Sonda de hibridación dividida que utiliza un aptámero de iluminación fluorescente de ADN como reportero de señal para el análisis de ácidos nucleicos específicos de la secuencia

Resumen

Este protocolo describe el diseño de sondas de hibridación dividida que utilizan el aptámero de luz fluorescente DAP-10-42 como reportero de señal y su aplicación para la detección y diferenciación de ácidos nucleicos entre objetivos con sustituciones de un solo nucleótido.

Resumen

Los aptámeros fluorescentes luminosos (FLAP) basados en ADN son prometedores para los ensayos bioanalíticos porque proporcionan una lectura de señal fluorescente de bajo coste sin necesidad de marcar los reporteros de señales de ácido nucleico con fluoróforos y/o extintores, a diferencia de las sondas de hibridación convencionales utilizadas para la detección instantánea de ácidos nucleicos. En cambio, los FLAP se unen de forma no covalente a los ligandos de colorante, que exhiben una fluorescencia intrínsecamente baja en soluciones acuosas, pero se vuelven altamente emisores al unirse a FLAP. Este protocolo describe un algoritmo para diseñar sensores de aptámero de luz dividida (SLAS) utilizando DAP-10-42, el FLAP de ADN más eficiente reportado hasta ahora. Cuando está equipado con secuencias de ácido nucleico complementarias a un objetivo de ácido nucleico de interés, SLAS es una herramienta prometedora para el análisis de ácidos nucleicos que permite la detección específica de secuencia de objetivos de ácido nucleico con selectividad de hasta un nucleótido para permitir el análisis de sustituciones de un solo nucleótido (SNS). Los SLA ofrecen la ventaja de una lectura de señal basada en fluorescencia sin marcadores, que se puede medir con un espectrofotómetro fluorescente convencional basado en cubeta, un fluorómetro portátil u observar visualmente la excitación con una fuente de luz portátil. El enfoque SLAS es beneficioso para las aplicaciones de biodetección en el diagnóstico de enfermedades, el monitoreo ambiental y la investigación biomolecular.

Introducción

El análisis de ácidos nucleicos mediante sondas de hibridación se realiza de forma rutinaria para detectar y cuantificar secuencias específicas de ADN/ARN¹. Una de las sondas de hibridación más exitosas es la sonda Molecular Beacon (MB), que es un ADN en forma de horquilla
oligonucleótido marcado con un fluoróforo y un extintor en el extremo opuesto ^2,3. Detecta instantáneamente (sin necesidad de lavar el complejo sonda-objetivo por el exceso de la sonda) detecta la presencia de una secuencia de ácido nucleico complementaria al fragmento de bucle de la sonda y se utiliza habitualmente en la PCR cuantitativa (qPCR). La necesidad de unir covalentemente dos colorantes, el fluoróforo y el extintor, a la secuencia de oligonucleótidos de la sonda aumenta el costo, particularmente cuando se necesita una nueva sonda MB dirigida a una nueva secuencia de ácido nucleico. Alternativamente, la sonda MB se puede utilizar como un reportero de señal en un formato de sonda de hibridación multicomponente (dividido), en el que dos oligonucleótidos no marcados interactúan tanto con el objetivo como con el reportero de la sonda MB⁴. El enfoque de sonda multicomponente mejora la selectividad para el reconocimiento de ácidos nucleicos y mejora la unión de la sonda a objetivos estructurados ^5,6,7, Este enfoque, sin embargo, no erradica la necesidad de marcaje covalente del reportero con un fluoróforo⁸.

Los aptámeros fluorescentes iluminados (FLAP)⁹ son aptámeros que tienen afinidad con los tintes sensibles al medio ambiente (fluorógenos) de baja fluorescencia, donde la unión por FLAP mejora la fluorescencia del colector de fluorógenos. A diferencia de las sondas marcadas con fluorescencia y los reporteros de señal, los FLAP no requieren que los elementos de detección se marquen covalentemente con uno o más colorantes y, por lo tanto, ofrecen la ventaja de la detección de fluorescencia sin etiquetas¹⁰. Esto es particularmente importante durante el paso de optimización, cuando es necesario probar docenas de construcciones de ácidos nucleicos para lograr un rendimiento satisfactorio del ensayo. Además, los ensayos FLAP se pueden optimizar ajustando la concentración de un sensor de fluorógeno y/o FLAP en lugar de cambiar el diseño del sensor. Estas ventajas pueden ser significativas para los laboratorios de investigación y enseñanza de bajo presupuesto. Los FLAPs de ADN son particularmente prometedores como reporteros de señales de sondas de hibridación multicomponente denominadas Sensores de Aptámero Iluminados Divididos (SLAS)¹¹. El FLAP de ADN más eficiente reportado hasta ahora es DAP-10-42, que fue seleccionado originalmente para mejorar la fluorescencia de los colorantes de dapoxilo sulfonilo¹², con una capacidad promiscua para unirse y mejorar la fluorescencia de una variedad de colorantes de arail metano (por ejemplo, auramina O, AO; violeta cristalino, CV)¹³. DAP-10-42 se ha convertido en SLAS para ser utilizado en el análisis de ácidos nucleicos 13,14,15.

El objetivo del método descrito aquí es permitir el análisis específico de la secuencia de los objetivos de interés de los ácidos nucleicos utilizando hebras SLAS sin marcaje y un colorante fluorogénico como componente tampón. Este protocolo describe un algoritmo para diseñar SLAS basado en DAP-10-42 y destaca el rendimiento de SLAS para la detección altamente selectiva de secuencias de ácidos nucleicos que difieren en tan solo un nucleótido.

El ensayo de detección de ácidos nucleicos SLAS requiere que se utilicen dos oligonucleótidos de ADN no modificados sintetizados a medida a una concentración final de 0,5-1 μM para obtener el máximo rendimiento. El protocolo descrito aquí utiliza un colorante de auramina O (AO) disponible comercialmente como fluorógeno. La concentración final de AO en el ensayo oscila entre 1 y 10 μM para garantizar un alto aumento de la fluorescencia en presencia de un objetivo de ácido nucleico específico sobre el blanco (ausencia del objetivo; Figura complementaria 1). Los componentes necesarios del tampón de ensayo son los iones de potasio y magnesio (Figura complementaria 2). Los iones de potasio (1,25-40 mM) estabilizan el dominio G-cuádruple propuesto del FLAP utilizado como reportero de señal. Los iones de magnesio (2,5-50 mM) reducen la repulsión de los grupos fosfato cargados negativamente en las interacciones SLAS-objetivo. La temperatura del ensayo SLAS utilizando las secuencias notificadas para el dominio de notificación de señales no debe exceder de 28 °C para evitar la pérdida de rendimiento¹⁶.

El SLAS es compatible con dianas de ácidos nucleicos monocatenarios, como los amplicones de ADN de la PCR asimétrica o una reacción de amplificación de ADN isotérmica (por ejemplo, la amplificación de la polimerasa recombinasa, RPA¹⁷), los productos de ARN procedentes de la amplificación mediada por la transcripción (TMA) o la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA)¹⁸, y las moléculas de ARN nativo como el miARN, el ARNr o el ARNnc). Las variaciones en la secuencia de nucleótidos del objetivo hasta un solo nucleótido se pueden detectar utilizando el enfoque SLAS^13,14.

Protocolo

1. Diseño del sensor de aptámero de luz dividida (SLAS) con DAP-10-42 como reportero de señal

1. Diseñar las secuencias de dos hebras de oligonucleótidos de ADN no modificados que constituyen SLAS. Utilice un fragmento que contenga nucleótidos (nts) 4,6-39 de DAP-10-42 (Tabla 1, Figura 1A).
2. Convierta la secuencia del tallo 1 (nts 1-8 y 36-42) en tallo 1' eliminando un residuo de timina abultado en la posición nt 5, acortando el tallo a 4 pb (nts 4,6-8 y 36-39) y agregando un bp C-G terminal (Figura 1A, paso 1). Además, una de las hebras de SLAS contiene nts 9-29 de la secuencia central DAP-10-42, mientras que otra hebra de SLAS contiene nts 30-35 de la secuencia.
3. Extienda la secuencia 3'-terminal del fragmento que contiene nts 9-29 con d(GGTCAT), y la secuencia 5'-terminal del fragmento nts 30-35 con d(ATGACC) para formar un tallo 2 de 6-pb (Figura 1A, paso 2).
   NOTA: Los pares de bases T4-A39, A6-T38, C7-G37 y G8-C36 del vástago 1 en DAP-10-42 son necesarios para la función de iluminación del aptámero. La secuencia del tallo 1' puede modificarse solo en el terminal bp y puede ser un par de bases G-C, A-T, T-A o extendida con 1-2 pares de bases según sea necesario. La secuencia del tallo 2 es arbitraria y se puede cambiar. Sin embargo, se recomienda preservar la estabilidad termodinámica del vástago 2 a menos que la temperatura del ensayo se eleve por encima de 28 °C. El acortamiento o la desestabilización del tallo 2 evita la unión prematura del tinte sin un objetivo si se observa un fondo alto del ensayo fluorescente basado en SLAS. También se permite la división de la secuencia de nucleótidos DAP-10-42 entre nts 28-29, 27-28 o 26-27 en lugar de nts 29-30 (Figura 1B).
4. Para adaptar el SLAS diseñado a un objetivo o interés de ácido nucleico, extienda el tallo 1' con secuencias de ADN complementarias a los fragmentos de unión objetivo-objetivo (brazos) a través de enlazadores d(TT) (Figura 1A, paso 3). Esto produce las secuencias de hebras SLAS-U y SLAS-S que constituyen la sonda.
5. Haga que el brazo de unión a dianas de SLAS-S sea complementario a un fragmento de 7-10 nt de la diana que contiene el sitio SNS, y el brazo de unión a dianas de SLAS-U, complementario a un fragmento de 15-25 nt del objetivo adyacente al brazo de unión a dianas de SLAS-S (Tabla 1).
   NOTA: Es opcional si conectar el brazo de unión al objetivo de SLAS-S con nt 4 o nt 39 de la secuencia DAP-10-42 (Figura 1, brazo 1 o brazo 2, respectivamente).
6. Evalúe la temperatura de fusión (T_m) de los dúplex entre el objetivo de interés y los brazos de unión al objetivo de SLAS-S y SLAS-U utilizando el servidor web UNAFold (unafold.org)¹⁹.
   1. Haga clic en la pestaña DINAMelt en la parte superior de la página web; vaya a Aplicaciones y seleccione Hibridación por fusión en dos estados (Figura complementaria 3A). En la página Hibridación de fusión de dos estados, ingrese una de las secuencias que interactúan en el cuadro de la izquierda y otra en el cuadro de la derecha (Figura complementaria 3B). Asegúrese de que ambas secuencias estén en orden de 5' a 3'. Puede introducir más de un par de secuencias que interactúan separándolas con punto y coma.
   2. En la parte inferior de la página, indique la temperatura del ensayo (22 °C), las concentraciones de cationes monovalentes y divalentes (20 mM y 25 mM, respectivamente) para que coincidan con las condiciones del ensayo. Indica la concentración de las secuencias que interactúan.
   3. Presione enviar (Figura complementaria 3B). Observe los resultados que incluyen el cambio de energía de Gibbs, el cambio de entalpía y el cambio de entropía del enlace, así como los valores de T_m para los dúplex correspondientes (Figura complementaria 3B).
   4. Asegúrese de que los valores de T_m para los dúplex entre el objetivo totalmente coincidente (M) y los brazos de unión al objetivo de SLAS-S y SLAS-U estén por encima de la temperatura de ensayo, que es de 22 °C en el protocolo actual. Aquí, los valores de T_m fueron de 32,2 °C y 74,4 °C, respectivamente (Figura complementaria 3C).
   5. Asegúrese de que el dúplex entre SLAS-S y un objetivo no coincidente (MM) que contiene un SNS tenga una T_m por debajo de la temperatura de ensayo. Esto asegura una alta selectividad del reconocimiento del objetivo de la sonda, evitando que el fluorógeno AO señale la presencia del analito del ácido nucleico objetivo si contiene un SNS en el fragmento de unión a SLAS (Figura 2). En este caso, la T_m fue de 21,3 °C (Figura suplementaria 3C), lo que fue suficiente para discriminar el desajuste del complejo emparejado.
   6. Ajuste las secuencias de los brazos de unión al objetivo acortando o extendiendo los fragmentos complementarios al objetivo, si es necesario, para cumplir con los requisitos de estabilidad indicados.
7. Obtenga las hebras diseñadas SLAS-S y SLAS-U de cualquier proveedor comercial que suministre oligonucleótidos de ADN hechos a medida o sintetice las hebras de ADN internamente utilizando un sintetizador de oligonucleótidos automatizado.

Figura 1: Conversión de un aptámero fluorescente con luz (FLAP) DAP-10-42 en un sensor de aptámero iluminado dividido (SLAS). (A)La estructura secundaria de DAP-10-42¹² se predice mediante una aplicación de plegamiento de ADN del UNAFold Web^{Server 19} a 22 °C, 20 mM Na⁺, 25 mM Mg²⁺. El aptámero presenta una estructura secundaria de horquilla con un núcleo que presumiblemente se pliega en un motivo G-cuádruple estabilizado por el tallo 1. Para que DAP-10-42 se convierta en un SLAS, (1) el tallo 1 del aptámero se acorta a 4 pb y se flanquea por un g-C bp adicional para hacer el tallo 1'; (2) la secuencia central se divide entre NTS 29 y 30, con los lados 3' y 5' del sitio dividido extendidos con secuencias complementarias d(GGTCAT) y d(ATGACC), respectivamente, para formar el tallo 2; (3) el vástago 1' se extiende con las secuencias complementarias a los fragmentos adyacentes de un objetivo de interés: brazos de unión al objetivo, con un enlazador d (TT) entre los brazos de enlace al objetivo y el dominio de notificación de señal de la sonda. (B) El núcleo también se puede dividir entre nts 28-29, 27-28 o 26-27 sin pérdida significativa de la señal y / o aumento del pliegue de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Mecanismo de generación de señales SLAS. El SLAS se compone de dos hebras, SLAS-U y SLAS-S, y un colorante fluorogénico (por ejemplo, Auramine O; AO). En ausencia de un objetivo de ácido nucleico de interés, ambas hebras están en estado disociado e incapaces de unirse al tinte; No se observa ninguna señal (centro). En presencia de un objetivo M totalmente coincidente, tanto SLAS-U como SLAS-S se hibridan con el fragmento adyacente de M para acercar los fragmentos del núcleo. Esto permite la formación del sitio de unión del tinte. La unión de AO mejora su fluorescencia, que se mide como una lectura de señal fluorescente (izquierda). En presencia de un MM objetivo no coincidente que contiene una sustitución de un solo nucleótido (SNS) en un fragmento que interactúa con SLAS-S, solo SLAS-U puede hibridarse con el objetivo MM , mientras que SLAS-S está en el estado disociado. Esto evita la formación del sitio de unión del tinte y no se observa ninguna señal (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Amplificación de la secuencia dirigida

1. Amplificar un fragmento del gen que se va a analizar con el ensayo SLAS. Para la amplificación de PCR o RPA, utilice condiciones asimétricas (por ejemplo, con el cebador directo agregado con un exceso de 10 veces sobre el cebador inverso) para generar un amplicón monocatenario. Para amplificar un fragmento de 126 nt del gen NANOGP8 utilizando PCR lineal después de la exponencial (LATE)²⁰, utilice las secuencias de cebadores enumeradas en la Tabla 2. En este caso, se utilizó una plantilla de ADN monocatenario (Plantilla NANOGP8 o Plantilla G1423C, Tabla 2) correspondiente al fragmento de 126 nt del gen. La plantilla fue sintetizada a medida por Integrated DNA Technologies, Inc.
   1. Prepare una reacción de PCR de 100 μL mezclando 10 μL de tampón de reacción Taq estándar 10x, 2 μL de mezcla dNTP de 10 mM (para tener la concentración final de 0,2 mM), 10 μL de cebador directo de 10 μM y 10 μL de cebador inverso de 1 μM (para la concentración final de 1 μM y 0,1 μM, respectivamente), 0,5 μL de 5U/μL de ADN polimerasa Taq, molde de ADN y agua libre de nucleasa. Para un control sin plantilla, agregue agua en lugar de la plantilla.
   2. Utilice las siguientes condiciones de termociclado: desnaturalización inicial a 95 °C durante 1 min; 45 ciclos de (1) desnaturalización a 95 °C durante 15 s, (2) recocido de imprimación a 60 °C durante 30 s, (3) extensión de imprimación a 68 °C durante 30 s; y extensión final a 68 °C durante 5 min.
      NOTA: Las técnicas de amplificación basadas en transcripción, como NASBA¹⁸ , se pueden utilizar en lugar de PCR o RPA, especialmente si se dispone de un molde de ARN para la amplificación. NASBA genera un amplicón de ARN monocatenario a una concentración de producto final en el rango de micromolares, que es lo suficientemente alta como para ser utilizada en el ensayo SLAS posterior sin concentración de producto.
2. Precipitar las muestras amplificadas con etanol añadiendo 0,1x volumen de acetato de sodio 3 M (pH 5,5) y 3x volumen de etanol. Incubar a -20 °C durante 1 h, centrifugar a 12.000-18.000 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
3. Lave el pellet con etanol al 70%, vuelva a centrifugar y deseche nuevamente el sobrenadante. Secar al aire el pellet y disolverlo en 10 μL de agua libre de nucleasas para utilizarlo en el ensayo SLAS.

3. Ensayo de fluorescencia mediante SLAS

1. Prepare soluciones madre de AO (0,1 mM en DMSO, 10x), SLAS-S (10 μM en agua libre de nucleasas, 10x), SLAS-U (10 μM en agua libre de nucleasas, 10x) y tampón de ensayo 4x (80 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM MgCl₂, 80 mM KCl).
   NOTA: Los iones de potasio son necesarios para estabilizar el presunto motivo G-cuádruple del aptámero, que es parte del sitio de unión del colorante. Tan solo 1 mM de KCl (a 25 mM MgCl₂) en un tampón de ensayo 1x es suficiente para garantizar un aumento de fluorescencia de ~14 veces en presencia del objetivo específico M sobre el blanco (muestra sin objetivo; Figura complementaria 2B). Los iones de magnesio estabilizan las interacciones de las hebras de ácido nucleico (entre SLAS-S, SLAS-U y el objetivo). La concentración de Mg²⁺ en el tampón de ensayo 1x debe ser de al menos 5 mM (a 20 mM de KCl; Figura complementaria 2C,D). La solución madre de AO (~1 mM) se prepara en DMSO. Las concentraciones de existencias de SLAS-S y SLAS-U son arbitrarias y pueden ajustarse si es necesario siempre que se mantengan las concentraciones finales de las hebras (véase la justificación de la selección de la concentración final de SLAS en la Discusión).
   PRECAUCIÓN: El AO es dañino si se ingiere, tóxico en contacto con la piel y se sospecha que causa cáncer. Siempre use guantes cuando trabaje con soluciones de AO. El pesaje de AO y la preparación de sus soluciones madre deben realizarse bajo la cubierta química.
2. Prepare la mezcla maestra que contenga todos los componentes del ensayo excepto el objetivo. Calcule el volumen de la mezcla maestra (_mezcla V) multiplicando el volumen de la muestra (60 μL) por el número de muestras más uno (n+1):
   
   El número de muestras n debe incluir los controles negativos y positivos necesarios.
3. Combine 0,25x V_mix μL de 4x Assay Buffer, 0,1x V_mix μL de 0,1 mM AO, 0,1x V_mix μL de 10 μM SLAS-S y 0,1x V_mix μL de 10 μM SLAS-S. Agregue agua libre de nucleasas al volumen final de tal manera que se adapte al volumen objetivo agregado en el paso 3.4. Vortex y centrifugar brevemente la mezcla maestra. Alícuota 50 μL de la mezcla maestra en n tubos de muestra.
   NOTA: El volumen de la muestra se puede ajustar en función de las características del instrumento utilizado para detectar la señal fluorescente. El volumen de la mezcla maestra que se alícuota en los tubos de muestra se puede ajustar en función del volumen objetivo añadido en el paso 3.4. El volumen de agua libre de nucleasas agregado para hacer la mezcla maestra debe ajustarse en consecuencia. Por ejemplo, si la muestra que contiene el objetivo se añade al 10% (V/V) del volumen final de la muestra, se debe añadir agua a la mezcla maestra hasta una_mezcla de 0,9x V.
4. Utilice una muestra como control sin objetivo (en blanco) y una muestra como control positivo. Añada 10 μL de la muestra que contiene el objetivo a la mezcla maestra (50 μL) para que el volumen final de la muestra sea de 60 μL y contenga un objetivo de 10-1000 nM. Para el blanco, use agua sin nucleasa (10 μL) en lugar del objetivo. Para el control positivo, utilice un oligonucleótido de ADN sintético que contenga la secuencia diana (p. ej., diana M, Tabla 1). Agregue 10 μL de control de 0,6-3 μM para hacer una concentración final de 0,1-0,5 μM.
   NOTA: La alta fluorescencia en este control positivo garantiza que el ensayo funcione como se espera, incluso si se observa una señal negativa para las muestras desconocidas analizadas.
5. Mezcle las muestras y centrifuga con una microcentrífuga. Incubar las muestras a 22 °C durante 10-60 min. La señal aumenta solo en un <15% entre 40 min y 60 min (Figura 3).
6. Mida la fluorescencia de las muestras a 540 nm tras la excitación a 475 nm utilizando un espectrofotómetro fluorescente.
   NOTA: Es posible utilizar un fluorómetro portátil que mide la fluorescencia en tubos de PCR de pared delgada. El fluorómetro debe tener filtros de excitación y emisión adecuados para detectar la fluorescencia AO. Un ejemplo de un filtro de excitación adecuado es un filtro de paso corto de 495 nm. Un ejemplo de un filtro de emisiones adecuado es 510-580 nm. Alternativamente, la señal se puede observar visualmente tras la excitación de la fluorescencia AO en la muestra con una fuente de luz UV o azul.
   PRECAUCIÓN: Si se utiliza una lámpara UV, use gafas protectoras contra los rayos UV.

Figura 3: Dependencia del tiempo de la generación de señal para SLAS-29U/30S. Una muestra que contenía AO, SLAS-29U y SLAS-30S se analizó utilizando el modo cinético de un espectrofotómetro fluorescente (excitación a 475 nm, emisión a 540 nm, rendijas de excitación/emisión de 5 nm) durante 60 min. A los 5 minutos (indicado con una flecha), se añadió el objetivo M a la muestra. Los datos se promedian a partir de dos ensayos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

El rendimiento de SLAS utilizando el núcleo DAP-10-42 como reportero de señales se demostró utilizando una sonda diseñada para interrogar un fragmento del gen NANOGP8 importante para la progresión del glioblastoma multiforme (GBM), una forma agresiva de cáncer cerebral²¹. Se informó que este fragmento contenía SNSs en la carga de ADN de exosomas derivados de células cancerosas²². Por lo tanto, el SLAS se adaptó al sitio SNS del gen. Se utilizaron dianas de ADN sint...

Discusión

En el protocolo informado, los pasos críticos incluyen (i) el diseño del SLAS; ii) temperatura del ensayo; (iii) presencia de cationes metálicos mono y divalentes (K⁺ y Mg²⁺); iv) concentraciones de hebras de SLAS.

Diseño SLAS
Al diseñar hebras SLAS, es importante tener en cuenta la estabilidad termodinámica de los complejos formados por las hebras SLAS-S y SLAS-U en ausencia de dianas, y en presencia de dianas específ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Auramina O	MP Biomedicals	195064	un tinte fluorogénico utilizado para el informe de señales
Fluorómetro Cary Eclipse	Tecnologías Agilent	G9800A	para medir la señal fluorescente de las muestras
Sulfóxido de dimetelia	MP Biomedicals	196055	disolvente para preparar soluciones madre de Auramina O
Oligonucleótidos de ADN (cebadores, hebras SLAS, plantilla sintética para PCR)	IDT	N/A	hecho a medida y desalado por el vendedor, utilizado sin más purificación
Mezcla dNTP, 10 mM	ThermoFisher Scientific	R0191	para reacción de PCR TARDÍA
Cloruro de magnesio	invitrogen	AM9530G	componente de búfer; necesario para la correcta asociación de las hebras de la sonda con el objetivo analizado
Tubos de microcentrífuga (1,5 ml)	Marca de pescador	02-681-320	de plástico para la preparación de muestras
Micropipeta (0,1-2,5 µ L)	Eppendorph	K56877G	Se utiliza para la preparación de muestras
Micropipeta (100-1000 µ L)	Eppendorph	K13160F	Se utiliza para la preparación de muestras
Micropipeta (20-200 µ L)	Eppendorph	J05253M	Se utiliza para la preparación de muestras
Micropipeta (2-20 µ L)	Eppendorph	G24675G	Se utiliza para la preparación de muestras
Mini centrífuga	Corning	6770	Se utiliza para centrifugar las muestras
Agua libre de nucleasas (no tratada con DEPC)	ThermoFisher Scientific	AM9932	Uso para muestras en ensayos de PCR y SLAS
Tubos de PCR (0,5 ml)	invitrogen	AM9932	para medir la fluorescencia con el fluorómetro Quantus
Puntas de pipeta (20-200 µ L)	VWR	76322-150	de plástico para la preparación de muestras
Puntas de pipeta (1-10 uL)	VWR	76322-528	de plástico para la preparación de muestras
Cloruro de potasio	Invitrogen	AM9640G	componente de búfer; necesario para el correcto plegado del dominio del aptámero de luz fluorescente de la sonda
Fluorómetro Quantus	Promega	E6150	Fluorómetro portátil de bajo costo que se puede utilizar para mediciones de fluorescencia
Cubeta de cuarzo	Starna	16.50F-Q-10/Z15	para ser utilizado para la medición de fluorescencia con el fluorómetro Cary Eclipse
ADN polimerasa Taq con tampón Taq estándar	Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra	M0273S	para la amplificación de un fragmento de gen que se analizará con el ensayo SLAS
Tampón Tris-HCl (pH 7,4)	Bioproductos de Boston	R-314	Componente de búfer
Lámpara UV	UVP	95-0016-14	para excitar AO para la observación de señales visuales
Mezclador de vórtice	VWR	10153-838	utilizado para mezclar las muestras