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Artículo de método

Detección de ácido nucleico y gen de resistencia a medicamentos de Mycoplasma pneumoniae

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DOI:

10.3791/68500

⸱

19 de septiembre de 2025

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1Department of Clinical Laboratory Medicine, Heyuan Key Laboratory of Molecular Diagnosis & Disease Prevention and Treatment, Heyuan People's Hospital, Guangdong Provincial People's Hospital Heyuan Hospital, 2Department of Clinical Laboratory Medicine, Heyuan People's Hospital, Guangdong Provincial People's Hospital Heyuan Hospital, 3Department of Clinical Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Southern Medical University, 4Medical laboratory, Heyuan Key Laboratory of Molecular Diagnosis & Disease Prevention and Treatment, Doctors Station of Guangdong province, Heyuan People's Hospital, Guangdong Provincial People's Hospital Heyuan Hospital

En este artículo

Resumen

Este protocolo proporciona una forma rápida y fiable de detectar infecciones por Mycoplasma pneumoniae e identificar la resistencia a los antibióticos. Ayuda a los médicos a elegir los tratamientos adecuados más rápido, mejorando la atención a los pacientes con neumonía y apoyando un mejor uso de los antibióticos

Resumen

Mycoplasma pneumoniae (Mp) representa uno de los patógenos más prevalentes responsables de la neumonía adquirida en la comunidad (NAC) en poblaciones pediátricas. La detección de genes de resistencia a Mycoplasma pneumoniae proporciona un sólido apoyo técnico y una base teórica para el diagnóstico clínico preciso y el tratamiento de las infecciones por MP. El diagnóstico y la evaluación precisos de la resistencia a los medicamentos en la infección por Mp son esenciales para el tratamiento clínico. Los métodos de detección comunes para Mycoplasma pneumoniae incluyen cultivo, detección de anticuerpos y ensayos basados en biología molecular. El cultivo de MP es el estándar de oro para el diagnóstico, pero requiere un medio específico, requiere mucho tiempo y tiene baja sensibilidad. La detección de Mp basada en anticuerpos se usa ampliamente; sin embargo, pueden ocurrir falsos negativos en la etapa inicial de la infección. La detección basada en biología molecular proporciona una respuesta rápida, bajo riesgo de contaminación, alta sensibilidad, alta especificidad y no está limitada por el momento de la recolección de muestras o el estado inmunológico. Por lo tanto, ha sido reconocido como un nuevo estándar de oro para diagnosticar la infección por Mycoplasma pneumoniae . Los agentes macrólidos son el tratamiento de primera elección para la infección por Mp en niños. Sin embargo, con el uso extensivo de macrólidos en infecciones del tracto respiratorio en niños, la incidencia de infección por Mycoplasma pneumoniae resistente a los medicamentos ha ido en aumento. Los pacientes infectados con cepas resistentes experimentan una duración significativamente más larga de la fiebre, hospitalización prolongada y fiebre prolongada después de la administración en comparación con los infectados con cepas sensibles. Los sitios de mutación identificados hasta la fecha incluyen 2063, 2064, 2067 y 2617. En China, las mutaciones puntuales se han documentado solo en las posiciones 2063 y 2064, siendo la más común una sustitución de A a G en la posición 2063. Para estos sitios, se ha empleado la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) combinada con tecnología de sonda fluorescente para detectar los ácidos nucleicos y las mutaciones de resistencia a los medicamentos de Mycoplasma pneumoniae en muestras de esputo humano. La detección de genes de resistencia a Mycoplasma pneumoniae ofrece un apoyo técnico crucial y una base teórica para un diagnóstico preciso y un tratamiento eficaz de la infección por Mp.

Introducción

Mycoplasma pneumoniae (Mp) es el microorganismo patógeno más pequeño capaz de sobrevivir de forma independiente, situado en una posición intermedia entre bacterias y virus. Se disemina principalmente por gotitas respiratorias o aerosoles y constituye el segundo patógeno más común asociado con la neumonía adquirida en la comunidad (NAC) en niños1, responsable del 20% al 40% de los casos de NAC2. Mp muestra resistencia inherente a los antibióticos β-lactámicos, como la penicilina y las cefalosporinas, debido a su ausencia de pared celular, a la que estos antibióticos se dirigen obstruyendo la síntesis de la pared celular. Las principales modalidades terapéuticas para las infecciones por Mp comprenden agentes que obstruyen la síntesis de proteínas, incluidos macrólidos y tetraciclinas, junto con productos farmacéuticos que impiden la replicación del ADN, como las tetraciclinas y las fluoroquinolonas 3,4,5. Por lo tanto, la pronta identificación de laboratorio de Mp es esencial para informar la aplicación juiciosa de antibióticos. Los métodos contemporáneos de detección de laboratorio para Mp abarcan el aislamiento y el cultivo, la detección de antígenos, la detección de anticuerpos y las técnicas de diagnóstico genético.

Como método de detección tradicional, el aislamiento y el cultivo siguen siendo el estándar definitivo para diagnosticar la infección por Mycoplasma pneumoniae . Kashyap et al. observaron que el cultivo de Mp a partir de hisopos faríngeos o muestras de esputo es una técnica diagnóstica confiable6. Este enfoque encuentra obstáculos considerables, como los rigurosos requisitos culturales previos de Mp, los períodos de cultivo prolongados y las tasas de detección positiva típicamente bajas, que restringen su uso clínico rutinario. La detección del antígeno Mp depende de anticuerpos específicos de Mp. Miyashita et al. utilizaron anticuerpos monoclonales de varias cepas de Mp como agentes de recubrimiento en un ELISA sándwich de doble anticuerpo y evaluaron su eficacia mediante PCR7. Los hallazgos no revelaron diferencias sustanciales entre las dos metodologías. Sin embargo, la necesidad de anticuerpos monoclonales altamente específicos y de alto título limita la implementación extensiva de este método.

Después de la infección por Mp, el sistema inmunológico genera anticuerpos IgM e IgG específicos. Los anticuerpos IgM generalmente se vuelven detectables dentro de 1 semana después de la infección y alcanzan su punto máximo a las 3 a 4 semanas, lo que los convierte en valiosos indicadores de diagnóstico para la infección temprana. Sin embargo, pueden surgir resultados falsos negativos en las etapas iniciales debido a la disminución de los niveles de anticuerpos8. Por el contrario, los anticuerpos IgG se manifiestan más tarde y generalmente significan una infección previa 9,10. La detección serológica de Mp se clasifica en ensayos de anticuerpos específicos e inespecíficos. Si bien las pruebas de anticuerpos no específicas son fáciles de administrar, su especificidad es limitada, ya que las infecciones por otros patógenos, como la rickettsia y el adenovirus, también pueden aumentar los niveles de aglutininas frías, lo que resulta en resultados falsos positivos. Los ensayos de anticuerpos específicos abarcan la prueba de fijación del complemento, la prueba de aglutinación de partículas, la prueba de hemaglutinación indirecta, el ensayo de inmunofluorescencia indirecta y el ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA). ELISA se utiliza ampliamente en China debido a su tecnología establecida y accesibilidad comercial, proporcionando alta sensibilidad y simplicidad operativa, sirviendo así como un método práctico y confiable para diagnosticar infecciones por Mp en la práctica clínica de rutina11.

La PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real se distingue por su rápido tiempo de procesamiento, especificidad elevada, sensibilidad robusta y ausencia de reactividad cruzada. Este método identifica el ADN Mp en muestras de esputo, hisopo de garganta o líquido de lavado bronquial, y requiere de 1 a 100 ng de ADN por reacción. La detección se realizó mediante un instrumento de PCR en tiempo real. La plantilla de ADN experimenta desnaturalización a temperaturas más altas, seguida de recocido de cebadores e hibridación de sondas fluorescentes. La tecnología de amplificación de genes permite la replicación de fragmentos de ácidos nucleicos a concentraciones extremadamente bajas a millones de copias en un breve período de tiempo, alcanzando una sensibilidad de detección de ≥10 UFC/ml12. En comparación con la PCR convencional, la PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real reduce los riesgos de contaminación al tiempo que permite un análisis automatizado y de alto rendimiento. Por lo tanto, ha surgido como la técnica preferida para la detección directa de Mp en la práctica clínica13. Debido a su mayor sensibilidad, se necesitan medidas estrictas para evitar la contaminación, lo que podría resultar en resultados falsos positivos o falsos negativos.

En el tratamiento clínico, los macrólidos constituyen la principal intervención terapéutica para la neumonía por Mycoplasma pneumoniae (MPP). El uso excesivo y la aplicación inadecuada de antibióticos han impuesto una presión selectiva, lo que ha llevado a la aparición de Mp resistente a macrólidos. Esta resistencia contribuye significativamente al MPP refractario. La resistencia a los macrólidos en Mycoplasma pneumoniae es notablemente elevada en el este de Asia, particularmente en China y Japón, mientras que Europa y los Estados Unidos exhiben tasas de resistencia relativamente más bajas. Los pacientes pediátricos generalmente muestran tasas de resistencia elevadas en comparación con los adultos, lo que requiere un mayor escrutinio14. Desde el año 2000, la incidencia de infecciones por Mycoplasma pneumoniae (MRMPI) ha aumentado significativamente a escala mundial, especialmente en Asia oriental. En China, las cepas MRMPI constituyen del 69% al 95% de los casos15, lo que contribuye sustancialmente a la enfermedad grave, el fracaso del tratamiento, las complicaciones y las secuelas a largo plazo. La investigación indica que las mutaciones en el gen 23S rRNA inhiben la unión de macrólidos a sitios diana, lo que disminuye la eficacia del fármaco. Los loci de mutación frecuentes abarcan las posiciones 2063, 2064, 2067 y 2617. En China, las mutaciones se han identificado exclusivamente en las posiciones 2063 y 206416,17. Un estudio de 2016 indicó que las tasas de resistencia a los macrólidos en Beijing, Harbin, Shanghai y Xinjiang variaron entre el 66,7% y el 86,7%, mientras que Nanjing exhibió una tasa más baja del 20%18. Han surgido cepas resistentes a los macrólidos en varias regiones, con tasas de resistencia reportadas de la siguiente manera: 8,3% -9,8% en Francia, 3,0% -3,6% en Alemania, 8,2% en los Estados Unidos, 0,9% -2,9% en Dinamarca, 12,1% en Canadá, 20% en Italia, 22% en Israel, 8% en España y 9,3% en el Reino Unido 19,20,21,22,23,24,25,26, Artículo 27. Esta tendencia destaca la proliferación mundial de resistencia a los macrólidos. En 2008, Hindley et al. informaron 46 casos de Mycoplasma pneumoniae resistente a macrólidos, con 40 casos que demostraron la mutación A2063G, un caso que presentó la mutación A2063C y cinco casos que exhibieron la mutación A2064G28. Se han identificado mutaciones de resistencia comparables en Japón y Estados Unidos, y las mutaciones primarias ocurren en las posiciones 2063 y 206429. La investigación sugiere una relación entre los sitios de mutación y los fenotipos de resistencia a los medicamentos: la mutación A2063G imparte resistencia a los macrólidos (ML) de 14 miembros, la mutación A2064G imparte resistencia a ML de 14 y 16 miembros, C2617G imparte resistencia a ML de 14 y 15 miembros, y la mutación A2067G imparte resistencia a ML30 de 16 miembros. El seguimiento de la resistencia a Mp es crucial para la identificación temprana de infecciones resistentes a los medicamentos y para informar las opciones de tratamiento clínico. Los estudios han demostrado que las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos in vitro pueden predecir la efectividad clínica de los medicamentos31. En 2011, el Instituto Americano de Estándares Clínicos y de Laboratorio promulgó directrices que abogan por el método de microdilución para determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) para evaluar la resistencia a los macrólidos32. Sin embargo, la determinación de la CMI puede requerir varias semanas, lo que limita su utilidad clínica para dirigir la terapia con antibióticos en tiempo real.

La secuenciación de Sanger es una técnica directa para identificar mutaciones en el gen 23S rRNA de Mp. Este método utiliza nucleótidos marcados con fluorescencia y análisis electroforético para determinar las secuencias de ADN, lo que facilita la identificación de variaciones genéticas de Mp. La secuenciación de Sanger, si bien es capaz de identificar simultáneamente múltiples mutaciones y cuantificar las proporciones de cepas resistentes y susceptibles, requiere mucha mano de obra y tiempo, lo que limita su utilidad clínica33,34. Por el contrario, la pirosecuenciación proporciona una evaluación más precisa de las variaciones de la secuencia de ADN al identificar la liberación de pirofosfato durante la incorporación de nucleótidos. Este método puede identificar cepas MRMPI y cuantificar las proporciones de cepas resistentes y susceptibles en muestras clínicas con mayor precisión que la secuenciación de Sanger. Además, la pirosecuenciación permite el seguimiento longitudinal de pacientes individuales, lo que permite evaluar en tiempo real el desarrollo de resistencia e informar las modificaciones del tratamiento33. Sin embargo, su aplicación clínica está limitada por la necesidad de aparatos especializados, personal competente y duraciones de procesamiento prolongadas.

Con base en el análisis del polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP) del gen P1, Mp se clasifica en dos tipos: tipo I (dividido en cinco subtipos: 1a-1e) y tipo II (dividido en tres subtipos: 2a-2c). Esta prueba puede detectar 8 subtipos de genes de Mycoplasma pneumoniae35. Este método facilita la identificación cualitativa de Mycoplasma pneumoniae y mutaciones de resistencia a macrólidos (sitios de mutación 23S rRNA 2063 (A: G) y 2064 (A: G)) en muestras de esputo pediátricas, proporcionando un instrumento de diagnóstico complementario rápido y sencillo para las infecciones por Mycoplasma y la vigilancia de la resistencia a los antibióticos.

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Protocolo

Todos los protocolos del estudio fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética Médica del Hospital Popular de Heyuan (Aprobación No. YXYJLL-LW2025001). Todos los pacientes proporcionaron su consentimiento informado por escrito antes de participar.

1. Recogida de muestras

NOTA: Tenga cuidado al mantener la técnica aséptica durante la recolección de muestras.

  1. Recoger muestras de esputo del paciente o paciente sospechoso. Obtenga muestras dentro de los 3 días posteriores al inicio de la enfermedad del paciente.
  2. Indique al paciente que se enjuague la boca con agua, respire profundamente, retenga la respiración durante 5 s y exhale gradualmente.
  3. Pídale al paciente que exhale profundamente una vez más, intente expulsar el esputo, deposite en un vaso de plástico designado y asegure la tapa. El esputo debe entregarse rápidamente al laboratorio clínico a temperatura ambiente (RT). Guarde las muestras a 2-8 °C en un refrigerador.

2. Preparación de reactivos de amplificación

  1. En el área de preparación de reactivos del laboratorio de PCR, descongele el tampón, la sonda de cebado y el agua del kit a 4 °C después de recuperarlos del congelador a -20 °C. Retire la enzima, mézclela suavemente agitándola y luego centrifugue a 1.006 x g durante 10 s.
  2. Recupere un tubo de centrífuga estéril libre de nucleasas, etiquételo y prepare el sistema de reacción para cada individuo como se describe en la Tabla 1. El número total de reacciones de PCR debe ser igual a la suma de las muestras, un control de calidad positivo débil, un producto de control de calidad W y un control de extracción negativo.
  3. Determine la cantidad de cada reactivo, incorpórelo a un tubo de centrífuga de tamaño adecuado, mezcle bien y centrifugue brevemente a baja velocidad. Dispense 20 μl de reactivo en cada tubo de reacción de PCR y reubíquelo en el área de procesamiento de muestras.

3. Tratamiento de muestras

  1. Tratar 1 ml de muestras de esputo con 2 ml de tampón de digestión de esputo, mezclar bien con vórtices e incubar durante 30 min hasta lograr una licuefacción completa.
  2. Según la cantidad de muestra, agregue 5 μL del estándar interno secuencialmente a las columnas 1y 7de la placa de extracción de ácidos nucleicos, seguido de la adición de 200 μL de muestras licuadas, solución salina normal y control de calidad positivo débil MM en sucesión.
  3. Recupere una placa de extracción de ácido nucleico utilizando un instrumento automatizado de extracción de ácido nucleico. Agregue los ácidos nucleicos extraídos después de realizar ensayos posteriores en las columnas 6 y 12 de la placa de extracción.
  4. Adición de muestras: En el área de preparación de muestras del laboratorio de PCR, agregue ácido nucleico extraído en las columnas 6y 12de la placa de extracción. Posteriormente, transfiera 5,0 μl del ácido nucleico de la muestra preparada al tubo de reacción de PCR, que contiene la mezcla de reacción de PCR (incluida la muestra, los controles de calidad positivos fuertes y débiles, el control de calidad W y el control negativo de extracción).
  5. Asegure el líquido del tubo de reacción de PCR y realice una centrifugación inmediata para confirmar que el líquido está correctamente sellado y sin burbujas.

4. Amplificación

  1. Inserte el tubo de reacción en el detector de PCR de fluorescencia y configure los parámetros del ciclo de la siguiente manera en la Tabla 2.
  2. Adquiera señales de fluorescencia en FAM (mutación 2063 o 2064 A: G), VIC (Mycoplasma pneumoniae) y CY5 (estándar interno), con la recopilación de datos establecida en 64 ° C.

5. Análisis de datos

NOTA: Este estudio empleó PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), con resultados representativos que indican mutaciones asociadas a la resistencia a A:G en las posiciones 2063 o 2064 de Mycoplasma pneumoniae. Los pacientes que den positivo deben evitar los antibióticos macrólidos en el tratamiento clínico.

  1. Después de la reacción, el instrumento analiza y archiva los resultados de forma autónoma. Comprobar que los genes diana para el control negativo exhiben fluorescencia FAM Ct ≥ 35.33 y fluorescencia VIC Ct ≥ 35.01, mientras que los genes diana para el control de calidad W demuestran fluorescencia FAM Ct ≥ 35.33 y fluorescencia VIC Ct ≥ 35.01. Los valores de Ct para fluorescencia FAM y VIC en productos de control de calidad débilmente positivos oscilaron entre 29,00 y 34,00.
  2. Generalmente, el valor Ct del estándar interno es ≤ 35.00. Si se observa una curva de amplificación S característica pero el estándar interno no se amplifica debido a la concentración elevada del gen diana, infórmelo directamente como una muestra positiva o vuelva a evaluar la muestra a través de una dilución de gradiente de 10 veces.
  3. Clasifique la muestra que exhibe UNDECT o la ausencia de una curva de amplificación típica de tipo S como negativa.
  4. Considere que las muestras son negativas cuando la fluorescencia FAM (mutación 2063 o 2064 A: G) Ct ≥ 35,33, la fluorescencia VIC (Mycoplasma pneumoniae) Ct ≥ 35,01, o cuando no hay una curva de amplificación típica de tipo S. Las muestras de Deem son positivas cuando su valor de Ct cumple con la Tabla 3 y exhiben una curva de amplificación característica de tipo S.
    NOTA: Los resultados de la detección de muestras dependen de la calidad de la recolección, procesamiento, transporte y preservación de la muestra; Cualquier error puede resultar en resultados falsos negativos. La falta de control de la contaminación cruzada durante el procesamiento de muestras puede dar lugar a resultados falsos positivos.

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Resultados

Después de la licuefacción, la extracción de ácidos nucleicos y la amplificación por PCR de fluorescencia de muestras de esputo, el valor inicial, el valor final y el valor umbral de la línea de base se modificaron después del análisis de la curva de amplificación. El valor inicial fue 3 y el valor final fue 20.

Los resultados representativos de este experimento fueron positivos para el ácido nucleico Mp, y se produjo una mutaci...

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Discusión

La PCR y sus técnicas derivadas demuestran una sensibilidad y especificidad superiores en comparación con los métodos serológicos en la identificación, tipificación y detección de resistencia a los medicamentos en Mycoplasma pneumoniae (MP). Además, las técnicas basadas en PCR proporcionan facilidad de operación y reducción de gastos, lo que las convierte en una alternativa viable para el diagnóstico clínico de rutina36. Mp es un patógeno notable asociado...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

Los reactivos experimentales cuentan con el apoyo del Laboratorio Heyuan Key de Diagnóstico Molecular y Prevención y Tratamiento de Enfermedades, Doctors Station de la provincia de Guangdong.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Instrumento automatizado de extracción de ácidos nucleicosGuangzhou Da 'an Gene Co., Ltd.Inteligente 32
Consejos de filtroExtracción de núcleos de ciencias de la vida Co., Ltd.298220010-10µ L
Consejos de filtroExtracción de núcleos de ciencias de la vida Co., Ltd.030230011-50µ L
Consejos de filtroExtracción de núcleos de ciencias de la vida Co., Ltd.056230015-300µ L
MicrotubosExtracción de núcleos de ciencias de la vida Co., Ltd.141249341,5 ml
Mycoplasma pneumoniae kit de detección de sitios de mutación de resistencia a fármacos y ácidos nucleicos (método de PCR de fluorescencia)Jiangsu Mole Biotechnology Co., Ltd.20241111
Reactivo de extracción de ácidos nucleares (método de perlas magnéticas)Shengxiang Biotechnology Co., Ltd.G24004
Tubos de PCRDN Biotech(Hong Kong)  Co., Ltd.61210030,2 ml
Instrumento de PCR fluorescente en tiempo realBIO-RADCFX96

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