con una pipeta, dispense alícuotas de 50 μl en los pocillos centrales (B2-G7) de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Llene los pocillos periféricos (A1-H12) con 100 μL de PBS estéril para mantener la humedad y minimizar los efectos de la evaporación de los bordes.
   4. Preparación del medio que contiene inhibidores de FLT3: seleccione nueve pocillos en una placa de cultivo celular de 12 pocillos y etiquételos de acuerdo con la escala de concentración de inhibidores de FLT3 (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250, 500 y 1000 nM). Agregue 400 μL de medio completo a los pocillos etiquetados como 10.0 μM y 200 μL de medio completo a los pocillos restantes.
      1. Dilución de Gilteritinib: Agregue 4 μL de reactivo Gilteritinib de 100 μM (Gilteritinib en dimetilsulfóxido) a cada uno de los pocillos marcados a 1000 nM con una pistola pipeta y mezcle bien la solución. Pipetee 200 μL de Gilteritinib de 1000 nM en los pocillos etiquetados como 500 nM y mezcle; luego pipetee 200 μL de Gilteritinib de 500 nM en los pocillos etiquetados como 250 nM y mezcle. Cada vez, tome 200 μL de la dilución anterior en el siguiente pocillo y mezcle para lograr la concentración deseada.
      2. Dilución de AC220: Agregue 4 μL de reactivo AC220 de 100 μM (AC220 en dimetilsulfóxido) a cada uno de los pocillos marcados a 1000 nM con una pistola pipeta. Siga el paso 1.2.4.1 para los otros pozos.
         NOTA: Asegúrese de que la solución madre del inhibidor de FLT3 en la pipeta se transfiera completamente a los pocillos para evitar la solución residual. Asegúrese de que la solución esté bien mezclada antes de proceder con la dilución.
   5. Incubación: Dispense medios que contengan inhibidores de FLT3 en pocillos designados (50 μl/pocillo) con una pipeta. Mantenga la placa de 96 pocillos en condiciones fisiológicas de cultivo (37,0 °C ± 0,2 °C, 5% de CO₂, 95% de humedad) durante exactamente 72 h ± 15 min.
   6. Alícuota de 10 μl de reactivo CCK-8 a todos los pocillos experimentales y de control en blanco utilizando una pipeta. Proteger la placa de la luz e incubarla en condiciones normóxicas (37 °C, 5% CO₂) durante 2,0 h ± 10 min.
      NOTA: Dispense el reactivo a baja velocidad de pipeta con una profundidad de inmersión de punta de 2 mm para minimizar la formación de burbujas. Evite las burbujas de aire durante la adición de muestras para evitar interferencias con las lecturas de OD.
   7. Retire la placa de 96 pocillos de la incubadora y mida la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas. Registre los resultados.
   8. Calcule el % de inhibición de acuerdo con la fórmula de cálculo IC₅₀ :
      Inhibición (%) = × 100%
      El pozo experimental del fármaco denota pocillos celulares tratados con el fármaco. El pozo de control celular denota pocillos celulares que no fueron tratados con el medicamento. Los pocillos de control en blanco indican medio solo sin celdas.
   9. Analizar los datos normalizados de dosis-respuesta a través de regresión no lineal, empleando un modelo logístico de cuatro parámetros. Haga clic en el botón Curva de ajuste para el ajuste de curvas. Derive la concentración inhibitoria media máxima (IC₅₀) a partir de la convergencia del modelo (R² > 0,98, suma residual de cuadrados < 0,15) y calcule los intervalos de confianza del 95% a través del remuestreo bootstrap de 1000 iteraciones.
3. Experimento de daño en el ADN de células 32D con mutación FLT3-ITD inducida por un inhibidor de FLT3
   1. Seleccione células 32D mutantes FLT3-ITD que exhiban un crecimiento acelerado (tiempo de duplicación de la población < 24 h) para la evaluación del daño del ADN.
   2. Cuente las celdas (consulte el paso 1.2.2 para obtener más detalles).
   3. Siembra celular: Ajuste la densidad de la suspensión celular a 1 ×^{10 6} celdas por placa, utilizando una placa de 6 cm de diámetro y 4 ml de suspensión celular por placa.
   4. Prepare tres réplicas para cada concentración de inhibidor: 55 nM de gilteritinib: 4 ml de medio + 2,2 μl de 100 μM de material, 0,15 nM AC220: 4 ml de medio + 6 μl de 100 nM de material. Mezclar las soluciones en vórtice y equilibrarlas a 37 °C durante 15 min; agite suavemente los tubos para asegurar una mezcla adecuada. Aspire el medio original y reemplácelo con 4 ml/plato de medio que contenga inhibidores recién preparado utilizando pipetas serológicas estériles.
   5. Incubar las células tratadas en condiciones fisiológicas (37 °C, 5% CO₂, 95% de humedad) durante intervalos definidos (0, 2, 4, 6 H). Procese los controles de tiempo cero de inmediato para la evaluación de daños en el ADN de referencia.
   6. Ensayo de exclusión de azul de tripano
      1. Centrifugar las células recogidas a 150 × g durante 1 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 1 ml de medio de cultivo.
      2. Pipetee 100 μL de células resuspendidas en un tubo de centrífuga de plástico, agregue 100 μL de tinción azul de tripano (2x), mezcle suavemente y tiñe durante 3 min.
      3. Cuente las celdas (consulte el paso 1.2.2 para obtener más detalles).
      4. Calcule la viabilidad celular de la siguiente manera:
         %Supervivencia celular = × 100%
         NOTA: Solo se procesaron muestras con viabilidad ≥90% para el ensayo cometa.

2. Preparación de reactivos y preparación de muestras celulares

1. Equilibrar la solución de lisis (que contiene 2,5 M de NaCl, 100 mM de EDTA, 10 mM de Tris, pH 10, 1% de Triton X-100, 10% de DMSO) a 4 °C ± 0,5 °C durante 30 min utilizando un frigorífico.
2. Derretir la agarosa de bajo punto de fusión (LMA) a 95 °C durante 15 min, luego mantenerla en un baño de agua a 37 °C para evitar la solidificación.
3. Prepare el tampón de electroforesis alcalina (300 mM de NaOH, 1 mM de EDTA, pH >13) pesando 12 g de NaOH con una balanza electrónica, pipeteando 2 ml de solución de EDTA 500 mM y luego agregando ddH₂O para hacer hasta 1 L del tampón.
4. Recolección de células
   1. Recoja la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar las suspensiones celulares a 800 × g durante 5 min. Aspirar los sobrenadantes mediante filtración al vacío.
      1. Vuelva a suspender suavemente las células en 1 ml de medio completo utilizando puntas de pipeta de 1 ml de diámetro ancho, seguidas de 10 inversiones verticales.
      2. Cuente las celdas como en el paso 1.2.
      3. Centrifugar la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 ml a 150 × g durante 5 min para eliminar todo el medio. Vuelva a suspender las células lavadas en PBS sin calcio a ~ 5.0 × 10⁵ células / ml.

3. Procedimiento de ensayo de cometas

1. Prepare previamente los portaobjetos de ensayo cometa y las muestras de células. Prepare una mezcla 10:1 (v/v) de agarosa LMA y suspensión celular (5 × 10⁵ células/ml) en tubos de 1,5 ml con una pipeta y mezcle suavemente. Dispense 55 μL de alícuotas de la mezcla de células de agarosa en portaobjetos cometa utilizando una pipeta sostenida en un ángulo de 45°, manteniendo una distancia de 2 mm de la superficie del portaobjetos. Colocar los portaobjetos recubiertos con la mezcla a 4 °C durante 30 min para evitar la luz.
   NOTA: Durante la adición de la mezcla de LMA y células a los portaobjetos de ensayo cometa, dispense la suspensión lenta y uniformemente para evitar la formación de burbujas y garantizar una distribución homogénea del gel.
2. Sumerja los portaobjetos solidificados en una solución de lisis preenfriada (que contiene 2,5 M de NaCl, 100 mM de EDTA, 10 mM de Tris, pH 10, 1% de Tritón X-100, 10% de DMSO) y realice la lisis durante ≥1 H a 4 °C en condiciones de protección contra la luz.
3. Después de la lisis, retire la corredera del lisado y use una pistola pipeta para aspirar la mayor cantidad de líquido posible alrededor de la paleta. A continuación, coloque el portaobjetos en un tampón de electroforesis alcalina (300 mM de NaOH, 1 mM de EDTA, pH >13) y preequilibre durante 1 h a 4 °C, teniendo cuidado de evitar la luz.
4. Electroforesis: Coloque los portaobjetos en una cámara de electroforesis y agregue suficiente solución de electroforesis alcalina para sumergir los portaobjetos. Realice electroforesis a 24 V (equivalente a 0,74 V/cm) con corriente constante (300 mA) durante 30 min utilizando tampón preequilibrado (4 °C) para minimizar el daño al ADN.
5. Neutralización: Después de la electroforesis, use una pistola de pipetas para aspirar la solución de electroforesis alcalina del portaobjetos, sumerja los portaobjetos durante 2 x 5 min en dH₂O y luego sumérjalos en etanol al 70% durante 5 minutos. Secar los portaobjetos en una incubadora a 37 °C durante 15 min.
6. Tinción: Aplicar una alícuota de 100 μL de tinción de ácido nucleico 1x YeaRed por pocillo e incubar durante 30 min a temperatura ambiente en condiciones de protección lumínica. Elimine el exceso de manchas mediante un suave enjuague acuoso seguido de un secado térmico a 37 °C.
7. Imágenes: Realice la visualización de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de 4x, con adquisición de imágenes digitales realizada en condiciones de exposición estandarizadas.

4. Tratamiento de datos

1. Realice análisis cuantitativos de imágenes para determinar los parámetros estándar del cometa, incluido el ADN de la cola (%), el momento de la cola de oliva y la longitud de la cola (μm).
   1. Abra la interfaz del software (Figura 5).
   2. Importe una imagen en el software, haga clic en Archivo y, a continuación, haga clic en Seleccionar archivo para importar la imagen que desea analizar al software. A continuación, mantenga presionado el botón del mouse y arrastre hasta que aparezca un cuadro azul. Arrastre el cuadro azul para asegurarse de que la celda que desea analizar esté encerrada dentro del cuadro. La opción Ajustar de la figura se puede utilizar para ajustar la posición del marco para incluir toda la celda (Figura 5).
   3. Antes de iniciar el análisis, haga clic en Iniciar y, a continuación, haga clic en Analizar. Los resultados del análisis de una sola célula se mostrarán en el lado derecho en 'Perfiles'. Después de analizar cada celda, haga clic en Guardar. Los parámetros que se pueden detectar se muestran en el lado derecho de 'Perfiles' y los valores numéricos de varios parámetros se muestran en la parte inferior. Finalmente, haga clic en Archivo | Exportar resultados. Los resultados obtenidos incluyen HeadArea, TailArea, HeadDNA, TailDNA, HeadDNA%, TailDNA%, HeadRadius, TailLength, CometLength, HeadMeanX, TailMeanX, TailMoment y OliveTailMoment.

El ensayo cometa se empleó sistemáticamente para cuantificar los perfiles de daño diferencial del ADN inducidos por gilteritinib y AC220 en líneas celulares mutantes FLT3. Los análisis mostraron que la diferencia en el daño del ADN entre las poblaciones celulares no tratadas con gilteritinib y AC220 no fue estadísticamente significativa (P > 0,05). Los aumentos dependientes de la dosis en los valores de ADN de la cola (%) y cola de momento oliva (OMT) alcanzaron significación estadística (P < 0,05) después de exposiciones de 2 a 6 H. OMT representa el producto del % de ADN en la cola y la 'distancia entre el centro de gravedad de la fluorescencia cabeza-cola'. Las diferencias en el ADN de la cola (%) y la cola de momento oliva (OMT) indican que AC220 causa más daño en el ADN a las células que gilteritinib (Figura 3 y Figura 4). En conclusión, este paradigma experimental establece de manera concluyente que el ensayo cometa puede ayudar a evaluar las diferencias de daño en el ADN de los inhibidores de FLT3 en modelos celulares mutantes.

Figura 1: Rastro de cometa producido por células mutantes FLT3 en respuesta a gilteritinib 55 nM. Células con mutación FLT3 (A) no tratadas con gilteritinib, (B) después de 2 H de tratamiento con gilteritinib, (C) después de 4 H de tratamiento con gilteritinib, (D) después de 6 H de tratamiento con gilteritinib. La flecha apunta al cometa que produjo una cola notable después del tratamiento químico. Barra de escala = 1,000 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Rastro de cometa producido por células mutantes FLT3 en respuesta a AC220 de 0,15 nM. Células mutantes FLT3 (A) no tratadas con AC220, (B) después de 2 H de tratamiento con AC220, (C) después de 4 H de tratamiento con AC220, (D) después de 6 H de tratamiento con AC220. La flecha apunta al cometa que produjo una cola notable después del tratamiento químico. Barra de escala = 1,000 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Efectos de gilteritinib y AC220 en el % de ADN de cola de células mutantes FLT3. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, frente a 0 H células no tratadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Efectos de gilteritinib y AC220 sobre la OMT de células mutantes FLT3. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, frente a 0 H células no tratadas. Abreviatura: OMT = Cola de momento oliva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Procedimientos operativos del software de análisis de cometas CASP. (A) Pantalla de visualización después de abrir el software, (B) Interfaz de visualización después de importar imágenes con éxito. La interfaz se muestra después de importar imágenes con éxito. Al hacer clic en el botón AJUSTAR , aparecerá el cuadro rectangular blanco con el que enmarcar los cometas individuales. (C) Haga clic en el botón de análisis en la barra de herramientas. El software dará los siguientes parámetros: % ADN de la cola, momento de la cola, momento de la cola de oliva, etc. (D) Botones utilizados durante la operación.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.