Method Article

Clonación de lanzadera basada en CRISPR: un método de clonación de alto rendimiento

DOI:

10.3791/68503

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Describimos un protocolo para un método de clonación de alto rendimiento, la clonación de lanzadera basada en CRISPR (clonación CRISPRshuttle), que permite la transferencia de fragmentos de ADN de interés entre vectores sin necesidad de amplificación por PCR de los fragmentos de ADN.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El desarrollo de bibliotecas de plásmidos de todo el genoma utilizando los repositorios genómicos existentes sirve como un requisito previo fundamental para la caracterización funcional sistemática de genes en diversos procesos biológicos. Sin embargo, las metodologías actuales de alto rendimiento para la transferencia de fragmentos de ADN entre vectores requieren la amplificación por PCR de las secuencias objetivo antes de la clonación, lo que hace que la generación de colecciones de plásmidos a escala genómica sea técnicamente exigente y requiera mucho tiempo. Aprovechando un casete CRISPRshuttle, desarrollamos un nuevo método de clonación de alto rendimiento, la clonación de lanzadera basada en CRISPR (clonación CRISPRshuttle), que facilita la transferencia de muchos fragmentos de ADN de plásmidos donantes que comparten secuencias troncales idénticas a un vector compatible con CRISPRshuttle sin amplificación por PCR de los fragmentos de ADN. A continuación, presentamos un protocolo para CRISPRshuttle. Este protocolo implica dos reacciones secuenciales de probeta antes de la transformación bacteriana. En primer lugar, los fragmentos de ADN objetivo se extirpan de los plásmidos donantes mediante la escisión mediada por Cas9 de su secuencia principal vectorial compartida. En segundo lugar, los fragmentos de ADN extirpados se insertan en vectores linealizados compatibles con CRISPRshuttle a través del ensamblaje de Gibson. Nuestros resultados demuestran que la eficiencia de CRISPRshuttle supera el 94% y que dos investigadores pueden generar alrededor de 300 plásmidos en 7 días utilizando CRISPRshuttle. CRISPRshuttle facilita la transferencia eficiente, adaptable y rentable de fragmentos de ADN entre vectores, lo que agiliza significativamente la generación de bibliotecas de plásmidos en todo el genoma.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La construcción de bibliotecas de plásmidos de todo el genoma a partir de los recursos disponibles es la base y el requisito previo para emplear la genómica funcional para diseccionar procesos biológicos. Los métodos actuales de clonación de alto rendimiento, incluidos los sistemas de clonación Gateway, In-Fusion, Creator y Univector, requieren la amplificación por PCR de fragmentos de ADN objetivo 1,2,3,4,5. Este requisito previo implica flujos de trabajo de procesamiento específicos de fragmentos que abarcan múltiples operaciones estandarizadas, incluidas, entre otras, el diseño de cebadores de oligonucleótidos, la purificación en gel y la validación de secuencias mediante secuenciación. Como resultado, la construcción de bibliotecas de plásmidos de todo el genoma (por ejemplo, bibliotecas de sobreexpresión de ADNc/ORF) se ha vuelto laboriosa y requiere mucho tiempo, lo que impide el avance de la genómica funcional.

Anteriormente, desarrollamos CRISPRmass, un método de clonación de alto rendimiento diseñado para integrar fragmentos específicos de ADN (por ejemplo, el módulo UAS) en múltiples plásmidos que comparten esqueletos vectoriales idénticos6. Utilizando CRISPRmass, construimos más de 5.500 plásmidos UAS-cDNA/ORF basados en GAL4/UAS a partir de una biblioteca de Drosophila cDNA/ORF, la Colección de Oro del Centro de Recursos Genómicos de Drosophila (DGRC)6. Sin embargo, CRISPRmass carece de la capacidad de transferir fragmentos de ADN entre vectores, lo que restringe su aplicación en la clonación de alto rendimiento.

Para abordar estas limitaciones, desarrollamos la clonación de lanzadera basada en CRISPR (CRISPRshuttle), un nuevo método de alto rendimiento que facilita la transferencia de múltiples fragmentos de ADN objetivo a los vectores de destino desde plásmidos donantes7. Este proceso requiere solo dos reacciones secuenciales de probeta, eludiendo así el requisito de manejo específico de fragmentos de objetivos discretos de ADN7.

El protocolo CRISPRshuttle implica dos reacciones secuenciales de probeta (Figura 1). En primer lugar, las secuencias de la columna vertebral vectorial compartida de plásmidos donantes son escindidas por Cas9/sgRNA para liberar fragmentos de ADN objetivo. A continuación, estos fragmentos se transfieren al casete CRISPRshuttle de un vector compatible con CRISPRshuttle a través del ensamblaje de Gibson para generar los plásmidos finales. Un casete CRISPRshuttle comprende una secuencia troncal vectorial de ~20-40 pb que flanquea los extremos 5' y 3' de los fragmentos de ADN que se originan en plásmidos donantes, y uno o dos sitios únicos de reconocimiento de enzimas de restricción ubicados entre estas secuencias flanqueantes. Un vector compatible con CRISPRshuttle se construye insertando un casete CRISPRshuttle en un vector de destino, que posteriormente se linealiza digiriendo los sitios de restricción dentro del casete. El vector de destino debe ser portador de un gen de resistencia a los antibióticos distinto de los de los plásmidos del donante; Si es idéntico, el gen de resistencia debe ser reemplazado por uno distinto antes de su uso.

Aquí, presentamos un protocolo detallado que utiliza CRISPRshuttle para construir una biblioteca de plásmidos UAS-cDNA/ORF. Este proceso implica la transferencia de ORFs humanos de la Biblioteca de Expresión Lentiviral Amplia de CCSB al vector de transgénesis de Drosophila pBID-UASC 8,9. CRISPRshuttle agiliza la construcción de bibliotecas de plásmidos de todo el genoma, lo que facilita los estudios de genómica funcional.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Determinación de los sitios óptimos de escisión de Cas9/sgRNA que flanquean el ADNc/ORF

  1. Preparación de plásmidos de ADNc/ORF
    1. Obtener clones de ADNc/ORF de repositorios públicos.
      NOTA: Este protocolo utiliza los clones de ORF basados en vectores pLX304 de la biblioteca de expresión lentiviral amplia de CCSBhumana 8.
    2. Aísle el plásmido con un kit de minipreparación de plásmidos y mida su concentración con un espectrofotómetro.
  2. Diseño de sgRNA
    1. Acceda al sitio web de CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Pegue la región de 20-100 pb de la red troncal vectorial pLX304 que flanquea el extremo ORF 3' en el campo de destino.
    2. Seleccione Drosophila melanogaster como especie y haga clic en Buscar sitios de destino. Seleccione candidatos a sgRNA que se prediga que tienen una eficiencia superior al 80%.
  3. Preparación de sgRNA
    1. Sintetice un cebador directo (5′-TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3′) donde (N)20 representa la secuencia diana de sgRNA, y un cebador inverso sgRNA-REV (5′- AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′).
      NOTA: Se recomiendan imprimaciones purificadas con PAGE.
    2. Genere una plantilla de ADN para la transcripción in vitro (IVT) de sgRNA mediante PCR. Prepare una reacción de 100 μL que contenga 5 μL de molde pX330 (plásmido Addgene 42230; 0,1 ng/μL), cebador directo (10 μM) y cebador sgRNA-REV (10 μM); 50 μL de 2 mezclas maestras de PCR de alta fidelidad; y 35 μL de agua ultrapura tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC).
    3. Amplificar en un termociclador PCR utilizando el siguiente programa: 98 °C durante 30 s; 5 ciclos de 98 °C durante 8 s, 52 °C durante 15 s, 72 °C durante 5 s; 30 ciclos de 98 °C durante 8 s, 72 °C durante 20 s; 72 °C durante 2 min.
    4. Resuelva los productos de PCR en un gel de agarosa al 0,8%. Extirpe la banda de ~ 120 pb y purifique con un kit de extracción de gel.
    5. Prepare una reacción IVT de 10 μL que contenga 300 ng de fragmento de ADN purificado, 3,33 μL de mezcla tampón NTP, 0,67 μL de mezcla de ARN polimerasa T7 y agua ultrapura tratada con DEPC. Incubar a 37 °C durante 4 h.
    6. Cuantifique el sgRNA no purificado por espectrofotometría, diluya a 20 ng/μL con agua ultrapura tratada con DEPC y congele a -80 °C en pequeñas alícuotas.
      NOTA: El tratamiento con DNasa es innecesario, ya que el ADN residual no interfiere con las reacciones posteriores.
  4. Evaluación de sgRNA
    1. Digiera un plásmido de ADNc/ORF que contenga la columna vertebral del vector pLX304 utilizando una enzima de restricción. Resuelva los fragmentos de ADN resultantes a través de gel de agarosa al 0,8%. Purifique el sustrato de ADN con un kit de extracción en gel.
    2. Prepare una mezcla de reacción de escisión de Cas9 de 5 μL que contenga 0,2 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, 0,5 μL de 20 ng/μL de sgRNA, 0,015 pmol de sustrato de ADN, 0,5 μL de tampón Cas9 10x y agua ultrapura tratada con DEPC. Incubar la reacción a 37 °C durante 1 h.
    3. Resuelva los productos de escote con gel de agarosa al 0,8%. Incluya el sustrato de ADN no contaminado como control negativo.
    4. Visualice los patrones de escisión utilizando un sistema de imágenes digitales y seleccione el sgRNA con un sustrato residual mínimo para experimentos posteriores (Figura 2).

2. Intercambio del gen de resistencia a los antibióticos del vector de destino

NOTA: En este protocolo, utilizamos el ejemplo del intercambio del gen de resistencia a la ampicilina del vector de destino pBID-UASC con el gen de resistencia al cloranfenicol, generando así el vector de destino portador de cloranfenicol pBIDC-UASC.

  1. Eliminar el gen de resistencia a la ampicilina de pBID-UASC.
    NOTA: El gen de resistencia a la ampicilina de pBID-UASC se eliminó mediante la digestión de Cas9 junto con dos sgRNAs, f1Ori5-G4 (secuencia objetivo: 5'-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3') y Amp3-G2 (secuencia objetivo: 5'-GGAACGAAAACTCACGTTAA-3'), lo que dio como resultado una columna vertebral vectorial lineal de pBID-UASC de 7.687 pb. Estos dos sgRNAs se dirigen a los 5' aguas arriba y 3' aguas abajo del gen de resistencia a la ampicilina, respectivamente.
    1. Prepare una reacción de escisión de 10 μL que contenga 0,03 pmol de pBID-UASC, 0,25 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, 20 ng de f1Ori5-G4, 20 ng de Amp3-G2, 1 μL 10x Cas9 Buffer y agua ultrapura tratada con DEPC. Incubar a 37 °C durante 1 h.
      NOTA: El plásmido escindido Cas9, sin purificación, se somete directamente al ensamblaje de Gibson.
  2. PCR: amplifica el gen de resistencia al cloranfenicol.
    NOTA: Un gen de resistencia al cloranfenicol de 840 pb se amplificó a partir del plásmido pMartini-Cam6 mediante PCR utilizando el f1Ori5-Cam-F (5'-TTACAATTCACTGGCC
    GTCGGTATGTGTATGATACATAAGGTT-3') y Amp3-Cam-R (5'-AGTGGAACGAAAACTCAC
    GTAATTCTCATGTTTGACAGC-3') cebadores.
    1. Preparar el gen de resistencia al cloranfenicol mediante PCR amplificando el gen de resistencia al cloranfenicol de 840 pb. Configure una reacción de PCR de 20 μL que contenga 2 μL de pMartini-Cam (0,1 ng/μL), 1 μL de f1Ori5-Cam-F (10 μM), 1 μL de Amp3-Cam-R (10 μM), 4 μL de tampón 5x, 0,4 μL de dNTP (10 mM), 0,4 μL de ADN polimerasa de alta fidelidad (2,5 unidades/μL), 11,2 μL de agua ultrapura.
    2. Realice la PCR utilizando las siguientes condiciones de termociclado: 1 ciclo de 95 °C durante 1 min; 5 ciclos de 95 °C durante 15 s, 46 °C durante 15 s, 72 °C durante 20 s; 30 ciclos de 95 °C durante 15 s, 61 °C durante 15 s, 72 °C durante 20 s; 1 ciclo de 72 °C durante 2 min. Realizar la reacción en un termociclador.
    3. Resuelva los productos de escisión con gel de agarosa al 0,8% y purifique un fragmento de ADN de 840 pb utilizando un kit de extracción en gel.
  3. Inserte el gen de resistencia al cloranfenicol en la columna vertebral linealizada del vector pBID-UASC, lo que da como resultado pBIDC-UASC.
    1. Realice una reacción de ensamblaje de Gibson de 2 μL: 0,008 pmol de 840 pb de gen de resistencia al cloranfenicol, 0,002 pmol del pBID-UASC linealizado (paso 2.1.1), 1,0 μL de 2 veces la mezcla maestra de ensamblaje de Gibson. Realice la reacción a 50 °C durante 1 h.
    2. Transformar 10 μL de células competentes de E. coli con 1 μL de producto de reacción de ligadura. Seleccione los transformantes en una placa LB suplementada con 15 μg/mL de cloranfenicol.
    3. Elija una sola colonia y sométala a un cultivo bacteriano posterior y a una minipreparación de plásmidos. Verificar el vector de destino pBIDC-UASC portador de cloranfenicol mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN.

3. Construcción de un vector de destino compatible con CRISPRshuttle

NOTA: Un casete CRISPRshuttle comprende alrededor de secuencias de columna vertebral vectorial de 20-40 pb que flanquean los extremos 5' y 3' de los fragmentos de ADN objetivo, con uno o dos sitios de restricción únicos ubicados entre ellos.

  1. Oligonucleótidos anales utilizando un termociclador con el siguiente programa: 94 °C durante 2 min; 70 ciclos de 52 s a (95-N) °C, donde N representa el número de ciclo.
    NOTA: El casete recocido CRISPRshuttle contiene voladizos de 5' complementarios a EcoRI y XbaI.
  2. Lije el casete recocido de CRISPRshuttle en el vector de destino digerido por EcoRI/XbaI pBIDC-UASC para generar el vector de destino compatible con CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect.
    NOTA: Esta ligadura elimina los sitios EcoRI y XbaI originales dentro de los múltiples sitios de clonación, lo que hace que los sitios EcoRI y XhoI en el medio del casete CRISPRshuttle sean únicos en el vector final. Los sitios de restricción únicos en el casete CRISPRshuttle permiten la linealización del vector de destino compatible con CRISPRshuttle.
    1. Prepare una reacción de ligadura de 5 μL que contenga 14 ng de pBIDC-UASC digerido por EcoRI/XbaI de 8.451 pb, 0,02 pmol del casete CRISPRshuttle recocido, 0,5 μL de tampón de ADN ligasa T4 10x, 0,3 μL de ligasa de ADN T4. Incubar la reacción durante la noche a 16 °C.
    2. Transformar 10 μL de células competentes de E. coli con 1 μL del producto de la reacción de ligadura. Seleccione los transformantes en una placa LB suplementada con 15 μg/mL de cloranfenicol e incube durante la noche a 37 °C.
    3. Elija una sola colonia y sométala a un cultivo bacteriano posterior y a una minipreparación de plásmidos. Verifique el vector de destino pBIDC-UASC-pLXvect compatible con CRISPRshuttle mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN.

4. Generación de plásmidos UAS-cDNA/ORF mediante CRISPRshuttle

NOTA: El protocolo CRISPRshuttle implica reacciones de probeta de dos pasos que se llevan a cabo en paralelo antes de la transformación bacteriana (Figura 1).

  1. Reacción del tubo de ensayo paso 1
    1. Extirpe ORF de plásmidos pLX304-ORF mediante la escisión de la columna vertebral del vector utilizando Cas9 junto con dos sgRNAs, pLX304-CMV-G16 (secuencia objetivo: 5'-GAGCTCTCTGGCTAACTGTC-3', localizada en la red troncal vectorial pLX304 que flanquea el extremo ORF 5') y pLX304-3'-G1 (secuencia objetivo: 5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGGG-3', localizada en la red troncal vectorial pLX304 que flanquea el extremo ORF 3').
      1. Prepare una mezcla maestra para un número dado (N) de reacciones de digestión de la siguiente manera: (N+1) x 0,4 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,5 μL de 80 ng/μL pLX304-CMV-G1, (N+1) x 0,5 μL de 80 ng/μL de pLX304-3'-G1, (N+1) x 0,4 μL de 10x Tampón Cas9 y (N+1) x 1,45 μL de agua ultrapura tratada con DEPC.
      2. Mezcle bien y gire la mezcla maestra. Alícuota 3,75 μL de la mezcla maestra a cada tubo. Añada 0,75 μL de plásmido pLX304-ORF de 0,03 μM a cada tubo. Mezclar bien e incubar las reacciones a 37 °C durante 1 h.
        NOTA: Diluya cada plásmido pLX304-ORF a una concentración de 0,03 μM con agua ultrapura tratada con DEPC. Si la concentración es inferior a 0,03 μM, agregue ADN plasmídico directamente a la reacción. Los plásmidos escindidos en Cas9 no necesitan ser purificados después de las reacciones de escisión y se pueden utilizar directamente para el posterior ensamblaje de Gibson.
  2. Reacción del tubo de ensayo paso 2
    1. Inserte los ORF extirpados en el vector de destino compatible con CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect a través del ensamblaje Gibson, lo que da como resultado plásmidos UAS-cDNA/ORF.
      1. Digestión de pBIDC-UASC-pLXvect con EcoRI y XbaI. Separe el pBIDC-UASC-pLXvect linealizado mediante electroforesis en gel de agarosa y purifique con un kit de extracción en gel.
      2. Prepare una mezcla maestra para un número dado (N) de reacciones de ensamblaje de Gibson de la siguiente manera: (N+1) x 0,14 μL de pBIDC-UASC-pLXvect linealizado de 3,36 μM y (N+1) x 1,8 μL de mezcla maestra de ensamblaje de Gibson.
      3. Mezcle bien y gire la mezcla maestra. Alícuota 1,94 μL de la mezcla maestra a cada tubo. Añada 1,66 μL de plásmido escindido Cas9 a cada tubo. Mezclar bien e incubar las reacciones a 50 °C durante 1 h.
        NOTA: Mantenga la mezcla maestra y los tubos de hielo antes de la incubación a 50 °C.
  3. Transforme la E. coli con los productos de montaje de Gibson.
    NOTA: Los productos del ensamblaje de Gibson no requieren purificación antes de la transformación de E. coli .
    1. Descongele las células bacterianas competentes en hielo. Alícuota de 10 μL de células por cada tubo preenfriado de 1,5 mL.
      NOTA: Se recomiendan células bacterianas competentes con una eficiencia de transformación de al menos 1 × 108 UFC/μg de ADN pUC19.
    2. Mezcle suavemente 10 μL de células competentes con 1 μL de productos de montaje Gibson. Coloque sobre hielo durante 30 min.
    3. Choque térmico a 42 °C durante 1 minuto y luego enfríe en hielo durante 2 minutos.
    4. Añada 100 μL de medio SOC precalentado (37 °C) en cada tubo. Agitar a 250 rpm durante 1 h a 37 °C.
    5. Coloque las células en placas LB que contengan 15 μg/mL de cloranfenicol. Incubar durante la noche a 37 °C.
      NOTA: La realización de estos procedimientos a gran escala suele requerir varias horas. A menos que se indique lo contrario, mantenga tanto los reactivos como las configuraciones de reacción en hielo.
  4. Verificación de plásmidos UAS-cDNA/ORF.
    1. Inocular una sola colonia en 4,5 mL de medio LB con 15 μg/mL de cloranfenicol. Agitar a 250 rpm durante la noche a 37 °C.
    2. Aísle el ADN plasmídico utilizando un minikit de preparación de plásmidos.
    3. Prepare una reacción de digestión de restricción de 20 μL para cada plásmido que contenga 300-500 ng de ADN plasmídico, 0,3 μL de PvuII, 2 μL de tampón 10x y agua ultrapura. Realice las reacciones a 37 °C durante 1 h.
    4. Resuelva los fragmentos de ADN en gel de agarosa al 0,8%. Imagen bajo luz ultravioleta (Figura 3).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utilizamos CRISPRshuttle para construir una colección de plásmidos UAS-cDNA/ORF que cubre 1.397 genes humanos que se conservan en Drosophila7. El análisis de restricción reveló que CRISPRshuttle alcanza una eficiencia del 94,5% para el uso de vectores de destino compatibles con CRISPRshuttle que contienen dos secuencias repetitivas y del 96,1% para el uso de vectores de destino sin secuencias repetitivas7. Nuestros datos demostraron que, en general, dos investigado...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un paso crítico en el protocolo CRISPRshuttle es la preparación de vectores de destino linealizados compatibles con CRISPRshuttle. Para asegurar una digestión completa, use un exceso de enzimas de restricción para digerir los vectores, y se recomienda encarecidamente la purificación en gel de los vectores digeridos. Otro paso crucial es la digestión de plásmidos de ADNc/ORF con Cas9. Si falla la construcción del plásmido, utilice la electroforesis en gel de agarosa para comprobar si se h...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio contó con el apoyo de una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32071135) y un fondo inicial del Hospital Afiliado Nanhua de la Facultad de Medicina de Hengyang de la Universidad del Sur de China. Agradecemos al Prof. Feng Zhang por proporcionar amablemente el plásmido pX330 y al Dr. Xiaohui Cai por su asistencia técnica.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agar en polvoBase químicaKBS-001H
AgarosaSangonA600014-0100
Sistema automatizado de análisis de imágenes digitales en gelTanonTanon-2500B
CloranfenicolSangonA100230-0010
Kit de extracción de gel E.Z.N.A.OmegaD2500-02
E.Z.N.A. Mini Kit de ADN plasmídico IOmegaD6942-02
EcoRI-HFNEBR3101S
Mezcla maestra de ensamblaje GibsonNEBE2611S
Kit de síntesis de ARN rápido de alto rendimiento HiScribe T7NEBE2050
Mezcla maestra de ensamblaje de ADN de alta fidelidad NEBuilderNEBE2621X
Termociclador de PCRGen largoT20
ADN polimerasa Platinum SuperFi IIThermo Scientific12361010
PvuII-HFNEBR3151L
Q5 Hot Start Mezcla maestra de alta fidelidad 2xNEBM0494
S. pyogenes Cas9GenScriptZ03386
Incubadora de agitaciónZhichuZQLY-180V
EspectrofotómetroShimadzuBioSpec-nano
ADN ligasa T4PromegaM1801
Trans 10 Célula químicamente competenteTransGenCD101-02
TriptonaOxoideLP0042
XbaINEBR0145S
Extracto de levaduraOxoideLP0021

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  2. Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).
  3. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  4. Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes. Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).
  5. Marsischky, G., Labaer, J. Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods. Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).
  6. Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  7. Liu, X., et al. CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).
  8. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).
  9. Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila. PLoS One. 7 (7), e42102(2012).
  10. Christie, K. A., et al. Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests. Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).
  11. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  12. Lei, C., et al. The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro. Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).

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