Este protocolo describe el diseño de sondas de hibridación dividida que utilizan el aptámero de luz fluorescente DAP-10-42 como reportero de señal y su aplicación para la detección y diferenciación de ácidos nucleicos entre objetivos con sustituciones de un solo nucleótido.
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Artículo de método
Sonda de hibridación dividida que utiliza un aptámero de iluminación fluorescente de ADN como reportero de señal para el análisis de ácidos nucleicos específicos de la secuencia
En este artículo
Resumen
Resumen
Los aptámeros fluorescentes luminosos (FLAP) basados en ADN son prometedores para los ensayos bioanalíticos porque proporcionan una lectura de señal fluorescente de bajo coste sin necesidad de marcar los reporteros de señales de ácido nucleico con fluoróforos y/o extintores, a diferencia de las sondas de hibridación convencionales utilizadas para la detección instantánea de ácidos nucleicos. En cambio, los FLAP se unen de forma no covalente a los ligandos de colorante, que exhiben una fluorescencia intrínsecamente baja en soluciones acuosas, pero se vuelven altamente emisores al unirse a FLAP. Este protocolo describe un algoritmo para diseñar sensores de aptámero de luz dividida (SLAS) utilizando DAP-10-42, el FLAP de ADN más eficiente reportado hasta ahora. Cuando está equipado con secuencias de ácido nucleico complementarias a un objetivo de ácido nucleico de interés, SLAS es una herramienta prometedora para el análisis de ácidos nucleicos que permite la detección específica de secuencia de objetivos de ácido nucleico con selectividad de hasta un nucleótido para permitir el análisis de sustituciones de un solo nucleótido (SNS). Los SLA ofrecen la ventaja de una lectura de señal basada en fluorescencia sin marcadores, que se puede medir con un espectrofotómetro fluorescente convencional basado en cubeta, un fluorómetro portátil u observar visualmente la excitación con una fuente de luz portátil. El enfoque SLAS es beneficioso para las aplicaciones de biodetección en el diagnóstico de enfermedades, el monitoreo ambiental y la investigación biomolecular.
Introducción
El análisis de ácidos nucleicos mediante sondas de hibridación se realiza de forma rutinaria para detectar y cuantificar secuencias específicas de ADN/ARN1. Una de las sondas de hibridación más exitosas es la sonda Molecular Beacon (MB), que es un ADN en forma de horquilla
oligonucleótido marcado con un fluoróforo y un extintor en el extremo opuesto 2,3. Detecta instantáneamente (sin necesidad de lavar el complejo sonda-objetivo por el exceso de la sonda) detecta la presencia de una secuencia de ácido nucleico complementaria al fragmento de bucle de ....
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Protocolo
1. Diseño del sensor de aptámero de luz dividida (SLAS) con DAP-10-42 como reportero de señal
- Diseñar las secuencias de dos hebras de oligonucleótidos de ADN no modificados que constituyen SLAS. Utilice un fragmento que contenga nucleótidos (nts) 4,6-39 de DAP-10-42 (Tabla 1, Figura 1A).
- Convierta la secuencia del tallo 1 (nts 1-8 y 36-42) en tallo 1' eliminando un residuo de timina abultado en la posición nt 5, acortando el tallo a 4 pb (nts 4,6-8 y 36-39) y agregando un bp C-G terminal (Figura 1A, paso 1). Además, una de las hebras de SLAS contiene nts....
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Resultados
El rendimiento de SLAS utilizando el núcleo DAP-10-42 como reportero de señales se demostró utilizando una sonda diseñada para interrogar un fragmento del gen NANOGP8 importante para la progresión del glioblastoma multiforme (GBM), una forma agresiva de cáncer cerebral21. Se informó que este fragmento contenía SNSs en la carga de ADN de exosomas derivados de células cancerosas22. Por lo tanto, el SLAS se adaptó al sitio SNS del gen. Se utilizaron dianas de ADN sint.......
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Discusión
En el protocolo informado, los pasos críticos incluyen (i) el diseño del SLAS; ii) temperatura del ensayo; (iii) presencia de cationes metálicos mono y divalentes (K+ y Mg2+); iv) concentraciones de hebras de SLAS.
Diseño SLAS
Al diseñar hebras SLAS, es importante tener en cuenta la estabilidad termodinámica de los complejos formados por las hebras SLAS-S y SLAS-U en ausencia de dianas, y en presencia de dianas específ.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Los fondos de la Oficina de Investigación de Pregrado (OUR) de la UCF para AK son muy apreciados. El trabajo en la optimización de las condiciones de LATE-PCR para el gen NANOGP8 cuenta con el apoyo del Fondo de Innovación del Cáncer de Florida (subvención MOABC).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Auramina O | MP Biomedicals | 195064 | un tinte fluorogénico utilizado para el informe de señales |
| Fluorómetro Cary Eclipse | Tecnologías Agilent | G9800A | para medir la señal fluorescente de las muestras |
| Sulfóxido de dimetelia | MP Biomedicals | 196055 | disolvente para preparar soluciones madre de Auramina O |
| Oligonucleótidos de ADN (cebadores, hebras SLAS, plantilla sintética para PCR) | IDT | N/A | hecho a medida y desalado por el vendedor, utilizado sin más purificación |
| Mezcla dNTP, 10 mM | ThermoFisher Scientific | R0191 | para reacción de PCR TARDÍA |
| Cloruro de magnesio | invitrogen | AM9530G | componente de búfer; necesario para la correcta asociación de las hebras de la sonda con el objetivo analizado |
| Tubos de microcentrífuga (1,5 ml) | Marca de pescador | 02-681-320 | de plástico para la preparación de muestras |
| Micropipeta (0,1-2,5 µ L) | Eppendorph | K56877G | Se utiliza para la preparación de muestras |
| Micropipeta (100-1000 µ L) | Eppendorph | K13160F | Se utiliza para la preparación de muestras |
| Micropipeta (20-200 µ L) | Eppendorph | J05253M | Se utiliza para la preparación de muestras |
| Micropipeta (2-20 µ L) | Eppendorph | G24675G | Se utiliza para la preparación de muestras |
| Mini centrífuga | Corning | 6770 | Se utiliza para centrifugar las muestras |
| Agua libre de nucleasas (no tratada con DEPC) | ThermoFisher Scientific | AM9932 | Uso para muestras en ensayos de PCR y SLAS |
| Tubos de PCR (0,5 ml) | invitrogen | AM9932 | para medir la fluorescencia con el fluorómetro Quantus |
| Puntas de pipeta (20-200 µ L) | VWR | 76322-150 | de plástico para la preparación de muestras |
| Puntas de pipeta (1-10 uL) | VWR | 76322-528 | de plástico para la preparación de muestras |
| Cloruro de potasio | Invitrogen | AM9640G | componente de búfer; necesario para el correcto plegado del dominio del aptámero de luz fluorescente de la sonda |
| Fluorómetro Quantus | Promega | E6150 | Fluorómetro portátil de bajo costo que se puede utilizar para mediciones de fluorescencia |
| Cubeta de cuarzo | Starna | 16.50F-Q-10/Z15 | para ser utilizado para la medición de fluorescencia con el fluorómetro Cary Eclipse |
| ADN polimerasa Taq con tampón Taq estándar | Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra | M0273S | para la amplificación de un fragmento de gen que se analizará con el ensayo SLAS |
| Tampón Tris-HCl (pH 7,4) | Bioproductos de Boston | R-314 | Componente de búfer |
| Lámpara UV | UVP | 95-0016-14 | para excitar AO para la observación de señales visuales |
| Mezclador de vórtice | VWR | 10153-838 | utilizado para mezclar las muestras |
Referencias
- Wetmur, J. G. DNA Probes: Applications of the principles of nucleic acid hybridization. Crit Rev Biochem Mol Biol. 26 (3-4), 227-259 (1991).
- Tyagi, S., Kramer, F. Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization. Nat Biotechnol. 14
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Reimpresiones y permisos
