Un protocolo basado en fluorescencia para el cribado preliminar de inhibidores de síntesis de proteínas de fuentes naturales

Summary

Este protocolo introduce una metodología de cribado fluorométrico optimizada para identificar inhibidores naturales de productos o pequeñas moléculas en la síntesis de proteínas. Su viabilidad la hace adecuada tanto para la enseñanza de grado en técnicas de descubrimiento de fármacos como para su implementación en campañas de química medicinal.

Abstract

Los productos naturales representan una rica fuente de compuestos terapéuticos con aplicaciones en múltiples enfermedades, especialmente el cáncer. Al aprovechar estas biomoléculas como plantillas estructurales en el descubrimiento de fármacos, los investigadores han logrado tanto plazos de desarrollo más rápidos como una mayor efectividad biológica en comparación con compuestos totalmente sintéticos. La vía de síntesis de proteínas se ha convertido en un objetivo atractivo para productos naturales, especialmente dado su implicamiento en cánceres difíciles de tratar. El potente inhibidor de la síntesis de proteínas cicloheximida, derivado de Streptomyces griseus, ejemplifica el potencial de compuestos naturales en este ámbito. A medida que estos derivados de productos naturales se desarrollan en moléculas similares a fármacos, confirmar su actividad inhibitoria de síntesis proteica sigue siendo un paso crucial para la validación. El objetivo principal es proporcionar un protocolo amigable para estudiantes de grado que permita una evaluación rápida de la actividad inhibidora del compuesto. El protocolo emplea un sustrato fluorescente y técnicas avanzadas de microscopía de fluorescencia para detectar y medir sistemáticamente las capacidades inhibitorias de estos productos naturales. El estudio examinó compuestos derivados de dos especies vegetales: Pinus sylvestris y Psoralea corylifolia. Utilizando la cicloheximida como inhibidor de referencia, ambos productos naturales mostraron distintos niveles de inhibición de la síntesis proteica.

Introduction

La síntesis de proteínas implica procesos altamente regulados: transcripción y traducción. Durante la transcripción, se copian secuencias de ADN de los genes, produciendo ARN mensajero (ARNm). La enzima ARN polimerasa trabaja para separar la doble hélice del ADN y utiliza una cadena como guía para construir una molécula de ARNm que coincida. Una vez que el ARNm está completamente formado, viaja desde el núcleo hasta el citoplasma para su traducción. La traslación ocurre en el ribosoma, donde el ARNm se utiliza como plantilla para ensamblar aminoácidos en una cadena polipeptídica. Esta cadena polipeptídica, al salir del túnel de salida del ribosoma, se plega en una proteína funcional. La transcripción está regulada principalmente por factores de transcripción, modificaciones de la cromatina y ARN reguladores, mientras que la traducción se regula por factores de iniciación, vías de señalización y mecanismos de estabilidad del ARN. Estos sistemas reguladores permiten a las células mantener las funciones celulares y responder eficazmente al estrés o^{daño 1}.

La gran mayoría de los cánceres humanos —aproximadamente el 85%— se manifiestan como tumores^{sólidos 2}. Aunque estos tumores pueden variar mucho en sus características y comportamientos específicos, tienden a compartir ciertos rasgos y patrones fisiológicos comunes, como la síntesis de proteínas alterada independientemente de su etiología o posición^{anatómica 3}. Las células cancerosas desregulan la síntesis de proteínas al secuestrar la maquinaria traslacional para soportar sus altas demandas energéticas y crecimiento descontrolado. Esta reprogramación es resultado de la desregulación de casi todas las principales vías de señalización oncogénicas, promoviendo la supervivencia, proliferación y metástasis celular, mientras suprime las vías de muerte^{celular 4}. En las células tumorales, la maquinaria para fabricar ribosomas se descontrola, permitiendo una mayor producción de proteínas y una rápida división celular. Dado que esta síntesis de proteínas mejorada es crucial para la supervivencia al cáncer, los tratamientos que actúan y bloquean este proceso muestran potencial como terapias^{potenciales 5}. Por lo tanto, investigaciones centradas en factores de traducción específicos del cáncer, composiciones ribosómicas únicas o vías de señalización alteradas que regulan la síntesis de proteínas podrían dar lugar a inhibidores más dirigidos con ventanas terapéuticas mejoradas.

Dado que los productos naturales (NP) son conocidos por su amplia variedad de actividad biológica, el desarrollo de inhibidores selectivos de síntesis proteica para el tratamiento del cáncer utilizando sus andamios es un enfoque^{prometedor 6,7}. Los NP pueden atacar diferentes componentes de la maquinaria de síntesis de proteínas, desde la unión de ribosomas hasta la interferencia con factores de inicio o procesos de elongación, lo que los convierte en puntos de partida invaluables en el desarrollo de fármacos para inhibidores de síntesis de proteínas en tumores^{sólidos 6}. La capacidad de detectar rápidamente compuestos para detectar la actividad deseada sirve como un punto de entrada crucial para las plataformas de descubrimiento de fármacos que buscan identificar eficazmente los resultados NP. Normalmente, el cribado de alto rendimiento de compuestos utiliza ensayos de fluorescencia para reducir rápidamente la detección de moléculas candidatas al^{plomo 8}.

Científicos de todo el mundo se basan en técnicas basadas en la fluorescencia como herramientas esenciales para analizar sistemas biológicos. Estos enfoques se utilizan ampliamente para estudiar procesos celulares, permitiendo a los investigadores seguir las interacciones biomoleculares en tiempo^{real 9}. Cuando se combinan con reacciones bio-ortogonales de química de clic, estos métodos pueden permitir la visualización precisa de la síntesis de^{proteínas 10}. El ensayo de síntesis de proteínas fluorescentes presentado es una técnica no radiactiva para evaluar la síntesis de proteínas que utiliza O-propargil-puromicina (OPP), un análogo de puromicina permeable a las células que contiene alquino. Tras el tratamiento celular, la OPP se incorpora en el extremo C de las cadenas polipeptídicas alargadas, causando la terminación de la traducción. Estas proteínas truncadas marcadas con alquinos se detectan mediante química de clics catalizada por cobre acoplada a 5 FAM-azida.

Este ensayo fluorométrico es una herramienta de investigación valiosa y un método accesible de biología química para formar a estudiantes de grado. Al proporcionar un protocolo accesible y eficiente con un procesamiento mínimo de datos, proporciona a los estudiantes experiencia práctica en técnicas modernas de descubrimiento de fármacos y acelera el proceso de descubrimiento. A medida que crece la demanda de nuevos inhibidores de síntesis proteica, este enfoque dota a los estudiantes de grado de oportunidades significativas de investigación, al tiempo que contribuye a los avances en la terapéutica contra el cáncer.

Protocol

1. Preparación de reactivos a partir del kit

NOTA: Mezcla adecuadamente, centrifuga y mantén todos los reactivos en hielo hasta el uso.

1. Organizar y obtener el kit de inhibición de síntesis de proteínas, el buffer PBS, el medio de cultivo celular, las placas tratadas con cultivo celular, tubos centrífugos cónicos estériles de polipropileno de 15 mL, tubos centrífugas de 2 mL, pipetas p10, p200 y p1000, y las puntas adecuadas.
2. Prepara el buffer de lavado.
   1. Descongela el buffer de lavado 10x a 37 °C cubriendo el vial con la mano. Utiliza el calor corporal de las manos para descongelarlo y comprueba con frecuencia si el descongelamiento está completo.
   2. Diluye las culatas de 10x wash buffer 1:10 en agua desionizada en un tubo de centrífuga. Mezcla por inversión o resuspensión pipeteando arriba y abajo. Guárdalos en hielo hasta que se usen.
3. Descongela la solución fijadora a temperatura ambiente. Guárdalos en hielo hasta que se usen.
4. Prepara el buffer de permeabilización.
   1. Descongela el tampón de permeabilización 10x a 37 °C cubriendo el vial con la mano. Utiliza el calor corporal de las manos para descongelarlo y comprueba con frecuencia si el descongelamiento está completo.
   2. Diluye la 10x de la culata 1:10 en agua desionizada en un tubo de centrífuga. Mezcla los componentes por inversión o resuspensión pipeteando arriba y abajo. Guárdalos en hielo hasta que se usen.
5. Descongela 400x la marca proteica, 100x azida fluorescente, 100x cicloheximida, tinción de ADN y el agente reductor 20x a temperatura ambiente. Mantente en hielo en un entorno oscuro mientras lo uses. Cubre los tintes con papel de aluminio o guárdalos en una nevera a 2 °C cuando no los uses.

2. Controles de etiquetado y células experimentales

NOTA: Este protocolo fue desarrollado utilizando células de cáncer de mama epitelial y adherentes estables MDA-MB-231. Se pueden utilizar líneas celulares adherentes. Todos los pasos listados a continuación utilizan una placa de 96 pozos, y todos los volúmenes y concentraciones se calculan para dos compuestos de prueba y dos controles con un volumen de trabajo de 100 μL.

1. Cultivo de células adherentes de mamíferos
   NOTA: Las células deben expulsarse antes de alcanzar una confluencia del 80-90% para mantener un crecimiento sano y exponencial y evitar la inhibición o diferenciación por contacto.
2. Descongela un frasco de celdas criopreservadas a temperatura ambiente y luego diluye con el medio adecuado.
3. Centrifuga la suspensión para pelletar las células y aspirar el sobrenadante. Suspende el pellet en un medio fresco y transfiere a un nuevo matraz con la densidad celular adecuada.
4. Una vez que las células estén al 80% confluentes, retira el medio y aspira el medio de crecimiento antiguo del matraz. Luego, enjuaga las células con PBS estéril para eliminar el suero residual, que inhibe la tripsina. Añade solución de tripsina-EDTA para cubrir la capa celular e incuba durante 3-5 minutos o hasta que las células se desprendan a 37 °C.
5. Añade un medio completo que contenga suero para inactivar la tripsina, luego transfiere la suspensión celular a un tubo, mezcla suavemente y cuenta las células.
6. Las células semilla en placas de cribado diluyen las células en la proporción de división adecuada (por ejemplo, 1:3 o 1:5) en matrazas frescas con nuevo medio e incuban (normalmente 37 °C, 5% CO₂) para obtener la concentración celular deseada.
   NOTA: Para el experimento descrito aquí, la línea celular se emplacó a 2 × 10⁴ por pozo (placa de 96 pozos) e incubada a 37 °C durante 12 horas.

3. Adición de compuestos

1. Prepara la mezcla maestra A.
   1. Etiqueta un tubo de centrífuga como "A". Pipetear 598,5 μL de medio de cultivo y 1,5 μL de marcador proteico en "A". Vuelve a suspender la mezcla para asegurar la homogeneidad pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
2. Prepara la mezcla maestra B.
   1. Etiqueta un tubo de centrífuga como "B". Pipete 1,5 μL de marcador proteico, 6,6 μL de cicloheximida y 591,9 μL de medio de cultivo en "B". Vuelve a suspender la mezcla para asegurar la homogeneidad pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
3. Trata las células con compuestos deseados (Figura 1), controles positivos y negativos.
   1. Retira las células de la incubadora y retira el medio de crecimiento mediante aspiración. Inclina la placa y aspira por el lateral del pozo en lugar del centro para evitar la alteración de las células.
   2. Pipetear 1 μL de compuesto de ensayo en un pozo y 1 μL de vehículo compuesto de ensayo (0,1% v/v DMSO) en un pozo. Para estudios duplicados, añadir cada muestra a un segundo pozo y repetir este proceso. Añade 99 μL de mezcla maestra A en estos pozos. Pipetea suavemente en ángulo hacia el lateral del pozo para evitar la alteración cinética de las células.
      NOTA: La concentración máxima de DMSO para el cribado de compuestos depende del tipo celular y del ensayo, pero las directrices generales son: 0,1-0,5% de DMSO — generalmente seguro para la mayoría de los ensayos celulares con toxicidad mínima, y 1 % de DMSO — máximo y aceptable comúnmente utilizado para muchos tipos celulares en ensayos a corto plazo.
   3. Pipete 100 μL de mezcla maestra B en dos pozos. Haz una pipeta en ángulo hacia el lateral del pozo para evitar la alteración de las células.
   4. Golpea suavemente la placa para conseguir incorporar los componentes deseados a las celdas. Incubar las células a 37 °C durante 0,5-2 horas.

4. Finalización del experimento y lavado de células

1. Elimina el medio de cultivo mediante aspiración. Inclina la placa y aspira por el lateral del pozo en lugar del centro para evitar la alteración de las células.
2. Añade 100 μL de buffer PBS en cada pozo y centrifuga la placa a 900 × g durante 5 minutos.
3. Retira el buffer PBS mediante aspiración.

5. Fijación y permeabilización

1. Añadir 100 μL de solución fijadora a cada pozo. Incuba las células a temperatura ambiente durante 15 minutos en un ambiente oscuro.
2. Elimina la solución fijadora mediante aspiración. Inclina la placa y aspira al lado del pozo en lugar de al centro.
3. Lava las células con 100 μL de tampón de lavado y retira el tampón por aspiración. Repite este paso dos veces.
4. Añade 100 μL de tampón de permeabilización a cada pozo e incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos.
5. Elimina el buffer de permeabilización mediante aspiración. Inclina la placa y aspira al lado del pozo en lugar de al centro.

6. Reacción y tinción de proteínas

1. Prepara la mezcla maestra de cóctel de reacción.
   1. Añadir 651 μL de tampón PBS, 7,0 μL de reactivo de cobre 100x, 7 μL de azida fluorescente y, finalmente, 35 μL de agente reductor a un tubo de centrifugadora. Resuspende esta mezcla para asegurar la homogeneidad.
      NOTA: Sigue este orden exacto al añadir los reactivos. Úsalo en un plazo de 15 minutos desde la preparación.
2. Añade 100 μL del cóctel de reacción a cada pozo. Incuba las células durante 30 minutos a temperatura ambiente en un ambiente oscuro para evitar el fotoblanqueamiento.
3. Centrífuga las celdas a 900 × g durante 5 minutos. Equilibra la centrífuga añadiendo placas vacías para distribuir el peso de forma uniforme. Retira la mezcla por aspiración.
4. Lava las células con 100 μL de tampón de lavado y retira el tampón por aspiración. Repite este paso dos veces.

7. Tinción de ADN

1. Prepara una dilución 1x de la tinción total de ADN y añade 100 μL a cada pozo. Incuba las células a temperatura ambiente durante 20 minutos en un ambiente oscuro para evitar el blanqueamiento fotográfico.
2. Centrifuga la placa a 900 × g durante 5 minutos. Equilibra la centrífuga añadiendo placas vacías para distribuir el peso de forma uniforme. Retira la mezcla por aspiración.
3. Lava las células con 100 μL de tampón de lavado y retira el tampón por aspiración. Repite este paso dos veces.
4. Resuspende las células con 100 μL de buffer PBS refrigerado para prepararlas para la imagen.

8. Imagen

1. Inserta la placa en el lector de placas.
2. Pon la ampliación a 20x.
3. Analizar la tinción del núcleo con el canal GFP de 469/525 nm. Utiliza el autobinning y el autoenfoque para mejorar los resultados de imagen.
4. Analizar la síntesis activa de proteínas con el canal Texas Red 586/647nm. Utiliza el autobinning y el autoenfoque para mejorar los resultados de imagen.

Results

Este ensayo utilizó fluorescencia para visualizar y cuantificar la capacidad de diferentes productos naturales para inhibir la síntesis de proteínas. La cicloheximida (CHX) es un inhibidor conocido de la síntesis de proteínas cuyo modo de acción implica interferir con el proceso de translocación durante la^{elongación 11}. Para este estudio, se detectaron células vivas con un colorante nuclear fluorescente verde. OPP es un derivado de la puromicina que se une covalen...

Discussion

Este protocolo proporciona una metodología de cribado fluorométrico para analizar productos naturales y moléculas pequeñas con el fin de evaluar su capacidad para inhibir la síntesis de proteínas. La simplicidad de este protocolo permite a los investigadores de grado implementarlo correctamente, permitiéndoles hacer contribuciones sustantivas al conocimiento científico. El protocolo exige una comprensión básica de los métodos y técnicas biológicas, con pasos que requieren una ejecución c...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lector de celdas multimodo Agilent Biotek Cytation 1	Agilent	BTCYT1V
Compuesto 1 (Dehidroabietilamina, CAS 1446-61-3)	Enamine	EN300-7409771
Compuesto 2 (Bakuchiol, CAS 10309-37-2)	ChemFaces	CFN99047
Heraeus Megafuge 16R	Thermo Scientific y nbsp;	75004271
Placa Ibidi Gmbh-slide de 96 pozos	Ibidi	80826
Líneas celulares MDA-MB-231	ATCC	ATCC HTB-26
Solución salina tamponada con fosfato pH 7,4	ATCC	ATCC 30-2200
Kit de análisis de síntesis de proteínas (Verde)	Abcam	Ab239725