Method Article

Un modelo de ratón para evaluar los resultados estructurales y funcionales a largo plazo después de la reversión de la obstrucción ureteral unilateral prolongada

DOI:

10.3791/68492

⸱

July 18th, 2025

 , 
1Division of Nephrology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo proporciona instrucciones detalladas para permitir a los investigadores realizar la obstrucción ureteral unilateral reversible en ratones utilizando un modelo estandarizado que permite el análisis de los resultados estructurales y funcionales a largo plazo después de la reversión de la obstrucción ureteral prolongada.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El tratamiento clínico de los pacientes con obstrucción del tracto urinario (UTO) requiere una intervención temprana para revertir la causa de la obstrucción, pero a pesar de esto, los pacientes con UTO prolongado tienen un mayor riesgo de enfermedad renal crónica (ERC) y lesión renal aguda recurrente (IRA). Sin embargo, aparte de una reversión temprana de la obstrucción y el tratamiento genérico para retrasar la progresión de la ERC, ninguna terapia ha mejorado significativamente los resultados renales a largo plazo después de la reversión de la UTO. Para hacer frente a esto, varios laboratorios han desarrollado modelos de UUO REVERSIBLE (R-UUO), pero estos son técnicamente desafiantes y no han sido ampliamente adoptados. Además, si bien los modelos de ratón de R-UUO son atractivos, ya que se pueden utilizar para aprovechar el poder de la genética del ratón para estudiar la fisiopatología de la enfermedad, estos han sido particularmente desafiantes ya que los métodos utilizados a menudo conducen a una UUO irreversible si la obstrucción dura >3 días. Además, debido a la naturaleza de estos modelos, pocos estudios han evaluado los resultados funcionales a largo plazo de revertir la obstrucción ureteral. Para abordar esto, recientemente desarrollamos un modelo de ratón de R-UUO con nefrectomía contralateral tardía que permite el análisis de los efectos a largo plazo de revertir la UTO prolongada en los resultados estructurales y funcionales renales a largo plazo. Estos estudios muestran que, a pesar de la recuperación histológica casi completa 3 meses después de la reversión, hubo una reducción permanente de la función renal y un defecto marcado y persistente en la capacidad de concentración urinaria, indicativo de un defecto en la función medular renal. El modelo requiere tres cirugías importantes de supervivencia, pero da como resultado una reducción robusta y reproducible a largo plazo de la función renal que se puede reproducir en diferentes cepas de ratón ajustando el período de obstrucción. En este artículo, proporcionamos instrucciones detalladas para realizar estas cirugías, optimizar las condiciones para su uso en diferentes cepas de ratones, evaluar los resultados funcionales renales y recolectar tejidos renales.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La obstrucción del tracto urinario (UTO) puede ser unilateral, que a menudo es asintomática, presentándose tardíamente con uropatía obstructiva crónica1, o puede presentarse agudamente con cólico renal y/o hematuria; pielonefritis aguda o lesión renal aguda (IRA) postrrenal2. La clave para el tratamiento de la UTO es la reversión temprana de la obstrucción2. Sin embargo, a pesar de la reversión efectiva y el uso de terapias genéricas para retrasar la progresión de la enfermedad renal crónica (ERC), los pacientes afectados siguen teniendo un mayor riesgo de ERC progresiva e hipertensiónarterial 3,4. Además, la capacidad de concentración urinaria (UCC) a largo plazo suele estar alterada5, lo que puede predisponer a los pacientes susceptibles a la deshidratación y a la LRA recurrente, acelerando el deterioro progresivo de la función renal tras la ITU.

En parte, este fracaso en la identificación de enfoques terapéuticos para mejorar los resultados a largo plazo en pacientes con UTO ha sido el resultado de nuestra dependencia en el uso de modelos de obstrucción ureteral unilateral irreversible (UUO) para explorar la patobiología de la UTO. Sin embargo, estos modelos no replican la situación clínica en la que los pacientes experimentan una reversión poco después del diagnóstico y no se pueden utilizar para explorar los mecanismos y enfoques terapéuticos que podrían usarse para mejorar la reparación a largo plazo después de revertir la obstrucción. Se han desarrollado modelos UUO REVERSIBLES (R-UUO) para abordar esto, pero estos son técnicamente más desafiantes que los modelos UUO irreversibles, más difíciles de reproducir por diferentes laboratorios y, como resultado, no han sido tan ampliamente adoptados por la comunidad científica. Los modelos de ratón son atractivos, ya que pueden utilizarse para aprovechar el poder de la genética del ratón para estudiar la fisiopatología de la enfermedad, pero han sido especialmente difíciles de optimizar, ya que los métodos suelen conducir a una UUO irreversible si la obstrucción dura más de3 días. Se han implementado una variedad de enfoques para abordar esto, incluida la cirugía múltiple, la colocación secuencial de pinzas a lo largo del uréter cada 2 días 6,7; UUO seguido de reimplante vesical 8,9,10,11; y use abrazaderas y tubos no dañinos para obstruir el uréter 12,13,14. Los estudios de resultados a largo plazo en ratas y ratones han mostrado una mejora de la función renal, una reducción de la fibrosis y/o la lesión glomerular después de la reversión de la obstrucción, pero solo una recuperación parcial si la UUO dura más de 2 días 6,7,8,9,12,14,15,16,17,18,19 . Además, mientras que la médula renal (RM) es particularmente susceptible al daño causado por UTO 20,21 hasta hace poco, no ha habido estudios a largo plazo en roedores en los que se hayan estudiado los efectos de la R-UUO prolongada sobre la estructura y función de la RM. Esto es significativo ya que el UCC y la capacidad de excretar cargas de sal sin aumentar la presión arterial (la llamada respuesta de natriuresis de la presión) dependen del mantenimiento de la integridad anatómica del RM 22,23,24, por lo que la reparación incompleta del RM después de la reversión de la UTO puede explicar por qué los pacientes tienen una mayor susceptibilidad a la LRA recurrente y a la hipertensión después de la reversión de la UTO. Sin embargo, muchas de las técnicas requeridas para evaluar esto requieren múltiples rondas de cirugía (cinco cirugías mayores para 6 días de obstrucción 6,7), requieren experiencia quirúrgica que es difícil de enseñar (p. ej., reimplante quirúrgico del uréter en la vejiga 8,9,10,11), y debido a que la obstrucción es unilateral, dificulta que los investigadores evalúen los cambios en la función renal después de la reversión de la obstrucción.

Para abordar esto, hemos desarrollado un modelo murino de R-UUO que es relativamente sencillo de realizar y enseñar, requiere un número más limitado de cirugías que otras técnicas (dos cirugías para 5 a 7 días de obstrucción) y permite analizar la recuperación funcional renal sin necesidad de estudios invasivos y/o costosos de función renal dividida25. Para ello, los ratones se someten a tres cirugías principales: 1) colocación de una pinza vascular no traumática en el uréter izquierdo proximal; 2) retirada de la pinza vascular de 5 a 7 días después, dependiendo de la cepa del ratón; y 3) extirpación del riñón contralateral 10 días después para evaluar la función renal. Aproximadamente del 20 al 40% de los ratones mueren dentro de los 2-3 días posteriores a la nefrectomía, lo que indica que la UUO no se revierte en todos los ratones. El seguimiento a largo plazo de los ratones supervivientes muestra que, a pesar de la recuperación histológica casi completa de la médula renal (RM) 3 meses después de la R-UUO. Hay una disminución de la función renal, medida por la tasa de filtración glomerular transdérmica (TFGt)26. Además, hay una marcada reducción en el UCC, determinada mediante la medición de la osmolalidad urinaria después de la restricción de agua, lo que sugiere que hay un defecto permanente en la función de RM. Los estudios de curso del tiempo muestran que, si bien hay una mejora en la TFGt entre los días 28 y 56 después de la RUUO, esto se estabiliza entre los días 56 y 84. Por el contrario, no hay mejoría en el UCC entre los días 28 y 84 después del R-UUO25. Utilizando scRNA-Seq de RMs aisladas, validadas por linaje celular y estudios de inmunohistoquímica, identificamos fuertes respuestas regenerativas que restauraron las dimensiones de RM después de R-UUO, pero que todos los compartimentos celulares principales en el RM mostraron cambios permanentes en el número de células y firmas genéticas que probablemente afecten la recuperación funcional después de R-UUO. Esto incluyó respuestas proinflamatorias persistentes en el conducto colector de RM y el asa de las poblaciones de células de Henle 84 días después de R-UUO, similares a las firmas inflamatorias y de senescencia de las células epiteliales tubulares proximales de reparación fallida después de LRA y UUO 27,28,29,30. También se observaron cambios similares en los conductos colectores de RM de pacientes con litiasis renal recurrente31, lo que sugiere que existe una respuesta de lesión común al daño de RM tanto en humanos como en ratones. En este artículo, proporcionamos instrucciones detalladas sobre cómo realizamos estas cirugías, cómo optimizamos las condiciones para su uso en diferentes cepas de ratones, cómo determinamos si el uréter todavía está obstruido después de la reversión, cómo evaluamos los resultados funcionales clave y cómo recolectamos tejidos renales para evaluar las estructuras medulares renales.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se describe el protocolo de cuatro pasos utilizado para los estudios a largo plazo (Figura 1). Como se discutió al final de este manuscrito, los investigadores pueden optar por realizar solo tres de estos (secciones 1, 2 y 4) o los cuatro si están interesados en estudiar los resultados a largo plazo. Todos los experimentos con ratones en este manuscrito han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Vanderbilt y se adhieren a las pautas de uso de animales.

1. Colocación de la pinza ureteral (10 - 15 min/ratón)

NOTA: Confíe en el conocimiento de la anatomía del riñón de ratón para localizar el uréter, ya que no es posible verlo directamente sin el tejido conectivo circundante. El uréter corre a lo largo de la cara posterior inferior del tejido hiliar a medida que el riñón queda expuesto (Figura 2). La elección de la pinza vascular es importante. Estos pueden ser costosos, pero se pueden limpiar, esterilizar en autoclave y reutilizar varias veces. Estas abrazaderas se pueden reutilizar al menos 100 veces sin problemas.

  1. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía a 121 °C durante 30 min. Si realiza cirugías en varios ratones, elimine la sangre y los desechos de los instrumentos entre uso y esterilice durante 10 a 15 segundos con el esterilizador de perlas calientes. Deje que los instrumentos se enfríen antes de volver a usarlos.
  2. Pesa el ratón.
  3. Anestesiar al ratón con 5-10 mg/kg de xilacina con 90-120 mg/kg de ketamina por inyección intraperitoneal (ver Tabla de Materiales). Esto suele tardar entre 3 y 5 minutos en hacer efecto.
  4. Administrar analgesia preoperatoria si se utiliza un agente anestésico diferente, como el isoflurano, ya que, a diferencia de la xilacina, este no tiene efectos analgésicos.
  5. Afeita el sitio quirúrgico desde las caderas hasta la caja torácica y alrededor del costado, con suficiente borde para evitar que el cabello contamine el sitio de la incisión. Se realiza en un área preparatoria, no donde se realiza la cirugía.
  6. Cubra el campo quirúrgico calentado con un paño quirúrgico estéril. Ayudará a evitar que los pelos sueltos ingresen al campo quirúrgico y proporcionará un área para colocar instrumentos estériles.
  7. Aplique ungüento lubricante oftálmico en los ojos.
  8. Aplique la preparación aséptica con una gasa empapada en betadine: frote desde el centro del sitio hacia la periferia de 3 a 4 veces, cada vez seguido de una limpieza una vez con un hisopo con alcohol. Retire todo el betadine del campo quirúrgico antes de la incisión.
  9. Realizar una incisión dorsal longitudinal de 1,5 cm en la línea media a través de la piel y las capas subcutáneas con tijeras y pinzas.
  10. Haga una pequeña incisión a través del músculo del flanco izquierdo y la fascia por encima del riñón y exteriorice el riñón izquierdo.
  11. Diseccione cuidadosamente la grasa del polo inferior y parte del tejido conectivo alrededor de donde debería estar el uréter. No es posible ver el uréter directamente sin el tejido conectivo circundante. A continuación, se separa el uréter con el tejido conectivo circundante del pedículo renal, que contiene la vena y la arteria renal, por lo que el pedículo renal no se incluye con la pinza ureteral (Figura 2).
  12. Utilice los aplicadores de pinza para abrirlo y colocarlo en el uréter directamente debajo de la pelvis. Utilice las marcas de la pinza vascular para asegurarse de que se colocan con la misma presión sobre el uréter para cada ratón (Figura 3). No lo aplique, luego retire la pinza para volver a colocarla, ya que esto puede dañar el uréter.
  13. Una vez que se haya colocado la pinza, empuje suavemente el riñón con la pinza hacia el espacio retroperitoneal utilizando un hisopo de algodón estéril empapado en solución salina.
  14. Cierre la capa muscular con una sutura reabsorbible.
  15. Cierre la capa de piel con clips de piel.
  16. Administrar Buprenorfina 3,25 mg/kg de analgesia, como se describe en la sección de fármacos, y administrar 0,5 mL de solución salina normal estéril por vía subcutánea para hidratar a los ratones.
  17. Deje al ratón en el campo quirúrgico de la almohadilla dura calentada o transfiéralo a su jaula doméstica con una almohadilla isotérmica calentada debajo de la mitad de la jaula hasta que el ratón se despierte.
  18. Regresa el ratón a la habitación de los animales.
  19. Vigile de cerca al ratón y administre dosis adicionales de buprenorfina para el dolor o el malestar durante 48 a 72 h. Los signos clínicos de dolor y angustia que indican que los ratones necesitan analgesia adicional incluyen depresión u otros cambios de comportamiento, apariencia anormal o posturas como piloerección, postura encorvada, falta de aseo y alimentación, o inmovilidad.

2. Retirada de la pinza ureteral (10 - 15 min/ratón)

  1. Siga los pasos 1.1-1.10 del procedimiento de colocación de la pinza utilizando las incisiones originales en la piel y los músculos para comenzar la extracción de la pinza. Retire las pinzas para heridas antes de limpiar el área quirúrgica. Por lo general, no es necesario volver a afeitarse, ya que el vello no ha vuelto a crecer.
  2. Debido a las adherencias tisulares desarrolladas, use fórceps para ubicar cuidadosamente la pinza en el espacio retroperitoneal sin exteriorizar primero el riñón. Use los aplicadores de pinza para abrir suavemente la pinza mientras usa las pinzas para tirar del tejido hacia abajo desde alrededor de la cabeza de la pinza para quitar la pinza.
  3. Ahora, exteriorizar el riñón para que se pueda visualizar la pelvis renal para determinar la obstrucción. La pelvis renal debe estar hinchada, lo que indica hidronefrosis.
  4. Una vez que se inspecciona el riñón, empuje suavemente el riñón hacia el espacio retroperitoneal con un hisopo de algodón estéril empapado en solución salina.
  5. Siga los pasos 1.13-1.18, como se describe anteriormente.

3. Nefrectomía contralateral (10 - 15 min/ratón)

  1. Afeita el área si hay crecimiento de vello.
  2. Utilice una mezcla de isoflurano/aire al 1-5% para la anestesia para permitir una recuperación más fácil debido a los eventos anestésicos previos. Retire las pinzas para heridas antes de limpiar el área quirúrgica.
  3. Administrar analgesia con buprenorfina antes de la operación (ver Tabla de materiales).
  4. Siga los pasos del procedimiento 1.1-1.9 utilizando la incisión cutánea original para comenzar.
  5. Hacer una pequeña incisión a través del músculo del flanco derecho y la fascia por encima del riñón y exteriorizar el riñón derecho.
  6. Sostenga el riñón suavemente con pinzas lisas y curvas y diseccione cuidadosamente los polos superior e inferior del riñón para liberarlos del tejido circundante.
    NOTA: El tejido que rodea el polo superior contiene la glándula suprarrenal, que transporta su propio suministro de sangre, que puede extraerse del riñón, pero obviamente no debe extraerse del ratón (véase la figura 2).
  7. Después de liberar el riñón del tejido circundante, ate la sutura de seda 4-0 completamente alrededor de los vasos renales y el uréter con un nudo quirúrgico doble. Si se deja durante ~30 s, el riñón se oscurece. Sostenga el riñón con pinzas lisas y curvas, y extraiga el riñón cortando distalmente hasta el nudo con tijeras curvas.
  8. Empuje suavemente el pedículo renal restante hacia el espacio retroperitoneal con un hisopo de algodón estéril empapado en solución salina.
  9. Siga los pasos 1.13-1.18, como se describe anteriormente.

4. Recolección de tejidos

  1. Anestesiar con una mezcla de isoflurano/aire al 5% para lograr un plano estable de anestesia quirúrgica antes del procedimiento terminal.
  2. Abrir la cavidad abdominal para exponer el riñón izquierdo
  3. Inspeccione el riñón para ver cualquier hinchazón de la pelvis renal (ver paso 2.3).
  4. Si parece que la pelvis renal todavía está inflamada, inserte una aguja de mariposa de calibre pequeño conectada a una jeringa que contenga 0,5 mL de una dilución de 1 en 5000 de azul de metileno en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Si el uréter es permeable, la solución azul será visible a medida que viaja desde la pelvis renal hasta la vejiga. De lo contrario, la pelvis renal se hinchará con una solución azul y no aparecerá en la vejiga.
  5. Para la perfusión fijar los riñones, abrir la cavidad torácica y exponer el corazón.
    1. Mientras el corazón sigue latiendo, inserte una aguja de mariposa de 23-25 g en el ventrículo izquierdo, inicie una infusión de solución salina normal y corte la aurícula o ventrículo derecho para reemplazar el volumen de sangre con solución salina.
    2. Después de aproximadamente un minuto, asegúrese de que los riñones estén blancos. Continúe la infusión de solución salina durante un minuto más o cámbiela por una infusión de solución de formalina al 10% durante otros 1-2 minutos para fijar los tejidos.
    3. En este punto, el ratón estará muerto; Cosecha los tejidos. Si los tejidos se recolectan para estudios de ARN o proteínas, no los fije por perfusión.
  6. Una vez extraídos los riñones del animal (tanto si han sido fijados por perfusión como si no), se utilizan una cuchilla de afeitar para cortar hasta tres cortes sagitales de 2-3 mm de grosor a través del centro del riñón (Figura 4). Esto proporciona secciones representativas que incluyen la médula renal y la corteza y proporciona suficiente tejido para ensayos de histología, proteínas o ARN.
  7. A continuación, fije/congele las muestras de acuerdo con los requisitos del estudio.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para estudios a largo plazo, generalmente evaluamos la función renal midiendo secuencialmente el nitrógeno ureico en sangre (BUN) y las tasas de filtración glomerular transdérmica (tGFR) en ratones conscientes (consulte un artículo publicado anteriormente que describe esto26), además de medir la capacidad de concentración urinaria (UCC) mediante la evaluación de la osmolaridad urinaria de muestras de orina puntuales recolectadas después de 18 h de privación de agua. Si bien siempre realizamos estu...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En comparación con algunos de los enfoques que se han utilizado para estudiar la reversión de la UUO prolongada en ratones6,7,8,9,10,11,12,13,14, el protocolo descrito aquí es relativament...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK, por sus siglas en inglés) bajo los números de premio RO1DK128823 y UC2DK126122.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,9% de cloruro de sodioFarmacia VUMCmúltiple
Sutura reabsorbible Vicryl 6-0Med Vet International- ETHICONJ492G
Hisopos con alcoholHisopos de alcohol isopropílico de la marca BDBD 326895
Solución BetadineSuministro farmacéutico Hanna Co., Inc67618015017
Pinzas de aplicación de pinzas: S & T CAF-4Herramientas de ciencia fina00071-14
Almohadilla isotérmica DeltaphaseBraintree CientíficoDPIP
Recortadora eléctricaOstermúltiple
Guantes quirúrgicos texturizados de látex ENCOREAnsell5785003
Ethiqa XR Buprofenor (CIII) VI 1,3 mg/mlVeterinaria Patterson- Ethiqa86084010030
EZ Clip 9 mmBraintree CientíficoEZC-CSo 7 mm
Aplicador EZ Clip 9 mm Braintree CientíficoEZC-APLo 7 mm
EZ Clip removedor 9 mm Braintree CientíficoEZC-RMVo 7 mm
Esponjas de gasa 2 &agudas; 2Fisher Scientific22-362178
Punta dentada curvada o angulada GraefeHerramientas de ciencia fina11049-10
Punta dentada recta GraefeHerramientas de ciencia fina11050-10
Almohadilla dura calentada 15 &aguda; 24Braintree CientíficoHHP 2
Conectores de bomba de almohadilla dura calefactadaBraintree CientíficoConector HHP Gaymar
Esterilizador de perlas calientesHerramientas de ciencia fina18000-45
Jeringa de insulina 0,5 ml 29 gExel Internacional26028
IsofluranoPatterson Veterinaria- Pivetal78949580
Ketamina 100 mg/mlFarmacia VUMC
Sutura no absorbible Silk 4-0Med Vet International- ETHICON683G
Portaagujas Olsen Hegar: con cortador de suturasHerramientas de ciencia fina12002-12
Optixcare Lubricante para Ojos 20 gMédico veterinario internacionalPHOPTIXCARE
Tijeras-Blunt Lexer-BabyHerramientas de ciencia fina14078-10
Tijeras-Afiladas curvasHerramientas de ciencia fina14005-12
Aplicadores estériles con punta de algodónPuritano25806 2WC
Esponjas de gasa estériles 4 &agudas; 4Fisher Scientific22-415-469
Paño quirúrgico desechable estéril 18 &agudo; 26Médico veterinario internacional20001
Bolsa para instrumentos de esterilización 5 &aguda; 10Fisher Scientific01-812-54
Bomba de enfriamiento de calefacción T / bombaBraintree CientíficoTP-700
Pinzas Taylor curvadas, lisasHerramientas de ciencia fina11017-17
Pinza vascular: S & T Prensa de 5 a 15 gHerramientas de ciencia fina00396-01
Xilacina 100 mg/mlVeterinaria Patterson- CronosCR04305

References

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