Artículo de método

Un marco de imágenes multimodal para avanzar en el fenotipado de células vivas de cáncer de mama sin etiquetas

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DOI:

10.3791/68498

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22 de agosto de 2025

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1Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Laser Biomedical Research Center, G. R. Harrison Spectroscopy Laboratory, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Politecnico di Milano, 4Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT and Harvard, 5Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 6Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta un enfoque multimodal que combina la espectroscopia Raman y la microscopía de fase tomográfica para el fenotipado no invasivo y sin etiquetas de células vivas de cáncer de mama humano. Incluye una línea de análisis fácil de usar y sin sesgos humanos para un análisis morfoquímico rápido y cuantitativo, que proporciona información molecular y estructural detallada con aplicaciones en la investigación del cáncer y la biología celular.

Resumen

Presentamos la microespectroscopía Raman confocal multimodal (RS) y la microscopía de fase tomográfica (TPM) para el fenotipado morfoquímico rápido de células de cáncer de mama humano (MDA-MB-231). Aprovechando la naturaleza no perturbativa de estas técnicas avanzadas de microscopía, capturamos datos morfomoleculares detallados de células vivas y libres de etiquetas en su entorno fisiológico nativo. Se desarrollaron canales de procesamiento de datos sin sesgos humanos para analizar imágenes Raman hiperespectrales (que abarcan modos Raman de 600 cm-1 a 1800 cm-1, que caracterizan de manera única una amplia gama de enlaces moleculares y estructuras subcelulares), así como datos morfológicos de tomografías de índice de refracción tridimensionales (que proporcionan mediciones de volumen celular, área de superficie, huella y esfericidad a resolución nanométrica, junto con la masa seca y la densidad). Al desglosar sistemáticamente los ricos detalles unicelulares que brindan RS y TPM, demostramos, de manera cuantitativa, la ventaja de un método de microscopía multimodal de este tipo para fenotipar células tumorales de cáncer de mama. Nuestras herramientas también brindan más información sobre la información subcelular sin el uso de etiquetas. Finalmente, estudiamos y discutimos cualquier información única o correlacionada que presenten los conjuntos de datos derivados de RS y TPM. Creemos que nuestras herramientas y canales de análisis de datos cuantitativos pueden revolucionar las tareas de fenotipado en la investigación biomédica cuando se necesita un método rápido y no perturbativo en células vivas en cultivo, con el potencial de una futura traducción en aplicaciones clínicas y de diagnóstico.

Introducción

La caracterización celular y el fenotipado son aspectos fundamentales de la investigación biomédica1. Ser capaz de caracterizar las células tanto a nivel morfológico como molecular es primordial para comprender la función, diferenciación y patología celular 1,2,3. Es particularmente interesante en el campo de la oncología, donde es necesario un perfil celular preciso para el diagnóstico tumoral, la determinación del estadio de la enfermedad y, en última instancia, la identificación de objetivos terapéuticos2. Los métodos tradicionales de caracterización celular no pueden proporcionar dinámica temporal y generalmente se basan en técnicas invasivas, como la tinción o el etiquetado, que pueden interferir con el estado nativo de las células e introducir posibles sesgos dentro de los datos4. Por lo tanto, las estrategias no invasivas para proporcionar un fenotipado preciso y completo de las células vivas, en su estado nativo e imperturbable, son cada vez más demandadas.

En este contexto, los métodos de imágenes multimodales sin etiquetas han revolucionado la investigación en biología celular al combinar modalidades complementarias para capturar información morfológica y molecular 2,5. Estos enfoques permiten la caracterización integrada y no invasiva de las células que las técnicas tradicionales individuales no siempre pueden proporcionar 2,5,6. Por ejemplo, aunque las técnicas de microscopía como la microscopía de fluorescencia se han utilizado ampliamente en imágenes celulares morfológicas y funcionales, poseen limitaciones inherentes. Los métodos de fluorescencia a menudo sufren de fotoblanqueo, fototoxicidad y bajas cantidades de moléculas dirigidas, lo que restringe el potencial analítico4. Además, estos enfoques a menudo requieren el uso de etiquetas o colorantes exógenos, que pueden alterar el estado de la célula nativa o dar lugar a artefactos7.

Las plataformas de imágenes multimodales, que combinan las fortalezas de múltiples modalidades de imágenes, superan estas limitaciones al permitir la adquisición de diferentes tipos de datos de células vivas sin necesidad de etiquetado. La integración de la espectroscopía Raman (RS) con otras modalidades de imagen como la microscopía de contraste de fase o la microscopía de fase tomográfica (TPM) ha sido una estrategia prometedora para superar las limitaciones de las técnicas individuales. De hecho, las imágenes multimodales proporcionan una comprensión más profunda de los fenotipos celulares, especialmente en condiciones biológicas complejas y patologías como el cáncer, donde las propiedades moleculares y estructurales son cruciales para una caracterización precisa 2,5.

El RS sin etiquetas es adecuado para la obtención de imágenes químicas de células8. Al detectar los modos vibracionales moleculares, RS proporciona huellas bioquímicas que pueden revelar información detallada sobre la composición molecular de las células 9,10,11. Los espectros Raman adquiridos a partir de muestras biológicas contienen información sobre una variedad de biomoléculas como lípidos, proteínas, ácidos nucleicos y metabolitos, que desempeñan un papel esencial en la comprensión de la naturaleza molecular de las células 9,12. Una de las principales fortalezas de RS es que no es invasivo, lo que permite la caracterización de células vivas en su estado natural sin alterar su condición fisiológica.

A pesar de sus muchas ventajas, RS también presenta algunas limitaciones. De hecho, aunque RS proporciona información molecular detallada, no permite información cuantitativa sobre la morfología o estructura de las células2. Aquí es donde las técnicas de imagen complementarias como TPM juegan un papel crucial.

TPM es una forma de imagen de fase cuantitativa (QPI)13,14 y permite la visualización de información cuantitativa de alta resolución y sin etiquetas sobre la morfología celular15,16. TPM se diferencia de las técnicas de microscopía tradicionales en que no requiere agentes de contraste; en cambio, opera midiendo los cambios de fase resultantes de variaciones en el índice de refracción (RI) de la muestra17. Los cambios de fase proporcionan información sobre las propiedades estructurales de la célula, incluido su volumen, área de superficie, forma y estructura interna 2,18. TPM puede lograr una alta resolución espacial, a nivel nanométrico y, por lo tanto, es una técnica ideal para registrar detalles morfológicos de alta resolución de células vivas. Además, la capacidad de reconstruir tomogramas RI 3D permite visualizar estructuras subcelulares en su entorno vivo18, proporcionando información más precisa en comparación con las proyecciones 2D. Sin embargo, una de las principales limitaciones de TPM es su falta de especificidad química, ya que proporciona principalmente información sobre la morfología y la distribución de fases de la célula, sin poder diferenciar entre distintos componentes químicos o identificar características bioquímicas.

La combinación de RS y TPM en una técnica multimodal proporciona ventajas en el fenotipado celular. Mientras que RS permite una rica información molecular, TPM agrega un aspecto estructural, lo que permite analizar la morfología celular con considerable detalle. Recientemente, la combinación de RS con TPM se ha demostrado con éxito en varios estudios centrados en la investigación del cáncer 2,19,20. Por ejemplo, trabajos anteriores han informado que el registro conjunto de la espectroscopia Raman con datos de microscopía de fase holográfica puede proporcionar información molecular y morfológica complementaria, lo que permite distinguir entre diferentes tipos de células y etapas de desarrollo tumoral. Estas investigaciones han puesto de manifiesto el poder de las imágenes multimodales para mejorar la precisión del fenotipado celular, particularmente en el contexto del cáncer, donde las características moleculares y estructurales de las células están estrechamente relacionadas con su malignidad y comportamiento 2,20.

A pesar de los recientes avances en imágenes multimodales, aún quedan desafíos por abordar, particularmente en el procesamiento y análisis de datos21. Las grandes cantidades de datos que producen las técnicas de imágenes multimodales pueden ser engorrosas de analizar, y se deben emplear procedimientos sencillos para extraer información significativa. Para contrarrestar este desafío, se deben establecer canalizaciones de procesamiento de datos fáciles de usar para manejar la complejidad de los datos y minimizar el sesgo humano en el análisis. Dichos canales son fundamentales para el logro de la precisión y la reproducibilidad de los resultados y la posible traducción de estos enfoques en aplicaciones clínicas y de diagnóstico.

El objetivo del presente trabajo es ilustrar el potencial de fusionar RS con TPM para el fenotipado sin etiquetas, de alta velocidad y no perturbativo de células cancerosas individuales vivas. Al fusionar estos dos enfoques de imágenes sólidos, proporcionamos una caracterización completa y cuantitativa de las propiedades moleculares y morfológicas de las células de cáncer de mama humano (MDA-MB-231). El trabajo también enfatiza la importancia de establecer canalizaciones de procesamiento de datos libres de sesgos humanos para garantizar que la información extraída de los conjuntos de datos multimodales sea correcta y confiable. Aquí, buscamos establecer una plataforma sólida para el fenotipado de células cancerosas que pueda generalizarse a otros tipos de células. La versatilidad y sensibilidad de este enfoque lo convierten en un candidato potencial para una amplia gama de aplicaciones biomédicas, desde estudios fundamentales de biología celular hasta diagnósticos.

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Protocolo

1. Preparación de la muestra

  1. Siembre las células MDA-MB-231 en placas de Petri de cuarzo.
    1. Coloque las células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 en placas de Petri con fondo de vidrio de cuarzo de 3,5 cm.
    2. Incubar las células a 37 °C en un ambiente con 5% deCO2 hasta que estén completamente adheridas a la superficie (al menos 12 h después de la siembra).
  2. Lave las celdas y prepárelas para la medición.
    1. Retire el medio de cultivo de las células una vez que se hayan adherido a la placa de Petri.
    2. Lave las células suavemente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el medio residual.
    3. Agregue medio de cultivo celular fresco y mantenga las células cubiertas con el medio durante todo el procedimiento de medición para garantizar su viabilidad.
      NOTA: Como medio de cultivo, este estudio empleó DMEM/F-12 sin rojo de fenol suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 5% y penicilina (100 UI/ml)-estreptomicina (100 μg/ml).

2. Sistema de microscopio Raman de alto rendimiento

NOTA: Los detalles técnicos del microscopio Raman de fabricación casera empleado para el trabajo actual sobre imágenes de células vivas de células MDA-MB-231 se describieron previamente22. Brevemente, el sistema de microscopio Raman de alto rendimiento hecho a medida utilizado cuenta con un láser Ti-Sapphire de 785 nm bombeado por un láser de 532 nm (Figura 1A). El láser de excitación Raman de 785 nm se acopla a un cuerpo de microscopio de fluorescencia IX83 invertido, con excitación dirigida a la muestra a través de un objetivo de inmersión en agua UPLSAPO60× de 1,2 NA utilizando un espejo dicroico de 749 nm. Un polarizador ajusta la potencia promedio del láser en el puerto posterior del microscopio. Las imágenes de campo claro se habilitan acoplando la luz blanca de manera similar. El sistema cambia entre los modos Raman y de campo claro cambiando automáticamente los filtros dicroicos. El sistema combina el escaneo basado en espejos galvo y el escaneo de etapas para obtener imágenes de alto rendimiento. Un script personalizado de MATLAB interactúa con el software de control de microscopios de código abierto, una placa de adquisición de datos (DAQ) y sistemas de detección de señales para automatizar el proceso de adquisición de datos. La luz Raman retrodispersada es recogida por el mismo objetivo, mientras que la luz visible es filtrada por un espejo dicroico de 785 nm y dirigida a un espectrógrafo NIR y un detector de dispositivo de carga acoplada (CCD). Esta configuración permite la obtención de imágenes multidimensionales, capturando señales de campo claro, fluorescencia y Raman en varias posiciones y pilas en z 2,22.

  1. Procedimiento de imágenes Raman
    1. Preparación de la muestra y conservación de las condiciones fisiológicas
      1. Instale la muestra en la incubadora en el escenario para mantener las condiciones fisiológicas. Asegúrese de que la incubadora esté configurada a 37 °C, con regulación de retroalimentación en tiempo real para el control de la temperatura.
      2. Mantenga los niveles de humedad dentro de la cámara al >95% utilizando la unidad de baño periférica interna llena de agua destilada. Configure el controlador de gas CO2 para mezclar 5% de CO2 con 95% de aire y suministrarlo a la cámara de la incubadora.
    2. Gestión automatizada de la inmersión en agua
      1. Encienda el alimentador de inmersión en agua automatizado de fabricación casera para proporcionar agua a la lente del objetivo a un caudal de 2 μl/min utilizando bombas de jeringa y agujas de jeringa pegadas a la punta del objetivo.
      2. Verifique regularmente los niveles de agua para evitar la evaporación y garantizar condiciones de imagen consistentes durante las mediciones.
    3. Adquisición de datos de espectroscopia Raman
      1. Encienda el láser de la bomba y ajuste su potencia para alcanzar una potencia láser en el plano de muestra de 75 mW.
      2. Abra el software de control de microscopio de código abierto Micro-manager. En los ajustes de configuración, seleccione BF y haga clic en En vivo en el lado izquierdo de la ventana del software para visualizar la imagen de campo claro. Seleccione la celda única deseada de la que se adquirirá el espectro Raman. A continuación, haga clic en Detener para finalizar la visualización de campo claro.
      3. Establezca la coordenada Z del plano de imagen Raman maximizando los recuentos de señales en la cámara CCD.
      4. Para hacerlo, abra el software de control de la cámara CCD (LightField); en la configuración del experimento, establezca el tiempo de exposición en 1,5 s. A continuación, haga clic en Ejecutar en la barra de herramientas Experimento y active el rayo láser.
      5. Luego, ajuste la posición Z para maximizar los recuentos de señales en la región de huellas dactilares de 600 cm-1 a 1800 cm-1 para optimizar la visualización de los picos Raman asociados con firmas biológicas. Luego apague el láser y haga clic en Detener en la barra de experimentos del software de la cámara CCD y salga del software.
        NOTA: Se observó que los recuentos maximizados de señales Raman en la cámara CCD estaban en correspondencia con la posición a lo largo del eje Z que coincidía con +8 μm con respecto al plano de imagen que no mostraba ningún rastro de picos Raman relacionados con la célula, debido a un punto focal que caía bastante dentro del cuarzo. Este valor puede variar según el tipo y el estado de la celda.
    4. Inicie el proceso de adquisición de datos utilizando el script de MATLAB, que manejará automáticamente los canales Raman en mediciones multidimensionales y guardará los datos Raman hiperespectrales.
    5. Establezca el campo de visión en 50 × 50 μm2, 40 × 40 píxeles, con cada área de píxel correspondiente a 1,25 × 1,25 μm2. Establezca el tiempo de exposición para cada espectro Raman igual a 1,5 s.
      NOTA: Realice la calibración del número de onda con regularidad utilizando muestras de acetamidofenol para anotar picos Raman conocidos. Calibrar el eje de desplazamiento Raman a través de la interpolación cuadrática.
      PRECAUCIÓN: Manipule los láseres con cuidado. Utilice siempre gafas protectoras adecuadas para la longitud de onda del láser durante la configuración y el funcionamiento.

3. Análisis de datos RS

  1. Posprocesamiento de mapas hiperespectrales Raman a través de la herramienta web RamApp (https://ramapp.io/):
    1. Inicie sesión en la herramienta basada en la web.
    2. Importe los datos hiperespectrales. En la pestaña Mis análisis , haga clic en Nuevo y cargue el archivo .mat, que contiene la variable de datos espaciales y espectrales y la variable del eje x (es decir, los valores de desplazamiento Raman).
    3. Para truncar el espectro a las regiones especificadas en el desplazamiento Raman, en el menú desplegable Recortar y rotar , haga clic en Recorte espectral y defina el borde inferior y el borde superior de la región de desplazamiento Raman iguales a 600 cm-1 y 1800 cm-1, respectivamente.
      NOTA: Al realizar este truncamiento del espectro, se excluye del análisis el pico amplio y de alta amplitud relacionado con el material de cuarzo de la placa de Petri.
    4. Para corregir los espectros Raman de los rayos cósmicos, dentro de las opciones de eliminación de ruido, haga clic en Despike, seleccione Z-score como método y establezca el umbral igual a 8.
      NOTA: La función de preprocesamiento de Despike ayuda a abordar el problema de los píxeles que contienen picos en su señal, que resultan de los rayos cósmicos.
    5. Marque la opción Usar la primera diferencia para encontrar valores atípicos utilizando la primera diferencia discreta de intensidades a lo largo del espectro y marque la opción Corregir picos. El espectro de cada píxel defectuoso será reemplazado por el espectro mediano de sus píxeles vecinos.
    6. Haga clic en Ejecutar para corregir los picos.
    7. Para eliminar el ruido de los mapas correspondientes a cada número de onda, dentro de las opciones de eliminación de ruido , haga clic en Suavizar mapa, seleccione Filtro mediano y establezca el tamaño del lado del cuadrado que se considera al aplicar el filtro en cada píxel del mapa igual a 3 píxeles. A continuación, haga clic en Ejecutar.
    8. Para aplicar un filtro para suavizar el espectro de cada píxel, haga clic en Suavizar espectro dentro de las selecciones de eliminación de ruido . Seleccione el filtro Savitzky-Golay como Método y establezca la longitud de la ventana de filtro igual a 7 y el orden polinómico del filtro igual a 2. A continuación, haga clic en Ejecutar.
      NOTA: Un filtro Savitzky-Golay requiere especificar la longitud de la ventana del filtro (un entero impar positivo) y el orden del polinomio.
    9. Para eliminar la señal de fondo promedio del primer plano, abra el panel Eliminación óptica de sustrato y haga clic en Identificar sustrato. Establezca k-medias como un método y el número de clústeres sea igual a 2.
      NOTA: Esta función segmenta las células (el "primer plano") y su sustrato utilizando un enfoque de agrupación. A continuación, podrá eliminar la señal de fondo promedio del primer plano o restringir algunos pasos para que solo funcionen en píxeles de primer plano. El número de racimos a seleccionar puede variar según la muestra específica.
    10. En las opciones avanzadas, marque Limpieza morfológica para eliminar algunas pequeñas manchas del primer plano (por ejemplo, partes de células espurias, etc.). A continuación, haga clic en Ejecutar.
    11. En el panel Eliminación óptica de sustrato , para restar la señal de fondo promedio, haga clic en Eliminar sustrato, seleccione Promedio global (media del 95% central de los valores) y haga clic en Ejecutar.
      NOTA: K-medias suele ser más rápida, aunque no determinista (sin embargo, dado que la semilla aleatoria es fija, se obtendrá el mismo resultado en cada ejecución, en igualdad de condiciones). El número de clústeres se puede aumentar más allá de 2 si ciertas partes del primer plano aún se reconocen como fondo. El clúster con la señal promedio más baja se define como el fondo.
    12. Para corregir la fluorescencia de la línea base, abra el panel Línea base y haga clic en Corregir línea base. Seleccione asPLS (Adaptive Smoothness PLS) y establezca λ igual a 5000000. A continuación, haga clic en Ejecutar.
      NOTA: Hay 7 métodos disponibles que se pueden seleccionar, 5 de los cuales se basan en mínimos cuadrados penalizados (PLS). En estos métodos PLS, es necesario un parámetro de suavizado (λ). Un valor más alto de λ dará como resultado líneas de base más suaves.
    13. Para normalizar cada mapa hiperespectral Raman dividiéndolo por su norma de Frobenius, haga clic en Miscelánea y seleccione la opción Normalizar . Luego, seleccione Frobenius como método y haga clic en Ejecutar.
      NOTA: La norma de Frobenius se utiliza para normalizar toda la matriz de datos.
    14. Para obtener una imagen en falso color que ilustre la distribución espacial de un componente subcelular, en el panel Imágenes del lado derecho, en la imagen de intensidad, haga clic en el símbolo del menú Abrir . Luego haga clic en la opción Editar imagen para abrir el panel de edición.
    15. En el panel de edición, seleccione Banda única y, a continuación, defina el rango espectral (por ejemplo, 715−725 cm-1 para el citoplasma). Seleccione Color doble en el mapa Color, defina el color, el umbral de intensidad y la opacidad y, a continuación, haga clic en Confirmar.
    16. Para descargar un espectro de un solo punto, haga clic en el píxel de interés en la imagen para seleccionarlo. A continuación, en el panel Leyenda espectral , en la sección Cursor , haga clic en Descargar espectro. Repita el mismo procedimiento para diferentes componentes subcelulares.
    17. Para exportar los espectros Raman de primer plano y sustrato, en el panel Leyenda espectral , en la sección Identificación de sustrato , haga clic en Descargar espectro para las secciones Primer plano y Sustrato .
      NOTA: En el protocolo descrito anteriormente para el análisis de datos RS, se describieron los pasos de preprocesamiento y el análisis univariado para generar imágenes en falso color que ilustran la distribución espacial de los componentes subcelulares clave, los espectros de intensidad Raman tanto del primer plano como del sustrato, y los espectros de un solo punto de las estructuras subcelulares. Si bien el análisis posterior a menudo se adapta a la pregunta biológica específica, este estudio ahora destaca métodos representativos multivariados y de clasificación accesibles a través de la sección Análisis de mapas de la herramienta basada en la web empleada. Estos incluyen análisis de conglomerados, análisis de componentes principales (PCA), resolución de curva multivariante (MCR), n-findr y ajuste espectral. El ajuste espectral permite la cuantificación y comparación de características espectrales utilizando enfoques basados en la distancia, como el coeficiente de correlación de Pearson o el mapeador de ángulos espectrales. El análisis de conglomerados se puede realizar utilizando algoritmos como k-means, mini-batch k-means o clustering aglomerativo jerárquico, lo que facilita la segmentación de datos hiperespectrales en función de la similitud espectral. PCA se puede aplicar para reducir la dimensionalidad de los datos y resaltar los patrones de varianza, mientras que MCR permite la descomposición de señales mixtas en espectros de componentes puros. El algoritmo N-FINDR ayuda a extraer espectros de miembros finales aplicando primero PCA para reducir la dimensionalidad, lo que lo hace particularmente adecuado para conjuntos de datos hiperespectrales. Estas herramientas proporcionan un marco sólido para la exploración posterior de patrones biológicos codificados en datos espectrales Raman.

4. Protocolo de medición TPM

  1. Prepare la configuración del microscopio.
    1. Coloque una gota de agua destilada en la lente del objetivo del microscopio. Coloque la muestra en la platina de traslación del microscopio. Ajuste la posición de la muestra para alinearla con la lente del objetivo.
  2. Alinee las lentes del objetivo y del condensador.
    1. Encienda el microscopio e inicie el software de imágenes TomoStudio. Haga clic en el icono del microscopio en la barra de herramientas. Después de la inicialización, haga clic en Configuración. Seleccione LiveCell en el panel Trabajo y PBS como medio.
      NOTA: El valor de RI en el panel Medio se establece automáticamente en 1.337 cuando se selecciona PBS como medio.
    2. Acceda a la pestaña Calibración en el panel de control del software de imágenes. Establezca las posiciones axiales de las lentes del objetivo y del condensador seleccionando Enfoque y Superficie, respectivamente.
    3. Haga clic en Modo de escaneo para ajustar manualmente las lentes, asegurándose de que los patrones de iluminación se concentren en el centro del campo de visión y aparezcan casi quietos.
  3. Localice la muestra.
    1. Haga clic en Modo normal y ajuste la etapa de traslación para colocar la celda en el campo de visión. Concéntrese en la muestra ajustando la posición axial de la lente del objetivo hasta que el límite de la muestra se vuelva casi invisible en la pantalla.
    2. Ajuste la etapa de traslación para ubicar una región sin celdas, lo que garantiza una vista sin obstrucciones.
  4. Calibrar el sistema.
    1. Seleccione Calibrar en el software de imágenes para capturar varios hologramas 2D en diferentes ángulos de iluminación.
  5. Adquiera el tomograma 3D RI.
    1. Ajuste la etapa de traslación para centrar la celda dentro del campo de visión. Vaya a la pestaña Adquisición y seleccione Instantánea 3D para capturar el tomograma de la célula.
      NOTA: El tiempo de adquisición de un tomograma RI 3D de una sola célula es significativamente más corto (del orden de segundos), en comparación con el tiempo de adquisición requerido por los datos RS; por lo tanto, normalmente no se requiere la adopción de una incubadora en el escenario para TPM. Sin embargo, si se van a realizar mediciones en un gran número de células, o en condiciones específicas, se dispone de cámaras de incubación comerciales dedicadas que proporcionan condiciones fisiológicas y pueden integrarse en el sistema TPM.

5. Análisis de datos de TPM

  1. Posprocese mapas TPM con el software TomoStudio.
    1. Para visualizar los tomogramas holográficos, seleccione los datos en el panel Navegación de datos , haga clic con el botón secundario en los datos y haga clic en Abrir. La pestaña Investigación se abrirá automáticamente para un análisis más detallado. En el panel Administrador de datos , haga clic en RI Tomogram.
    2. En el panel Visualización de volumen , seleccione RI y dibuje cuatro cuadros de color rectangulares dentro del lienzo de RI.
      NOTA: Cada cuadro de color permite asociar, en el tomograma que se muestra en el panel Pantalla , un color específico a los componentes de la celda caracterizados por el rango de RI identificado por el cuadro en el lienzo de RI. Después de dibujar cada cuadro de color, la información relacionada aparece automáticamente en la tabla debajo del lienzo de RI.
    3. En el panel situado debajo del lienzo de RI, establezca los valores mínimo y máximo de Rango de RI para cada cuadro de color (es decir, primer cuadro de color: MinRI = 1,3450 y MaxRI = 1,3499, segundo cuadro de color: MinRI = 1,3506 y MaxRI = 1,3571, tercer cuadro de color: MinRI = 1,3586 y MaxRI = 1,3650, cuarto cuadro de color: MinRI = 1,3688 y MaxRI = 1,3866). Asocie un valor de opacidad y un color (haciendo doble clic en cada cuadro y seleccionando un color) con cada cuadro. Esto permite la visualización de los tomogramas de acuerdo con las distribuciones 3D RI.
    4. Haga clic en Guardar para guardar los rangos de instancias reservadas definidos y los cuadros de color.
      NOTA: Los rangos de RI deben ajustarse en función de las muestras específicas.
    5. Para obtener descriptores cuantitativos de la morfología celular (es decir, volumen [V], área de superficie [S], área proyectada [A], RI media, densidad [D], masa seca [DM] y esfericidad [Φ]), utilice la interfaz de análisis .
      NOTA: Los detalles sobre el cálculo teórico de los parámetros cuantitativos se pueden encontrar aquí 2,23.
      1. En la barra de herramientas, haga clic en Análisis. En el panel Análisis de la derecha, seleccione Manual en el panel Segmentación y establezca 1,3450 como Umbral de instancias reservadas. A continuación, haga clic en Aplicar.
        NOTA: Asegúrese de que los valores del RII (fl/pg) y del RI de referencia sean respectivamente 0,19 (el incremento de refracción, que está ampliamente establecido por investigaciones previas24) y 1,3370 (RI del PBS empleado para el RI de la calibración de fondo del PBS). El software de imágenes realiza una segmentación volumétrica de la célula diana de acuerdo con el umbral de RI establecido y calcula los índices morfológicos (V, S, A, RI medio, D, DM y Φ) y los informa en una tabla de salida en el panel Medición .
      2. Haga clic en Guardar para guardar los índices morfológicos calculados.
        NOTA: Además del software empleado, se pueden utilizar varias herramientas de código abierto para cuantificar los rasgos morfológicos de los datos de TPM. CellProfiler (https://cellprofiler.org/) proporciona herramientas para el análisis de imágenes, incluida la segmentación y la extracción de características, que son compatibles con imágenes de contraste de fase. Fiji (https://fiji.sc/) es un software de código abierto con complementos para la segmentación y el cálculo de parámetros morfológicos25. Napari (https://napari.org/) es un visor de imágenes multidimensional compatible con la integración de modelos de aprendizaje automático para la segmentación y el análisis. Ilastik (https://www.ilastik.org/) ofrece herramientas de segmentación basadas en aprendizaje automático, y DeepImageJ (https://deepimagej.github.io/) integra modelos de aprendizaje profundo con ImageJ/Fiji para un análisis avanzado. Además, MorphoLibJ (https://imagej.net/plugins/morpholibj) proporciona herramientas para operaciones morfológicas 2D y 3D en Fiji. Cellpose326 es otra herramienta basada en el aprendizaje profundo para la segmentación celular que se puede aplicar a las imágenes de contraste de fase.

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Resultados

Describimos un flujo de trabajo para la caracterización morfoquímica sin etiquetas de células vivas basada en RS confocal y TPM. Probamos la capacidad del flujo de trabajo propuesto para alcanzar la composición molecular y los parámetros morfológicos de la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (Figura 1).

Las células MDA-MB-231 se sembraron en placas de Petri con fondo de vidrio de cuarzo. Se utilizó un microscopio Raman confocal hecho a medida (

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Discusión

Presentamos un enfoque multimodal y una línea de análisis sencilla que integra dos técnicas avanzadas de imágenes sin etiquetas: RS y TPM. El flujo de trabajo descrito permitió un fenotipado morfoquímico rápido y no invasivo de células individuales de cáncer de mama humano vivo (MDA-MB-231) sin necesidad de etiquetado externo.

RS es una técnica no destructiva que permite caracterizar la composición bioquímica de muestras biológicas mediante la detección de los...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por el Progetto Rocca de la fundación MIT-Italia, las subvenciones de los NIH (P41EB015871, UH3CA275687, R01DC021326), Apollon (Seúl, Corea del Sur) y el Centro Nacional del Cáncer, Corea (NCC-24H1170). Leonardo Bianchi reconoce la concesión de una beca postdoctoral Progetto Rocca para realizar investigaciones colaborativas en el Instituto Tecnológico de Massachusetts y el Politécnico de Milán.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cámara CCDInstrumentos de PrincetonPIXIS 100BR eXcelonDetector de señal de dispersión Raman.
Software de control de cámara CCDInstrumentos de PrincetonCampo de luz
Láser Ti-Sapphire de onda continua (longitud de onda: 785 nm)Espectro-Física3900 SSe utiliza para la excitación de microscopía Raman.
Espejo dicroicoThorLabsDMSP750BEspejo dicroico de 749 nm, desvía la excitación Raman de 785 nm a la muestra, filtra las señales de fluorescencia y campo claro.
Suero fetal bovinoThermo Fisher ScientificA5256701
Cuerpo del microscopio de fluorescenciaOlimpoIX83
Láser (longitud de onda: 532 nm)Espectro-FísicaMilenios eVLáser de bomba para sistema láser Ti-Sapphire de 785 nm.
Software MATLABMathWorks2023a
Línea celular MDA-MB-231ATCCHTB-26
Espectrógrafo NIRAndrorHolospec HS-HSG-785-LFSe utiliza para el análisis espectral de la luz retrodispersada.
Lente del objetivo (60 veces; 1.2 NA de inmersión en agua)OlimpoUPLSAPO60&tiempos;
Cámara de incubación en el escenarioGolpe de Tokaistxg-welsx-set
Software de control de microscopios de código abiertoy micro; DirectorMicro-Manager-2.0
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
DMEM/F-12 libre de fenolThermo Fisher Scientific21041025
Solución salina tamponada con fosfatoGibco10-010-023
Placas de Petri con fondo de cristal de cuarzoTecnología Waken BSF-S-D12
Software de análisis de datos RamanRamAppHerramienta basada en la web para el procesamiento de datos hiperespectrales Raman.
Cámara sCMOSFotónica de HamamatsuOrca Flash 4.0 v2
Bomba de jeringaChemyxFusión 720
Microscopio de fase tomográficaTomocube, Inc.HT-2HSistema comercial para la obtención de imágenes cuantitativas de fase.
Software de análisis de datos TPMTomocube, Inc.Estudio TomoSoftware utilizado para analizar datos de microscopía de fase tomográfica (TPM).

Referencias

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