Artículo de método

In vivo Biotinilación de proximidad para estudios de interacción de proteínas en Paramecium tetraurelia

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DOI:

10.3791/68504

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12 de septiembre de 2025

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1Institute of Cell Biology, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

En este artículo

Resumen

El protocolo presenta un método para la unión covalente in vivo de biotina a proteínas basado en su proximidad a una biotina ligasa fusionada con una proteína de interés. Esta modificación permite un enriquecimiento selectivo de las proteínas utilizando perlas de estreptavidina según sea necesario en los estudios de interacción de proteínas.

Resumen

Paramecium es un importante organismo modelo para el estudio de los mecanismos moleculares involucrados en los reordenamientos genómicos programados y la eliminación de transposones durante la reproducción meiótica. Muchos detalles de este proceso siguen siendo enigmáticos debido a la complejidad de la maquinaria molecular involucrada y las interacciones transitorias proteína-proteína. Aquí, presentamos un método para el etiquetado resuelto en el tiempo de proteínas con biotina ubicada cerca de una proteína diana de interés. El método se puede adaptar fácilmente a diferentes objetivos, ya que la biotinilación se logra mediante la inyección de un ADN que codifica una proteína diana fusionada con una biotina ligasa modificada. La construcción de fusión se expresa a partir del promotor del gen endógeno, lo que permite un perfil de expresión específico de la etapa similar al de la proteína nativa. En particular, la fracción de biotina unida covalentemente permite el enriquecimiento selectivo de las proteínas marcadas utilizando perlas recubiertas de estreptavidina. Además, con la tinción de inmunofluorescencia, mostramos que el etiquetado eficiente requiere la suplementación del cultivo con biotina. El vector de expresión de ingeniería plug-and-play, combinado con el eficiente procedimiento de inyección que se demuestra aquí, permite la rápida generación de líneas de Paramecium que expresan una proteína modificada. El procedimiento de biotinilación que se muestra aquí puede seguirse con espectrometría de masas para la identificación de las proteínas enriquecidas que contienen los socios que interactúan con la proteína diana. La biotinilación de proximidad tiene el potencial de simplificar y acelerar el descubrimiento de interacciones proteína-proteína en Paramecium y aumentar los esfuerzos para comprender su maquinaria de edición del genoma.

Introducción

El organismo unicelular ciliado Paramecium tetraurelia alberga dos tipos distintos de núcleos: un núcleo de línea germinal para el almacenamiento a largo plazo de información genética y un núcleo somático para las funciones fisiológicas de la célula1. La reproducción sexual en este organismo requiere la formación de un nuevo genoma somático. Este proceso incluye la escisión irreversible de más de 45.000 fragmentos de ADN del genoma somático2 que incluyen elementos transponibles3 y otras repeticiones. Particularmente sorprendente es que los eventos de escisión se ejecutan con una precisión de hasta el par de basesúnicas 1. Esta precisión es biológicamente necesaria, ya que los fragmentos de ADN extirpados interrumpen las regiones codificantes de proteínas4 y cualquier escisión defectuosa podría evocar mutaciones de cambio de marco, codones de parada prematuros o alterar la secuencia codificante de proteínas. Un intrincado mecanismo de comparación de ARN permite a la célula diferenciar las secuencias que se necesitan en el nuevo genoma somático. Se inicia con la transcripción de todo el genoma de la línea germinal5, seguido de un recorte a un tamaño de 25 pb6, transporte al antiguo genoma somático7, donde se descartan todos los ARN complementarios8. Los ARNs restantes que carecen de secuencias complementarias en el genoma somático antiguo se transportan al nuevo genoma somático en desarrollo, donde se alinean con cualquier secuencia limitada por la línea germinal y dirigen su escisión9. Este complejo proceso de varios pasos requiere una interacción precisa y oportuna de muchos componentes celulares y, en particular, interacciones débiles transitorias a medida que los pequeños ARN transitan entre los diferentes núcleos10,11. Anteriormente, se intentaron comprender la mecánica molecular del proceso utilizando experimentos de derribo para determinar si los componentes putativos son esenciales para el proceso, seguidos de enfoques de inmunoprecipitación para descubrir las interacciones de las proteínas esenciales 12,13,14. Si bien este método es útil para la detección de uniones fuertes y continuas que también soportan las condiciones no fisiológicas durante el pulldown, la detección de interacciones débiles y transitorias puede requerir una optimización tediosa. Debido a la naturaleza potencialmente transitoria de muchas interacciones involucradas en el proceso de edición del genoma, los métodos in vivo podrían mejorar la detección de tales interacciones. Además, algunas proteínas no pueden ser solubilizadas eficientemente en condiciones extracelulares15, lo que representa un problema que puede resolverse mediante modificaciones proteicas basadas en la interacción in vivo, como el etiquetado de proximidad con biotina.

Aquí, describimos un nuevo método que permite una biotinilación in vivo específica de proteínas que se localizan cerca de la proteína diana deseada. La modificación covalente de la biotina se puede utilizar para un enriquecimiento eficiente utilizando enfoques pulldown basados en estreptavidina. El desarrollo de este método se logró mediante el uso de la biotina ligasa TurboID16 para realizar los estudios de interacción de proteínas en Paramecium tetraurelia. Nuestro enfoque se puede aplicar fácilmente a cualquier proteína diana siguiendo los pasos descritos en el protocolo. Por lo tanto, este artículo proporciona una estrategia eficiente y escalable para la biotinilación de proximidad que se puede utilizar para estudios proteómicos de alto rendimiento en un organismo modelo protozoario prominente.

Protocolo

1. Métodos generales

  1. Obtenga tampones, reactivos y otros materiales como se enumeran en la Tabla 1.
  2. Cultivar líneas monoclonales de Paramecium como se describió anteriormente17. En resumen, transfiera una célula a un nuevo pocillo de portaobjetos de depresión que contenga medio ligero bacterizado (0,8 μg/ml β-sitosterol) para que la densidad celular permanezca por debajo de 500 células/ml, para evitar el inicio prematuro del ciclo meiótico. A las 50 divisiones celulares, transferir las células a un cultivo de medio rico en bacterias (con 0,8 μg/mL de β-sitosterol) y dejar hasta que se consuman todas las bacterias, induciendo así la reproducción sexual (autogamia)18.
    NOTA: Al finalizar el ciclo de reproducción sexual, las células permanecerán en un estado postautógamo sin división hasta que se proporcione una nueva fuente de nutrientes.
  3. Construya proteínas de fusión de los genes diana utilizando un vector que contenga una secuencia turboID de 3x HA optimizada para codones con sitios de corte de enzimas de restricción aguas arriba.
    1. Realice la amplificación por PCR del gen diana y su región promotora a partir del ADN genómico, utilizando cebadores diseñados con voladizos que codifican sitios de restricción adecuados.
    2. Inserte el producto mediante digestión de restricción estándar en los sitios de corte compatibles con el marco19 aguas arriba de las regiones codificantes de turboID.
  4. Secuenciar, verificar y amplificar el ADN plasmídico construido en E. coli DH5α. Aísle el plásmido con un kit midiprep de plásmidos y linealice 100 μg de ADN plasmídico mediante digestión de restricción.
  5. Purifique mediante extracción de fenol-cloroformo, luego filtre a través de un filtro centrífugo12. Realice la precipitación de etanol y disuelva el gránulo de ADN en agua para obtener una concentración de 5 mg / mL.
    NOTA: El ADN se puede introducir en los núcleos somáticos de las células de Paramecium mediante el siguiente procedimiento de microinyección.

2. Microinyección en el núcleo somático (MAC)

  1. Transfiera una célula del cultivo postautógamo obtenido en el paso 1.2 a un portaobjetos de depresión fresco con medio ligero bacterizado con 0,8 μg/ml de β-sitosterol. Incubar a 27 °C durante dos días antes de la inyección para recuperar las células.
  2. Utilice un microscopio estereoscópico para transferir las células del cultivo recuperado a un portaobjetos de depresión recién preparado lleno del medio de lavado.
  3. Mientras las células están en el medio de lavado, agregue 20 μL de ddH2O en un portaobjetos de vidrio y cubra con un cubreobjetos.
  4. Agregue 200 μL de aceite mineral sobre el cubreobjetos.
  5. Después de esto, transfiera las células lavadas individuales como gotas debajo del aceite mineral utilizando el menor volumen de líquido posible. Coloque hasta 20 burbujas que contengan una sola célula por portaobjetos y luego coloque el portaobjetos preparado en el pedestal del microscopio de inyección.
  6. Coloque la aguja de aspiración y muévala a su posición, luego encienda el brazo robótico y la máquina de inyección.
  7. Con una punta de pipeta de microcargador, agregue 2-3 μl de la solución de ADN preparada en el paso 1.5 en la aguja de inyección. Conecte la aguja al brazo robótico y muévala a su posición, luego conéctela a la válvula de presión de la máquina de inyección.
  8. Utilice el brazo robótico para colocar la aguja de inyección en una gota de agua vacía en el portaobjetos. Luego presione Limpiar para purgar el aire restante en la aguja de inyección hasta que se observe el flujo de ADN.
  9. Pase a una gota que contenga una célula, luego baje la aguja de aspiración. Retire suavemente el líquido (agua) de esta gota hasta que la célula esté inmovilizada.
  10. Levante la aguja de aspiración y baje la aguja de inyección, luego cambie a un aumento más alto.
  11. Asegúrese de que el núcleo somático (MAC) ahora sea visible como una región más oscura desprovista de vacuolas alimentarias (ver Figura 1c) en la que se debe insertar la aguja de inyección.
  12. Trate de penetrar completamente el MAC con la aguja de inyección y retraiga lentamente la aguja durante varios segundos.
    NOTA: Cuando la aguja está ubicada dentro del MAC, el ADN fluirá en el MAC debido a la presión de aire constante aplicada por la máquina de inyección. Una vacuola difusa que consiste en el ADN inyectado podría hacerse visible dentro de los límites del MAC.
    NOTA: Es posible inyectar la misma célula varias veces para garantizar una inyección exitosa.
  13. Una vez completada la inyección celular, baje la aguja de aspiración que contiene el agua aspirada en el paso 2.9. Invierta el flujo para devolver suficiente agua a la gota hasta que la celda comience a moverse nuevamente.
  14. Continúe hasta que se hayan procesado todas las gotas que contienen una celda.
  15. Recupere cada célula inyectada recogiendo las gotas del portaobjetos y transfiriendo cada una de ellas a un pocillo separado lleno de medio ligero bacterizado, con 0,8 μg/ml de β-sitosterol.
  16. Incubar a 27 °C durante la noche, transferir una sola célula de cada pocillo a un pocillo nuevo y mantener el pocillo original a 18 °C como respaldo.
  17. Cultive las células transferidas durante la noche a 27 ° C durante 1 día y luego transfiera 5 células de cada pocillo monoclonal a un tubo de PCR. Utilice cebadores específicos de la construcción para la amplificación para verificar la presencia del ADN inyectado en las células.

3. Tinción de inmunofluorescencia para la verificación de la localización correcta de proteínas y la función de la biotina ligasa

  1. Cultive los clones seleccionados positivos para PCR en 20 ml de medio bacterizado con 0,8 μg/ml de β-sitosterol.
  2. Después de que el medio se vuelva menos turbio, recoja una muestra de 50 μL del cultivo. Agregue 1 μL de solución DAPI (0,1 mg/mL) y 1 μL de EDTA (0,5 mM) para la tinción de ADN para verificar el inicio de la autogamia.
    NOTA: La autogamia generalmente comienza con una densidad celular de 2,000 células / ml.
  3. Si se desea biotinilación, suplementar el medio de cultivo con biotina hasta una concentración final de 500 μM durante al menos 1 h antes de cosechar las células.
  4. Cosechar las células en la etapa de desarrollo adecuada utilizando una centrífuga de medición de aceite equipada con tubos en forma de pera a 280 x g durante 2 min. Deseche el medio de cultivo y agregue PBS a los tubos, luego centrifugue nuevamente y retire el PBS.
  5. Vuelva a suspender el sedimento celular en PBS y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga transparente de 1,5 ml.
  6. Prepare una dilución de PFA al 3,7% en PBS a partir de la solución madre al 37%.
  7. Vuelva a suspender el sedimento celular en 0,5 ml de PFA al 3,7% e incube durante 30 min a temperatura ambiente en un rotador de tubos.
  8. Centrifugar a 600 x g durante 1 min hasta que se forme un pellet visible. Deseche la solución de PFA en el contenedor de residuos especiales designado.
  9. Vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de glicina 50 mM en PBS. Incubar durante 5-10 min en un rotador de tubos.
  10. Centrifugar a 600 x g durante 1 min. Retire el sobrenadante y agregue 0,8 ml de 1x PBS. Opcionalmente, lavar una vez más con PBS.
    NOTA: En este punto, las células se pueden almacenar a 4 °C, si es necesario.
  11. Centrifugar a 600 x g durante 1 min, retirar el PBS y añadir 500 μL de Triton X-100 al 0,5 % en PBS. Incubar durante 20 min en un rotador de tubos.
  12. Centrifugar hasta que el pellet sea visible (1.000 x g durante 2 min), retirar la solución de Triton X-100 y volver a suspender las células en PBS.
  13. Preparar una solución de BSA al 5% en PBS de acuerdo con el volumen de anticuerpos requerido.
  14. Retire el lavado de PBS de las células y agregue 100 μL del anticuerpo primario diluido en BSA al 5% en PBS a las células. Ajuste el tiempo de incubación según el anticuerpo utilizado.
    NOTA: La incubación durante 2 h a temperatura ambiente es suficiente para la mayoría de los anticuerpos.
  15. Centrifugar a 600 x g, eliminar la dilución primaria de anticuerpos y lavar las células con 500 μL de PBS.
  16. Añadir 100 μL del anticuerpo secundario diluido en BSA al 5% en PBS. Ajuste el tiempo de incubación; Generalmente, 1 h a temperatura ambiente es suficiente. Cubra el tubo con papel de aluminio para proteger el fluoróforo de la luz.
  17. Añadir 1 μL de solución DAPI (0,1 mg/mL) durante los últimos 10 min de incubación con el anticuerpo secundario.
  18. Centrifugar a 600 x g durante 1 min, retirar la solución de tinción y lavar dos veces con PBS. Deje 20 μL del segundo lavado en el tubo y vuelva a suspender las células.
  19. Monte 10 μL en un portaobjetos para su inspección bajo un microscopio.

4. Enriquecimiento selectivo de proteínas biotiniladas

  1. Coseche 1 x 106 células en la etapa de desarrollo correcta como se describe en 3.4.
  2. Vuelva a suspender el sedimento en 3 ml de tampón de lisis.
  3. Transfiera a un homogeneizador de gotas y lisar las células con 100 golpes de mortero.
  4. Transfiera el lisado a dos tubos de microcentrífuga y centrifugue a 21.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  5. Equilibre las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina mezclando 20 μL (por muestra) de suspensión de perlas resuspendidas de vórtice de pulso con 1 ml del tampón de lisis en un tubo de microcentrífuga e incubando durante 2 min.
  6. Retire el tampón de lisis de las perlas con un soporte magnético y vuelva a suspender en el tampón de lisis.
  7. Repita el paso 4.6.
  8. Retire el tampón de lisis y mezcle las perlas equilibradas con el sobrenadante (lisado clarificado) del paso 4.4.
    NOTA: Las concentraciones óptimas de sal y el porcentaje de detergentes para unirse a las perlas pueden diferir y deben validarse experimentalmente. Además, es posible incubar el pellet a partir de 4,4 en 50 μL de SDS al 2% durante 10 min a 60 °C para extraer proteínas de la fracción insoluble, seguido de centrifugación a 21.000 x g durante 10 min. Agregue este extracto al lisado clarificado y las perlas.
  9. Incubar durante 1-2 h a temperatura ambiente en un rotador de tubos.
  10. Centrifugar brevemente (<1s) el tubo para recuperar todo el líquido en el fondo del tubo, recoger las perlas en un soporte magnético y luego reemplazar el sobrenadante (flujo continuo) con el tampón de lavado 1.
  11. Incube durante 5 minutos en un rotador de tubos y luego repita como en el paso 4.10 para un segundo lavado.
  12. Cambie el tampón de lavado 1 por el tampón de lavado 2 por dos lavados adicionales (lavado 3 y 4).
  13. Cambie el tampón de lavado 2 por el tampón de lavado 3 para dos lavados finales (lavado 5 y 6).
  14. Después de retirar el lavado final, almacene las perlas a -20 °C antes del procesamiento posterior.
    NOTA: Las perlas se pueden eluir con tampón Laemmli para el análisis de western blot y enviar a los servicios de espectrometría de masas para una preparación peptídica en perlas para la identificación de proteínas.

Resultados

Nuestro protocolo describe un método simplificado para la introducción de una modificación covalente de biotina en las proteínas en las proximidades de una proteína diana en Paramecium (Figura 1A). Estas proteínas biotiniladas pueden enriquecerse aún más mediante un pulldown de estreptavidina e identificarse mediante espectrometría de masas20. Para demostrar un caso de uso práctico del método, aplicamos el protocolo a la proteína Nowa1. Esta proteína es esencial para el proceso de reordenamiento genómico y tiene alteraciones dinámicas en su localización12. En las primeras etapas, permanece en el antiguo núcleo somático y fragmentos, pero luego se localiza en el nuevo núcleo en desarrollo. En particular, nuestros intentos anteriores de un enriquecimiento mediado por etiquetas de las proteínas que interactúan con Nowa1 no tuvieron éxito (resultados no publicados). Esto probablemente se debió a las repeticiones complejas que tienen similitud con la proteína priónica PrP27 que podría causar autoagregación en condiciones no óptimas durante el procedimiento de pulldown21. La PCR amplificó la región codificante de Nowa1 junto con su región no codificante aguas arriba que contiene el promotor. Luego, el producto se insertó en un marco con una secuencia de codificación turboID optimizada para codones (Figura 1B). Para evitar el silenciamiento inducido por transgenes causado por la inyección de ADN circular en Paramecium, el vector se linealizó antes de la inyección. Luego, el ADN linealizado y purificado se microinyectó en el núcleo somático (MAC) como se describe en este protocolo. Una gota dispersa confinada dentro de la región más oscura del núcleo somático se hizo visible en algunas de las inyecciones exitosas (Figura 1C). La inyección exitosa y la amplificación del ADN por parte de las células durante la división celular se verificaron mediante PCR. Como se esperaba, el 40-50% de las células fueron positivas para el ADN inyectado de la construcción Nowa1 (tamaño esperado del producto 685 pb) (Figura 2). El siguiente paso fue verificar la presencia de la proteína codificada por el ADN inyectado. Dado que el vector receptor contiene la secuencia turboID flanqueada por una etiqueta triple de HA, utilizamos tinción de inmunofluorescencia para detectar la etiqueta. Esto nos permitió verificar si las células inyectadas están expresando la proteína de fusión y si estaba localizada correctamente. Utilizamos células en etapa tardía que mostraron la localización de la proteína de fusión en los dos nuevos núcleos en desarrollo, como se observó anteriormente para la proteína Nowa1 de tipo salvaje12. Las líneas celulares inyectadas individuales mostraron diferentes niveles de la proteína de fusión (Figura 3). Un nivel de expresión más bajo puede ser beneficioso para aplicaciones en las que es deseable un fondo reducido, pero en este caso, optamos por la señal máxima y procedimos con el clon 2, que mostró la expresión más alta. Luego recolectamos muestras durante diferentes etapas de desarrollo para rastrear la localización de la proteína de fusión. La proteína se localizó inicialmente en las madejas formadas a partir del antiguo núcleo somático y en los fragmentos nucleares separados durante las primeras etapas de la autogamia. Tras la aparición del anlagén nuclear, la proteína de fusión hizo la transición hacia estos nuevos núcleos en desarrollo (Figura 4). Para fomentar la biotinilación del proteoma proximal en las diferentes etapas, complementamos el cultivo con biotina de 500 μM durante 2 h antes de cosechar las células para IF. Visualizamos las proteínas marcadas con biotina a través de una tinción IF utilizando una estreptavidina marcada con fluorescencia. La señal observada correspondió a la localización de la proteína de fusión marcada con HA. Es importante destacar que fue posible obtener una localización de biotinilación específica para las diferentes etapas de desarrollo nuclear, ya que incluso una incubación corta con biotina es suficiente para lograr una biotinilación significativa (Figura 4). Además, sin la adición de biotina suplementaria, solo se detectó una biotinilación insignificante en las células inyectadas. En las células de tipo salvaje, la adición de biotina suplementaria no causó biotinilación detectable (Figura 5A). En particular, la biotina no se acumulaba simplemente en el núcleo en desarrollo, ya que incluso en condiciones de desnaturalización, permanece unida a las proteínas. (Figura 5B). Utilizando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina, fue posible enriquecer selectivamente las proteínas biotiniladas (Figura 6). Las proteínas enriquecidas se pueden identificar mediante espectrometría de masas. En estos experimentos posteriores de identificación de proteínas, el cultivo no suplementado, así como las células que expresan una proteína turboID no fusionada, se pueden utilizar como grupos de control de fondo.

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Figura 1: Descripción general del procedimiento para la biotinilación por proximidad en P. tetraurelia. (A) Esquema generalizado del protocolo. (B) Principio de clonación para el vector receptor turboID plug-and-play y la construcción resultante para la proteína de fusión Nowa1. La región 3'UTR utilizada en este plásmido se deriva de CenH3a. (C) Gota difusa visible contenida dentro del área más oscura correspondiente al núcleo somático (MAC) tras una inyección exitosa de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Prueba de PCR para inyección exitosa. Análisis en gel de agarosa de la reacción de PCR para un producto con un cebador directo específico para la región aguas arriba que codifica la resistencia a la ampicilina (amperios de inicio) y un cebador inverso complementario a Nowa1. La punta de flecha muestra el tamaño esperado del producto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Tinción de inmunofluorescencia para validar la localización correcta de la proteína de fusión turboID. Tinción de inmunofluorescencia utilizando anticuerpo primario anti-HA de conejo (1:100) y anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 568 anti-conejo de cabra (1:1000) de líneas monoclonales de Paramecium con una señal de PCR positiva para el ADN que codifica una proteína de fusión Nowa1-HA-turboID. Escala 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Biotinilación específica de Nowa1 en diferentes etapas de desarrollo. Tinción de inmunofluorescencia de la línea monoclonal 2 en etapas progresivas durante la formación del nuevo núcleo somático. El medio de cultivo se complementó con 500 μM de biotina para una actividad óptima de turboID. Se detectó la etiqueta HA como en la Figura 3 y la biotina se detectó con Streptavidin-FITC (1:200). Escala 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: El marcado de proximidad eficiente por turboID requiere biotina suplementaria en el cultivo. (A) Tinción de inmunofluorescencia de wt y células inyectadas en la etapa tardía de desarrollo que muestra la expresión de Nowa1-HA-turboID y la biotinilación observada con biotina suplementaria de 500 μM. Se detectaron la etiqueta HA y la biotina como en la Figura 4. Escala 20 μm. (B) Análisis de Western blot para biotina utilizando HRP-estreptavidina de células wt cultivadas con biotina de 500 μM y células inyectadas con turboID con y sin biotina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Enriquecimiento de proteínas biotiniladas con perlas magnéticas de estreptavidina. Análisis de Western blot para biotina de muestras de un experimento pulldown utilizando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Las muestras son: Lisado celular Nowa1-HA-turboID (entrada), la fracción no unida (flujo), los pasos de lavado (lavado 1-6) y las proteínas unidas a las perlas (salida). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo presentado aquí describe una técnica para unir una fracción de biotina a las proteínas en las proximidades de la proteína de interés. Basado en la fuerte afinidad de la estreptavidina por la biotina, esto permite un enriquecimiento rápido y eficiente de las proteínas modificadas. Combinado con la rápida adaptabilidad para diferentes proteínas de interés, el método presentado puede facilitar los estudios de interacciones multiproteicas en Paramecium. Este organismo modelo está bien establecido para la investigación sobre las interacciones transposón-huésped durante la reproducción meiótica3. Además, podría ofrecer nuevas herramientas moleculares para la edición precisa del genoma, ya que elimina más de 45.000 secuencias durante sus reordenamientos genómicos programados. El proceso está orquestado por una compleja maquinaria multicomponente que permite una escisión precisa dirigida por ARN de estos fragmentos de ADN con un sitio de escisión reproducible en cada generación. El método presentado aquí ofrece dos ventajas principales para estudiar este proceso. Simplifica el descubrimiento de interacciones transitorias proteína-proteína. Además, el vector receptor plug-and-play permite la creación rápida de muchas proteínas de fusión funcionales. Dado que es probable que múltiples factores estén involucrados en el proceso en diferentes etapas, la adaptabilidad permite descubrir los interactomas de muchas proteínas que podrían ser parte de la maquinaria de escisión. Es importante destacar que las construcciones de fusión se expresan a partir del promotor del gen endógeno y, por lo tanto, coinciden estrechamente con el curso temporal de la expresión nativa. Además, el uso demostrado de la microinyección para la administración de material genético exógeno a este organismo modelo permite la generación de poblaciones monoclonales homogéneas. Tales poblaciones permiten una iniciación más sincrónica del proceso de autogamia, durante el cual tiene lugar el desarrollo de un nuevo núcleo somático.

Si bien el procedimiento demostrado para introducir las construcciones de fusión turboID es robusto, podría ser necesaria una optimización específica en los protocolos de enriquecimiento de proteínas posteriores, debido al mecanismo de biotinilación. Dado que la enzima turboID fusionada genera restos reactivos de biotina-AMP que se difunden lejos de la enzima, estos pueden reaccionar potencialmente con cualquier resto nucleofílico en las cercanías. Por lo tanto, un paso esencial en esta metodología es la identificación de los verdaderos socios de interacción a partir de los golpes de fondo y de las proteínas localizadas en la vecindad general de la proteína de fusión turboID, que no son los socios de interacción reales. Para lograrlo, se puede ajustar una variación de parámetros, como la duración de la incubación con biotina16. Además, una configuración experimental que incluya un grupo de control sin biotina suplementaria en el medio podría indicar la unión de fondo. Como se ha demostrado, dicho grupo de control será genéticamente idéntico al experimento real, pero la biotinilación por turboID se reduce considerablemente debido a la baja abundancia de biotina. Otros grupos de control importantes podrían incluir una proteína turboID no fusionada, así como un grupo de tipo salvaje, ambos cultivados en el medio suplementado con biotina. Además, aunque la fuerte afinidad de la estreptavidina por la biotina es una ventaja significativa sobre las reducciones basadas en anticuerpos, es probable que las diferentes concentraciones de sal y detergente influyan en la pureza y eficiencia del enriquecimiento.

Los enfoques proteómicos superiores podrían mejorar nuestra comprensión de las maquinarias moleculares únicas de Paramecium y, potencialmente, de otros ciliados. Los componentes moleculares con funciones novedosas prometen ser reutilizados como herramientas en biología sintética y, por lo tanto, podrían fomentar los desarrollos biotecnológicos22,23. Las proteínas sintéticas diseñadas a menudo consisten en combinaciones de dominios funcionales con propiedades novedosas que permiten aplicaciones terapéuticas previamente impracticables. Las proteínas modificadas también pueden utilizarse en los procesos de producción farmacéutica24. El sistema de escisión del genoma dirigido por ARN de Paramecium es de particular interés para tales desarrollos. Este sistema logra la escisión dependiente de ARN de miles de fragmentos de ADN, con una precisión de hasta el nucleótidoúnico 25. Tales parámetros hacen que sea interesante mejorar la precisión de la edición del genoma en células humanas. El método de biotinilación de proximidad presentado se puede utilizar para acelerar y fomentar el descubrimiento de nuevos componentes proteicos y sus interacciones dentro de máquinas moleculares multiproteicas.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por una subvención DigiK de la Universidad de Berna y una subvención de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia 229074 otorgada a B.-A.S. y la subvención de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia 214853 otorgada a M.N.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio Axiovert 40 CFL (lentes 10x, 40x)ZeissNa
B-sitosterolSigma Aldrich567152
albúmina sérica bovina (BSA)Sigma AldrichReferencia A9647
Aceite CellTramEpendorfNa
Secuencia de ADN 3xHA-turboID optimizada para codonesTwist biocienciaNaGCTAGCTATCCATAcGAaGTTC
CTGATTATGCTTATCCTTACGAT
GTTCCTTATATGCTTATCCTTAT
GATGTACCTGATTACGCTGGATC
AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA
ATTAATCGCTTTATTAGCTAATGG
TGAATTTCATTCTGGTGAACAACAC
TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA
AGAGCTGCTATTAATAAACACATT
CAAACTTTAAGAGATTGGGGTGT
TGATGTTTTTACTGTCCCTGGTAA
AGGATATTCACTTCCTGAACCCAT
TCCTTTATTAAATGCTAAACAAAT
TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT
CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTTGTT
GACTCAACTAATCAATATTTATTAG
ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG
GTGATGCTTGTATTGCTGAATACC
AACAAGCTGGTAGAGGTTCAAGA
GGTAGAAAATGGTTTTCTCTCTTTTTTTTTTT
GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT
TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG
CAGCTATTGGATTAGGTCCTGTCAT
TGGTATTGTTATGGCTGAAGCTCT
TAGAAAATTAGGTGCTGATAAGGT
TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTA< br/> TATCTTCAAGATAGAAAAACTTGCT
GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT
ATTACTGGTGATGCCGCTCAAATT
GTTATCGGTGCTGGTATTAATGTTG
CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG
TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT
TCAAGAAGCTGGTATAAATCTTGAT
AGAAACACTTTAGCTGCTCTCTCA
TTAGAGAACTTAGAGCTGCTTTAGA
ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCT
CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAT
TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA
AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT
TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC
AAGGAGCTCTTTTATTAGAACAAGATG
GTGTTATCAAACCATGGATGGGTGGT
GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAA
GAAATGA
DAPISigma AldrichD9542
EDTAFischer ScientificAAA151610B
Puntas de microcargador epT.I.P.S.Ependorf5242956003
EtanolGrogg Chemie1009832500
FemtoJet 4iEpendorfNa
Femtotip IICalibre Científico5242957000
Solución de formaldehídoSigma AldrichF8775
GlicinaAplicación química10021259
Anticuerpo IgG anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 568Thermo Fischer ScientificA-11011
Etiqueta HA (C29F4) mAB de conejoSistemas celulares3724
InjectMan NI 2EpendorfNa
medio ligeroNaNa0,2x solución de polvo de hierba de trigo en 2,5 mM Na2HPO4
Aceite mineralSigma AldrichM8691
Na2HPO4Sigma Aldrich71643
Fenol-cloroformo-isoamilacolSigma Aldrich77617
solución salina tamponada con fósforo Fischer Scientific10722497
Kit de plásmido más midiprepQiagene12945
medio ricoNaNa1x solución de polvo de hierba de trigo en 2,5 mM de Na2HPO4
Estreptavidina-FITCThermo Fisher Scientific11-4317-87
Filtro centrífugo Ultrafree-MC GV EMD MiliporeUFC30GV00
Solución de lavadoNaNa0,1% BSA en Volvic water 
solución de polvo de hierba de trigoPinos internacionalesNaPreparar como un caldo 20x del polvo como se describió anteriormente (0,5 g / 10 ml)
Estreptavidina-HRPabcamAB7403
Perlas magnáticas recubiertas de estreptavidinaSigma AldrichLSKMAGT02
Tampón de lisis para pulldownNaNa50 mM Tris pH 8; 150 mM de NaCl; 0,5% de desoxicolato de sodio; 1% Triton X-100; 5 mM MgCl2; 2x inhibidor de la proteasa cOmplete (Roche);  
Lavado del tampón 1 para pulldownNaNa50 mM Tris pH 8; 150 mM de NaCl; 0,5% de desoxicolato de sodio; 1% Triton X-100; 5 mM MgCl2;
Lavado del tampón 2 para pulldownNaNa10 mM Tris pH 7,4; 150 mM de NaCl; 0,01 % NP40; 1 mM MgCl2
Lavado del tampón 3 para pulldownNaNa10 mM Tris pH 7,4; 150 mM de NaCl;

Referencias

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