Un marco de imágenes multimodal para avanzar en el fenotipado de células vivas de cáncer de mama sin etiquetas

Resumen

Este protocolo presenta un enfoque multimodal que combina la espectroscopia Raman y la microscopía de fase tomográfica para el fenotipado no invasivo y sin etiquetas de células vivas de cáncer de mama humano. Incluye una línea de análisis fácil de usar y sin sesgos humanos para un análisis morfoquímico rápido y cuantitativo, que proporciona información molecular y estructural detallada con aplicaciones en la investigación del cáncer y la biología celular.

Resumen

Presentamos la microespectroscopía Raman confocal multimodal (RS) y la microscopía de fase tomográfica (TPM) para el fenotipado morfoquímico rápido de células de cáncer de mama humano (MDA-MB-231). Aprovechando la naturaleza no perturbativa de estas técnicas avanzadas de microscopía, capturamos datos morfomoleculares detallados de células vivas y libres de etiquetas en su entorno fisiológico nativo. Se desarrollaron canales de procesamiento de datos sin sesgos humanos para analizar imágenes Raman hiperespectrales (que abarcan modos Raman de 600 ^cm-1 a 1800 ^cm-1, que caracterizan de manera única una amplia gama de enlaces moleculares y estructuras subcelulares), así como datos morfológicos de tomografías de índice de refracción tridimensionales (que proporcionan mediciones de volumen celular, área de superficie, huella y esfericidad a resolución nanométrica, junto con la masa seca y la densidad). Al desglosar sistemáticamente los ricos detalles unicelulares que brindan RS y TPM, demostramos, de manera cuantitativa, la ventaja de un método de microscopía multimodal de este tipo para fenotipar células tumorales de cáncer de mama. Nuestras herramientas también brindan más información sobre la información subcelular sin el uso de etiquetas. Finalmente, estudiamos y discutimos cualquier información única o correlacionada que presenten los conjuntos de datos derivados de RS y TPM. Creemos que nuestras herramientas y canales de análisis de datos cuantitativos pueden revolucionar las tareas de fenotipado en la investigación biomédica cuando se necesita un método rápido y no perturbativo en células vivas en cultivo, con el potencial de una futura traducción en aplicaciones clínicas y de diagnóstico.

Introducción

La caracterización celular y el fenotipado son aspectos fundamentales de la investigación biomédica¹. Ser capaz de caracterizar las células tanto a nivel morfológico como molecular es primordial para comprender la función, diferenciación y patología celular ^1,2,3. Es particularmente interesante en el campo de la oncología, donde es necesario un perfil celular preciso para el diagnóstico tumoral, la determinación del estadio de la enfermedad y, en última instancia, la identificación de objetivos terapéuticos

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Siembre las células MDA-MB-231 en placas de Petri de cuarzo.
   1. Coloque las células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 en placas de Petri con fondo de vidrio de cuarzo de 3,5 cm.
   2. Incubar las células a 37 °C en un ambiente con 5% de_CO2 hasta que estén completamente adheridas a la superficie (al menos 12 h después de la siembra).
2. Lave las celdas y prepárelas para la medición.
   1. Retire el medio de cultivo de las células una vez que se hayan adherido a la placa de Petri.
   2. Lave las células suavemente con solució....

Resultados

Describimos un flujo de trabajo para la caracterización morfoquímica sin etiquetas de células vivas basada en RS confocal y TPM. Probamos la capacidad del flujo de trabajo propuesto para alcanzar la composición molecular y los parámetros morfológicos de la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (Figura 1).

Las células MDA-MB-231 se sembraron en placas de Petri con fondo de vidrio de cuarzo. Se utilizó un microscopio Raman confocal hecho a medida (

Discusión

Presentamos un enfoque multimodal y una línea de análisis sencilla que integra dos técnicas avanzadas de imágenes sin etiquetas: RS y TPM. El flujo de trabajo descrito permitió un fenotipado morfoquímico rápido y no invasivo de células individuales de cáncer de mama humano vivo (MDA-MB-231) sin necesidad de etiquetado externo.

RS es una técnica no destructiva que permite caracterizar la composición bioquímica de muestras biológicas mediante la detección de los.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cámara CCD	Instrumentos de Princeton	PIXIS 100BR eXcelon	Detector de señal de dispersión Raman.
Software de control de cámara CCD	Instrumentos de Princeton	Campo de luz
Láser Ti-Sapphire de onda continua (longitud de onda: 785 nm)	Espectro-Física	3900 S	Se utiliza para la excitación de microscopía Raman.
Espejo dicroico	ThorLabs	DMSP750B	Espejo dicroico de 749 nm, desvía la excitación Raman de 785 nm a la muestra, filtra las señales de fluorescencia y campo claro.
Suero fetal bovino	Thermo Fisher Scientific	A5256701
Cuerpo del microscopio de fluorescencia	Olimpo	IX83
Láser (longitud de onda: 532 nm)	Espectro-Física	Milenios eV	Láser de bomba para sistema láser Ti-Sapphire de 785 nm.
Software MATLAB	MathWorks	2023a
Línea celular MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
Espectrógrafo NIR	Andror	Holospec HS-HSG-785-LF	Se utiliza para el análisis espectral de la luz retrodispersada.
Lente del objetivo (60 veces; 1.2 NA de inmersión en agua)	Olimpo	UPLSAPO60&tiempos;
Cámara de incubación en el escenario	Golpe de Tokai	stxg-welsx-set
Software de control de microscopios de código abierto	y micro; Director	Micro-Manager-2.0
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
DMEM/F-12 libre de fenol	Thermo Fisher Scientific	21041025
Solución salina tamponada con fosfato	Gibco	10-010-023
Placas de Petri con fondo de cristal de cuarzo	Tecnología Waken B	SF-S-D12
Software de análisis de datos Raman	RamApp		Herramienta basada en la web para el procesamiento de datos hiperespectrales Raman.
Cámara sCMOS	Fotónica de Hamamatsu	Orca Flash 4.0 v2
Bomba de jeringa	Chemyx	Fusión 720
Microscopio de fase tomográfica	Tomocube, Inc.	HT-2H	Sistema comercial para la obtención de imágenes cuantitativas de fase.
Software de análisis de datos TPM	Tomocube, Inc.	Estudio Tomo	Software utilizado para analizar datos de microscopía de fase tomográfica (TPM).