Generación de genomas bacterianos completos a partir de muestras clínicas mediante un flujo de trabajo de enriquecimiento de objetivos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para permitir la secuenciación del genoma completo de infecciones bacterianas de transmisión sexual a partir de muestras clínicas mediante el enriquecimiento de objetivos. Este novedoso método basado en paneles sindrómicos supera los desafíos del abundante ADN humano y las bajas cargas bacterianas, facilitando la vigilancia genómica de Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum y Mycoplasma genitalium.

Resumen

Obtener genomas completos de infecciones bacterianas de transmisión sexual (ITS) directamente a partir de muestras clínicas es un desafío debido a la presencia de ADN humano, microbiota y cargas de patógenos bacterianos muy bajas. El cultivo a menudo no es una opción, ya que estas especies son exigentes y la mayoría de las muestras se toman en medios de transporte que lisan los microorganismos, lo que los hace inviables para el cultivo. Para abordar estos problemas, utilizamos un panel de sondas diseñado en cuatro especies para generar secuencias del genoma completo de ITS bacterianas y realizamos el enriquecimiento objetivo, un procedimiento de hibridación de dos a tres días antes de la secuenciación del genoma. Nuestros resultados iniciales produjeron excelentes datos genómicos utilizando muestras para las cuales la secuenciación directa no fue exitosa. El enriquecimiento de objetivos demostró ser altamente efectivo para secuenciar genomas bacterianos de ITS, particularmente cuando la carga de patógenos era alta (Ct < 30). Las muestras analizadas que contenían Mycoplasma genitalium con frecuencia tenían valores de Ct superiores a 30, lo que conducía a menores tasas de éxito en la recuperación del genoma; se han observado mejoras después de optimizar la temperatura de hibridación de 65 °C a 62,5 °C. Además de permitir la vigilancia genómica, la disponibilidad de genomas completos puede proporcionar información valiosa sobre la resistencia a los antimicrobianos, como la identificación de los determinantes de resistencia adquiridos asociados con Neisseria gonorrhoeae. Este método ya ha llevado a la identificación de un nuevo linaje de Chlamydia trachomatis linfogranuloma venereum en Buenos Aires, ompA-genotipo L4, destacando el potencial de este enfoque para descubrir una nueva diversidad genómica y mejorar la vigilancia de las ITS.

Introducción

El advenimiento de las técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS) ha facilitado la secuenciación del genoma completo bacteriano (WGS), lo que permite la secuenciación de aislamientos clínicos dentro de muchas especies de patógenos bacterianos humanos. La tecnología ha permitido numerosos estudios comparativos a través de la generación de genomas completos a una escala sin precedentes. Esto ha tenido un gran impacto en la microbiología clínica y de salud pública, ya que el acceso a los datos del genoma de las muestras clínicas a través de WGS permite la tipificación y la detección de genes de resistencia a los antimicrobianos. Además, los enfoques metagenómicos permiten la detección directa de patógenos asociados a enfermedades a partir de muestras clínicas. Dicha información crea nuevas oportunidades para estrategias de tratamiento personalizadas para los pacientes. Además, WGS es una herramienta poderosa que proporciona información sobre la evolución de las cepas circulantes de un patógeno específico, así como sus patrones de transmisión, lo que permite a las autoridades de salud pública comprender y responder mejor a los brotes de patógenos ^1,2,3.

Para lograr una calidad de secuenciación suficiente para WGS, generalmente se necesita aislamiento bacteriano mediante cultivo para obtener las cantidades de ADN microbiano requeridas ^4,5,6. Esto representa un factor limitante para aquellos organismos que son difíciles de cultivar, aquellos que no pueden cultivarse debido a un procesamiento de muestras de diagnóstico no viable o aquellos expuestos a antibióticos durante el tratamiento del paciente. Ejemplos de estos microorganismos difíciles de cultivar incluyen patógenos bacterianos de transmisión sexual, como Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum y Mycoplasma genitalium ^7,8,9. Estas especies son difíciles de cultivar debido a varios factores, incluida su naturaleza intracelular, fragilidad, requisitos de crecimiento exigentes y tasas de replicación lentas. Por estas razones, el desarrollo e implementación de técnicas que permitan WGS a pesar del bajo contenido de ADN, como suele ser el caso en muestras de pacientes, es crucial para realizar análisis genómicos en entornos clínicos.

El enriquecimiento de dianas es el método más prometedor para la secuenciación del genoma cuando el ADN microbiano es escaso¹⁰. Por ejemplo, en el contexto de los patógenos que causan infecciones de transmisión sexual (ITS), solo una pequeña fracción del ADN presente en una muestra de paciente se origina en el patógeno. En el caso de las infecciones por C. trachomatis, se ha encontrado que el ADN del patógeno comprende hasta un máximo del 0,6% del ADN total, pero los valores suelen ser mucho más bajos¹¹. El método de enriquecimiento objetivo consiste en capturar selectivamente el ADN microbiano de interés antes de NGS. Esto se logra utilizando sondas de ARN marcadas con biotina diseñadas específicamente que son complementarias al ADN microbiano objetivo. La ligadura del adaptador se realiza para generar una biblioteca genómica, antes de la hibridación, durante la cual estas sondas se unen al ADN microbiano complementario. Posteriormente, se utilizan perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina para capturar los complejos de ácidos nucleicos marcados con biotina, explotando la fuerte interacción biotina-estreptavidina. Finalmente, una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica los fragmentos de ADN seleccionados. Estos pasos conceptuales clave son necesarios para comprender la estrategia de enriquecimiento de objetivos. Sin embargo, los pasos de procedimiento adicionales, como el lavado y el control de calidad, también están involucrados en el protocolo completo^10,12.

Antes de iniciar el protocolo de secuenciación, es importante evaluar la cantidad de ADN de entrada y asegurarse de que las condiciones a lo largo del flujo de trabajo preserven su integridad. De acuerdo con las recomendaciones del fabricante, el protocolo estándar requiere 10-200 ng de ADN en un volumen de 7 μL, lo que corresponde a un rango de concentración de aproximadamente 1,4 a 28,6 ng/μL. Cuando la concentración de ADN es menor, se recomienda una versión modificada del protocolo utilizando 17 μL, lo que permite concentraciones entre 0,6 y 11,8 ng/μL manteniendo la cantidad de entrada requerida¹². Dadas las bajas concentraciones que a menudo se obtienen de las muestras clínicas, implementamos rutinariamente la variante del protocolo de 17 μL. El rendimiento de la hibridación y la secuenciación se asocia con la calidad del ADN, lo que subraya la importancia de las condiciones adecuadas de almacenamiento y transporte de muestras para preservar la integridad de los ácidos nucleicos. Por lo tanto, las prácticas de manejo adecuadas, como la estabilización de los medios de recolección, el procesamiento rápido, el mantenimiento de las condiciones de la cadena de frío y la minimización de los ciclos de congelación y descongelación, son medidas importantes para optimizar la calidad del ADN. Además de las concentraciones de ADN requeridas, la longitud del fragmento de ADN es un indicador de integridad. Recomendamos minimizar la degradación del ADN durante la manipulación y el almacenamiento de muestras para obtener fragmentos más largos y optimizar los resultados de la secuenciación. Esto es particularmente relevante en entornos clínicos, donde la variabilidad en los métodos de recolección, el medio y el manejo es común. Aplicamos con éxito este protocolo al ADN extraído tanto del medio 2-SP como del medio de transporte NAAT, con longitudes medias de fragmentos de hasta 1 kb, como se detalla en los resultados representativos. Finalmente, la secuenciación exitosa se definió como lograr una cobertura del genoma superior al 95% con una profundidad de lectura media superior a 10x¹⁰.

Hasta la fecha, varios grupos de investigación han aplicado con éxito el enriquecimiento objetivo a una amplia gama de microorganismos y virus, incluidos patógenos que causan ITS, norovirus, virus del ganado y patógenos de plantas 10,13,14,15,16. Sin embargo, hasta ahora, el diseño de la sonda generalmente se ha restringido a patógenos individuales en lugar de un panel dirigido a genomas completos de múltiples patógenos vinculados sindrómicamente. Los objetivos ideales son organismos con genomas pequeños y conservados, que de hecho incluyen C. trachomatis, T. pallidum y M. genitalium. Si bien N. gonorrhoeae tiene un genoma más diverso y un pangenoma más grande, las sondas para cubrirlo aún se pueden racionalizar en un diseño con las otras tres bacterias. Existe cierta divergencia en %G + C entre estas bacterias y otras que pueden estar vinculadas sindrómicamente, lo que significa que es posible que sea necesario optimizar las condiciones.

El objetivo de este protocolo es obtener genomas completos directamente de muestras clínicas para permitir análisis filogenéticos y epidemiológicos. Demostramos una estrategia novedosa y efectiva utilizando un panel de sondas adaptado a C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum y M. genitalium para recuperar genomas completos utilizando ADN extraído de muestras clínicas como hisopos urogenitales y anorrectales. Este enfoque ha demostrado ser exitoso y se aplicó en la caracterización del brote de linfogranuloma venéreo (LGV) en Buenos Aires, lo que permitió la descripción de un nuevo linaje de C. trachomatis LGV^10,13.

Se describirá el procedimiento de enriquecimiento objetivo, incluido el uso de un método de captura de ADN disponible comercialmente con agrupación posterior a la captura para la secuenciación de próxima generación (NGS) empleado para obtener genomas completos directamente de muestras clínicas de pacientes diagnosticados con C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum y / o M. genitalium Infecciones. Para un éxito óptimo, se recomienda seleccionar muestras con un valor de Ct inferior a 30, ya que los valores de Ct más altos reflejan cargas de patógenos más bajas y es menos probable que produzcan genomas completos. El extracto de ADN para el método se puede obtener de muestras clínicas de varios tipos de muestras y medios de recolección. Los procedimientos de extracción de ADN se pueden realizar manualmente o con sistemas automatizados, utilizando kits diseñados para el aislamiento de ADN patógeno o viral de muestras de hisopos humanos (consulte la Tabla de materiales).

El conjunto de sondas utilizado en el procedimiento de enriquecimiento objetivo (ver Tabla de materiales) fue diseñado específicamente para capturar la diversidad genómica de C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum y M. genitalium. Se generaron sondas personalizadas utilizando múltiples genomas completos para cada especie, optimizando la cobertura de sus pangenomas conocidos¹⁰. Los criterios de diseño incluyeron una homología de secuencia mínima del 90% con las secuencias de referencia y una frecuencia de mosaico de 1x-2x para mejorar la eficiencia de captura del objetivo. Para optimizar la rentabilidad, el algoritmo utilizado en el diseño de la sonda minimizó el número de sondas mientras mantenía una representación genómica completa. El conjunto final de sondas consistió en 242.000 sondas para los diseños multiplex dirigidos a C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium y T. pallidum. Todo el protocolo de enriquecimiento objetivo se puede realizar en 2 o 3 días. Se proporcionan indicaciones claras de los puntos de parada para las opciones de flujo de trabajo de dos y tres días.

DECLARACIÓN DE ÉTICA
Este estudio propone mejoras metodológicas basadas en protocolos previamente publicados^10,13. Los procedimientos descritos involucran solo muestras anónimas y no incluyen datos del paciente; por lo tanto, no se requirió aprobación ética específica para los aspectos metodológicos. Los resultados representativos se obtuvieron de dos conjuntos de muestras previamente estudiadas: muestras argentinas recolectadas bajo el protocolo aprobado Detección de C. trachomatis en pacientes con rectitis infecciosa: prevalencia y tipificación (Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires, aprobación nº 201723), con consentimiento informado por escrito obtenido de todos los participantes; y muestras finlandesas anónimas, para las que no se requería una aprobación ética específica. Antes de enviar la base de datos de cualquier dato de secuenciación resultante, es necesario eliminar las lecturas humanas.

Protocolo

NOTA: El espacio de trabajo debe dividirse en una zona previa a la PCR (espacio de trabajo libre de amplicones) y una zona posterior a la PCR (espacio de trabajo de manipulación de amplicones) para evitar la contaminación. A menos que se indique explícitamente lo contrario, todos los pasos deben realizarse en uno de los dos espacios de trabajo controlados. Todas las mezclas maestras y las mezclas de reacción de PCR deben prepararse en el espacio de trabajo libre de amplicones, mientras que todos los pasos posteriores que involucren ADN amplificado deben realizarse en el espacio de trabajo de manejo de amplicones. Todas las cantidades en este protocolo se calculan para procesar ocho muestras.

1. Fragmentación del ADN

1. Mida la concentración de ADN de los extractos de ADN de muestras clínicas que contienen ADN patógeno objetivo (ADN) utilizando un método sensible y preciso basado en fluorescencia (ensayo de ADN bicatenario [dsDNA], utilizando 1 μL de muestra, con un rango de detección de hasta 120 ng/μL; consulte la Tabla de materiales). Este método de cuantificación se utiliza de manera consistente en todo el protocolo cada vez que se mide la concentración de ADN.
2. Diluya cada muestra de ADN a una concentración de 10 a 200 ng utilizando agua libre de nucleasas, asegurando un volumen final de 17 μL en cada tira de tubo de PCR. Para lograr resultados óptimos de secuenciación, utilice la mayor cantidad posible de ADN de entrada dentro del rango recomendado.
   NOTA: En los casos en que la concentración total de ADN esté por debajo del mínimo recomendado de 10 ng en 17 μL, se puede usar la suplementación con ADN de fondo (por ejemplo, ADN genómico humano) para cumplir con los requisitos de entrada, según lo sugerido por el fabricante. Esto puede ayudar a estabilizar la reacción de preparación de la biblioteca y mejorar el rendimiento de la secuenciación en muestras clínicas de bajo insumo.
3. Descongele el búfer de fragmentación (5x), el vórtice y colóquelo en hielo.
4. Programe el termociclador de acuerdo con la Tabla 1. Inicie el programa y haga una pausa inmediatamente.
   NOTA: La duración del paso de incubación de 37 °C puede variar según el tamaño inicial del fragmento de ADN y la longitud de lectura de NGS deseada. Para muestras de ADN de alta calidad, se recomienda un tiempo de incubación de 15 min para obtener fragmentos de 150 a 200 pb adecuados para 2 lecturas de 100x, y 10 min para obtener fragmentos de 180 a 250 pb para 2 lecturas de 150x.
5. Recupere los viales necesarios para la mezcla maestra de fragmentación del almacenamiento a -20 °C. Prepare la mezcla maestra según la Tabla 2. Selle el tubo y el vórtice a alta velocidad durante 5-10 s. Gire brevemente para eliminar las burbujas y mantener la mezcla maestra en hielo.
6. Agregue 3 μL de mezcla maestra de fragmentación a cada pocillo que contenga 17 μL de ADN de entrada. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo 20x, sellar la tira del tubo de PCR, agitar a alta velocidad durante 5-10 s y girar brevemente.
7. Coloque la tira de tubo de PCR en el termociclador (consulte la tabla de materiales) y reanude el programa ilustrado en la tabla 1 al comienzo del paso 1.
8. Una vez alcanzado el paso de retención de 4 °C, retire la tira del tubo de PCR del termociclador y agregue 30 μL de agua libre de nucleasas. Coloque la tira del tubo de PCR sobre hielo.

Tabla 1: Programa termociclador para fragmentación enzimática. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Preparación de la mezcla maestra de fragmentación Haga clic aquí para descargar esta tabla.

2. Preparación de la biblioteca

1. Preparación de la mezcla maestra de ligadura
   NOTA: La mezcla maestra de ligadura debe prepararse en este punto porque necesita 30-45 minutos para equilibrarse a temperatura ambiente.
   1. Recupere el tampón de ligadura del almacenamiento a -20 ° C y descongele en hielo. Recupere la ADN ligasa T4 del almacenamiento a -20 ° C, mezcle invirtiendo el vial y manténgala en hielo.
   2. Preparar la mezcla maestra de ligadura de acuerdo con la Tabla 3. Selle el tubo y el vórtice a alta velocidad durante 10-20 s, gire brevemente y manténgalo a temperatura ambiente durante 30-45 minutos antes de usarlo.
2. Reparación de extremos y fragmentos de cola de dA
   1. Programe el termociclador de acuerdo con la Tabla 4.
   2. Recupere el tampón de relaves de reparación final del almacenamiento a -20 °C y descongele en hielo. Una vez descongelado, vórtice a alta velocidad, gire brevemente. Recupere la mezcla de enzimas de relaves de reparación final, mezcle invirtiendo el vial y manténgalo en hielo.
   3. Prepare la mezcla maestra de reparación final / cola de dA de acuerdo con la Tabla 5 (consulte la Tabla de materiales). Mezcle sellando firmemente el tubo y el vórtice a alta velocidad durante 10-20 s, gire brevemente y manténgalo en hielo.
   4. Pipetee 20 μL de mezcla maestra de reparación de extremos/cola de dA en cada pocillo que contenga 50 μL de fragmentos de ADN (de los pasos 1.1-1.8). Selle la tira del tubo de PCR, mezcle bien en vórtice a alta velocidad durante 5-10 s. Gire brevemente la tira del tubo de PCR y colóquela en el termociclador. Reanude el programa de la Tabla 4.
3. Ligadura de adaptadores etiquetados con MBC
   1. Una vez que el programa de la Tabla 4 complete su paso final, coloque la tira del tubo de PCR en hielo. Configure el termociclador de acuerdo con los parámetros de la Tabla 6. Inicie el programa y pause inmediatamente.
   2. Agregue 25 μL de mezcla maestra de ligadura a temperatura ambiente a cada muestra preparada en el paso 2.1. Selle la tira del tubo de PCR, el vórtice durante 5-10 s y gire brevemente.
   3. Recupere la mezcla de oligonucleótidos del adaptador para bibliotecas etiquetadas con MBC (consulte la tabla de materiales) del almacenamiento a -20 °C y descongele en hielo. Una vez descongelado, agite a alta velocidad durante 5-10 s. Gire brevemente y manténgalo en hielo.
   4. Agregue 5 μL de mezcla de oligonucleótidos del adaptador para bibliotecas etiquetadas con MBC a cada muestra. Selle la tira del tubo de PCR y el vórtice a alta velocidad durante 5-10 s, gire brevemente. Coloque inmediatamente la tira de tubo de PCR en el termociclador y continúe ejecutando el programa como se especifica en la Tabla 6.
4. Limpieza de la ligadura
   1. Realice la purificación del ADN mediante perlas magnéticas. Recupere las perlas del almacenamiento a 4 °C y déjelas alcanzar la temperatura ambiente antes de usarlas.
   2. Prepare 4 ml de etanol al 70% con agua libre de nucleasas. Mantener a temperatura ambiente.
      NOTA: Se recomienda encarecidamente preparar una solución de etanol al 70% para su uso en los pasos de limpieza para garantizar un rendimiento óptimo. Para la preparación con etanol al 70%, use agua libre de nucleasas inmediatamente antes de usar.
   3. Agite bien la suspensión de perlas magnéticas hasta que la mezcla sea uniforme y el color parezca consistente.
   4. Cuando el programa de la Tabla 6 alcance el paso de retención de 4 °C, transfiera la tira del tubo de PCR del termociclador a temperatura ambiente. Agregue 80 μL de suspensión de perlas a cada pocillo. Selle la tira del tubo de PCR y el vórtice durante 5-10 s, gire brevemente.
   5. Incube las suspensiones de perlas durante 5 minutos a temperatura ambiente. Transfiera la tira del tubo de PCR a un soporte magnético (consulte la Tabla de materiales) y espere de 5 a 10 minutos hasta que la solución se aclare.
   6. Mientras mantiene la tira del tubo de PCR en el soporte magnético, retire y deseche con cuidado la solución aclarada de cada pocillo, evitando el contacto con las perlas.
   7. Con la tira de tubo de PCR en el soporte magnético, realice dos lavados con etanol al 70% de la siguiente manera: agregue 200 μL de etanol al 70% a cada muestra. Espere 1 minuto y retire el etanol al 70%. Evite tocar las perlas mientras retira la solución.
   8. Después del segundo lavado, selle la tira del tubo de PCR y gire brevemente las muestras para recolectar etanol residual. Coloque la tira de tubo de PCR en el soporte magnético durante 30 s.
   9. Retire el etanol recolectado evitando tocar las perlas. Para eliminar el etanol residual, retire la tira del tubo de PCR del soporte magnético y manténgala sin sellar (idealmente dentro de una campana) durante un máximo de 5 minutos. Asegúrese de que las cuentas estén completamente secas pero no agrietadas en apariencia; Esto reduciría la eficiencia del proceso de elución.
   10. Eluya el ADN agregando 35 μL de agua libre de nucleasas a cada pocillo de muestra. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10x-15x, selle los tubos y haga un vórtice durante 5-10 s. Confirme la ausencia de grumos visibles. En caso de que los haya, vórtice hasta que se disuelva.
   11. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 min. Coloque la tira del tubo de PCR en un soporte magnético y espere aproximadamente 5 minutos hasta que la solución desaparezca.
   12. Retire con cuidado el sobrenadante aclarado (~34 μL) de cada pocillo y transfiéralo a un pocillo correspondiente en una tira de tubo de PCR nueva. Mantenga las muestras en hielo y deseche las cuentas.
       NOTA: Para un protocolo de 3 días, esto marca el final del Día 1. Almacenar las muestras a 4 °C durante la noche.
5. Amplificación e índice dual
   NOTA: Seleccione el par de cebadores de índice apropiado para cada muestra para garantizar una identificación adecuada durante la secuenciación. Cada secuencia de índice consta de una etiqueta de 8 pb incorporada dentro de los cebadores utilizados para la amplificación de las bibliotecas de precaptura.
   1. Recupere el tampón de ADN polimerasa de alta fidelidad con dNTP (5x) del almacenamiento a -20 °C y descongele en hielo. Recupere los cebadores de secuenciación indexados seleccionados del almacenamiento a -20 °C y manténgalos en hielo.
      NOTA: Asegúrese de registrar el código de barras específico asignado a cada muestra para una identificación y trazabilidad precisas durante todo el proceso de secuenciación.
   2. Programe el termociclador de acuerdo con la Tabla 7. Inicie el programa y haga una pausa inmediatamente.
      NOTA: El fabricante recomienda realizar de 8 a 14 ciclos de PCR previa a la captura dependiendo de la calidad y cantidad de ADN de entrada. En este protocolo, se implementaron 11 ciclos siguiendo las recomendaciones del fabricante, lo que resultó en datos de secuenciación de alta calidad^10,12.
   3. Recupere la enzima de fusión de alta fidelidad para la amplificación por PCR del almacenamiento a -20 °C. Pipetee la enzima hacia arriba y hacia abajo para mezclar evitando una agitación excesiva y coloque en un vórtice el tampón de ADN polimerasa de alta fidelidad para garantizar la homogeneidad. Preparar la mezcla de reacción de PCR previa a la captura (como se describe en la Tabla 8). Agite la mezcla final y gire brevemente hacia abajo, manténgalo en hielo.
   4. Dispense 11 μL de la mezcla de reacción de PCR previa a la captura (preparada como se describe en la Tabla 8) en cada pocillo de muestra que contenga la biblioteca de ADN purificada. Agregue 5 μL del par de cebadores índice seleccionado a cada reacción. Selle la tira del tubo de PCR y el vórtice durante 5 s, y luego gire rápidamente hacia abajo.
   5. Reanude el programa del termociclador como se especifica en la Tabla 7. Una vez que la temperatura alcance los 98 °C, coloque la tira del tubo de PCR en el termociclador y cierre bien la tapa.
6. Limpieza de la biblioteca
   1. Deje que las perlas magnéticas se equilibren a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes de usarlas. Prepare 4 ml de etanol al 70% con agua libre de nucleasas. Mantener a temperatura ambiente.
   2. Agite bien la suspensión de perlas magnéticas hasta que la mezcla sea uniforme y el color parezca consistente.
   3. Cuando el programa de la Tabla 7 alcance el paso de retención de 4 °C, transfiera la tira del tubo de PCR del termociclador a temperatura ambiente. Agregue 50 μL de suspensión de perlas a cada muestra. Selle la tira del tubo de PCR y el vórtice durante 5-10 s, gire brevemente (sin granular las perlas magnéticas).
   4. Incube las suspensiones de perlas durante 5 minutos a temperatura ambiente. Transfiera la tira del tubo de PCR a un soporte magnético y espere de 5 a 10 minutos hasta que la solución se aclare.
   5. Mientras mantiene la tira del tubo de PCR en el soporte magnético, retire y deseche con cuidado la solución transparente de cada pocillo. Evite tocar las perlas mientras retira la solución.
   6. Con la tira de tubo de PCR en el soporte magnético, realice dos lavados con etanol al 70% de la siguiente manera. Agregue 200 μL de etanol al 70% a cada muestra. Espere 1 minuto y retire el etanol al 70%. Evite tocar las perlas mientras retira la solución.
   7. Después del segundo lavado, selle la tira del tubo de PCR y gírela brevemente para recolectar etanol residual. Coloque la tira de tubo de PCR en el soporte magnético durante 30 s. Retire el etanol residual evitando tocar las perlas.
   8. Para eliminar el etanol residual, retire la tira del tubo de PCR del soporte magnético y manténgala sin sellar (idealmente dentro de una campana) durante un máximo de 5 minutos. Asegúrese de que las perlas estén completamente secas pero no agrietadas, ya que esto reduciría la eficiencia del proceso de elución.
   9. Eluya el ADN de la biblioteca agregando 15 μL de agua libre de nucleasas a cada tubo de muestra. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10x-15x, selle la tira del tubo de PCR y el vórtice durante 5-10 s. Confirme la ausencia de grumos visibles. En caso de que los haya, vórtice hasta que se disuelva.
   10. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 min. Coloque la tira del tubo de PCR en un soporte magnético y espere aproximadamente 5 minutos hasta que la solución desaparezca.
   11. Retire con cuidado el sobrenadante aclarado (~15 μL) de cada pocillo y transfiéralo a un pocillo correspondiente en una tira de tubo de PCR nueva. Mantenga las muestras en hielo y deseche las cuentas.
7. Control de calidad
   1. Mida la concentración de ADN del ADN de la biblioteca purificada. Debido a la mayor sensibilidad, utilice un método basado en fluorescencia para cuantificar el ADN en 1 μL.

Tabla 3: Preparación de la mezcla maestra de ligadura. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Programa de termociclador para reparación de extremos/cola de dA. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 5: Preparación de la mezcla maestra de reparación final / dA de relaves. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 6 Programa de termociclador para ligadura. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 7: Programa de termociclador de PCR de precaptura. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 8: Preparación de la mezcla de reacción de PCR previa a la captura. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

3. Hibridación/captura de muestras

1. Bibliotecas de hibridación para sondear
   1. Programe el termociclador de acuerdo con la Tabla 9. Inicie el programa y haga una pausa inmediatamente.
      NOTA: El fabricante recomienda una temperatura de hibridación de 65 ° C. Esta temperatura se redujo a 62,5 °C, lo que resultó en mejores resultados.
   2. Recupere el tampón de hibridación del almacenamiento a -20 °C, descongele en hielo y manténgalo a temperatura ambiente hasta su uso. Recupere tanto el bloqueador de ARNasa como la mezcla de bloqueador de oligonucleótidos del almacenamiento a -20 °C y descongele en hielo. Mantenga estos viales en hielo hasta su uso.
   3. Calcule el volumen requerido para que cada muestra contenga 500-1000 ng de biblioteca de ADN, según la concentración de ADN medida en el paso 2.7. Transfiera el volumen calculado a una nueva tira de tubo de PCR y ajuste el volumen total a 12 μL con agua libre de nucleasas.
   4. Agite y gire rápidamente la mezcla de bloqueadores de oligonucleótidos. Agregue 5 μL a cada tubo de muestra. Selle la tira del tubo de PCR y transfiérala al termociclador. Reanude el programa de ciclos térmicos descrito en la Tabla 9 y ejecútelo hasta el Paso 3, donde es necesario agregar reactivos adicionales directamente a los pocillos de muestra en el termociclador.
   5. Prepare la solución de bloque de ARNasa al 25% de acuerdo con la Tabla 10. Selle el tubo y el vórtice a alta velocidad durante 10-20 s, gire brevemente y manténgalo en hielo hasta su uso.
      NOTA: Evite la exposición prolongada de soluciones que contienen sondas a temperatura ambiente. Mantener a temperatura ambiente solo durante los pasos de preparación.
   6. Recupere el vial de la sonda del almacenamiento a -80 °C y manténgalo en una rejilla de enfriamiento mientras no esté en uso. Transfiera a hielo para descongelar. Se recomienda utilizar las sondas según lo previsto, pero se pueden diluir si se prueban ^10,13.
   7. Una vez que todos los reactivos enumerados en la Tabla 11 hayan alcanzado la temperatura ambiente, combínelos para preparar la mezcla de hibridación de la sonda. Mezcle la solución en vórtice a alta velocidad durante 5 s, gire brevemente y continúe inmediatamente con el siguiente paso.
   8. Cuando el termociclador alcance el Paso 3 del programa descrito en la Tabla 9, agregue 13 μL de la mezcla de hibridación de la sonda a temperatura ambiente a cada pocillo de muestra, manteniendo los tubos en el termociclador durante todo el proceso. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo lentamente 8x-10x.
   9. Selle firmemente la tira del tubo de PCR, haga un vórtice breve y gire los tubos. Asegúrese de que no haya burbujas, luego devuelva rápidamente los tubos de tiras al termociclador. Verifique que los tubos estén sellados adecuadamente.
   10. Reanude el programa de ciclos térmicos para realizar la hibridación de las muestras de ADN de la biblioteca preparadas con las sondas. La hibridación continúa de la noche a la mañana
       NOTA: Para un protocolo de 2 días, esto marca el final del Día 1. Para un protocolo de 3 días, esto marca el final del Día 2.
2. Preparación de perlas de estreptavidina.
   1. Recupere las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina (perlas de estreptavidina) del almacenamiento a 4 °C. Agite el vial a fondo para asegurarse de que las perlas estén completamente suspendidas. La suspensión debe ser homogénea.
   2. Para cada muestra de hibridación, transfiera 50 μl de las perlas completamente resuspendidas a tubos individuales de una nueva tira de tubo de PCR.
   3. Lave las perlas de estreptavidina de la siguiente manera: agregue 200 μL de tampón de unión a cada tubo, mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Selle los tubos, haga un vórtice a alta velocidad durante 5-10 s y gire hacia abajo brevemente. Coloque la tira del tubo de PCR en un soporte magnético. Deje que la solución se aclare durante 5 minutos, luego retire con cuidado y deseche el sobrenadante. Repita los pasos 2 veces, completando un total de tres lavados.
   4. Vuelva a suspender las perlas en 200 μL de tampón de unión.
3. Captura de bibliotecas hibridadas
   1. Una vez que el programa de ciclos térmicos de hibridación indicado en la Tabla 9 haya completado su paso final, transfiera la tira del tubo de PCR a temperatura ambiente.
   2. Transfiera todo el volumen (~ 30 μL) de cada tubo a los tubos correspondientes que contienen 200 μL de perlas de estreptavidina prelavadas. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5x-8x, luego selle firmemente el tubo de tira.
   3. Coloque el tubo de tiras en un mezclador de placas de 96 pocillos y mezcle vigorosamente a 1800 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. Asegúrese de mezclar adecuadamente el líquido dentro de los pocillos.
      NOTA: Si no se dispone de un mezclador de placas de 96 pocillos o las muestras no se mezclan de manera efectiva, considere métodos alternativos como asegurar los tubos de tiras horizontalmente en la superficie superior del mezclador o usar un agitador con temperatura controlada (con la opción de calentamiento desactivada) para garantizar una agitación completa de la muestra.
   4. Durante este tiempo de incubación, prepare seis alícuotas de 200 μL de tampón de lavado a alta temperatura para cada muestra (es decir, en este caso, 6 x 8 tubos de tiras cada uno con 200 μL). Selle los tubos e incube en el termociclador mantenido a 70 °C hasta que lo necesite.
   5. Una vez completada la incubación de captura de 30 minutos, gire brevemente la tira del tubo de PCR para recoger el líquido. Coloque la tira del tubo de PCR en un soporte magnético para recoger las perlas. Espere hasta que la solución se aclare (aproximadamente 2 min), luego retire con cuidado y deseche el sobrenadante evitando tocar las perlas.
   6. Después de retirar la tira del tubo de PCR del soporte magnético, agregue 200 μL de tampón de lavado a temperatura ambiente. Pipetea hacia arriba y hacia abajo hasta que las perlas de estreptavidina estén completamente suspendidas (15x-20x).
   7. Coloque la tira del tubo de PCR en el soporte magnético y espere a que la suspensión se aclare (aproximadamente 1 min). Luego, retire y deseche el sobrenadante.
      NOTA: Para garantizar la especificidad de la captura, es crucial mantener la suspensión del cordón a 70 °C durante todo el procedimiento de lavado que se describe a continuación. Por lo tanto, verifique que el tampón de lavado a alta temperatura esté precalentado a 70 °C antes de su uso.
   8. Lave las perlas de estreptavidina 6 veces con alícuotas y precalentadas a 70 °C tampón de lavado a alta temperatura como se describe a continuación.
      1. Retire el tubo de tira de PCR que contiene las perlas del soporte magnético. Agregue 200 μL de tampón de lavado a alta temperatura precalentado a 70 °C a cada tubo que contenga las perlas. Pipetea hacia arriba y hacia abajo hasta que las cuentas estén completamente suspendidas (15x-20x). Selle con cuidado la tira del tubo de PCR, haga un vórtice a alta velocidad durante 8 s y gire rápidamente sin granular las perlas.
      2. Coloque el tubo de tiras de muestra que contiene las perlas resuspendidas en el bloque del termociclador a 70 °C durante 5 min. Transfiera el tubo de tiras del termociclador al soporte magnético a temperatura ambiente.
      3. Espere 1 minuto para que la solución se aclare. Luego, retire y deseche el sobrenadante. Repita 5 veces para un total de seis lavados.
   9. Asegúrese de que se haya eliminado por completo todo el tampón de lavado y, a continuación, añada 25 μl de agua sin nucleasas a cada tubo de muestra. Vuelva a suspender lentamente las perlas pipeteando hacia arriba y hacia abajo 8 veces, tratando de evitar la formación de burbujas.
   10. Mantenga la tira de PCR que contiene las muestras en hielo hasta que estén listas para ser utilizadas en las reacciones de PCR que se describen a continuación.
4. Bibliotecas enriquecidas con amplificación
   1. Programe el termociclador de acuerdo con la Tabla 12. Inicie el programa y haga una pausa inmediatamente.
      NOTA: El fabricante recomienda realizar de 10 a 16 ciclos de PCR posteriores a la captura según el tamaño del diseño de la sonda. En este protocolo, se implementaron 22 ciclos, lo que resultó en una recuperación exitosa del genoma del patógeno^10,12.
   2. Recupere tanto el tampón de ADN polimerasa de alta fidelidad con dNTP (5x) como la mezcla de cebadores posteriores a la captura (consulte la Tabla de materiales) del almacenamiento a -20 °C, descongele y mantenga en hielo. Vórtice a alta velocidad y gire rápidamente hacia abajo antes de usar.
   3. Recupere la enzima de fusión de alta fidelidad para la amplificación por PCR (consulte la tabla de materiales) del almacenamiento a -20 °C. Para mezclar correctamente la solución enzimática, pipetee hacia arriba y hacia abajo el líquido para evitar una agitación excesiva. A continuación, prepare la mezcla de reacción de PCR posterior a la captura combinando todos los reactivos de acuerdo con la Tabla 13. Agite la mezcla final y gire brevemente hacia abajo, manténgalo en hielo.
   4. Agregue 25 μl de la mezcla de reacción de PCR posterior a la captura a cada tubo de muestra (cada uno contiene 25 μl de ADN enriquecido con diana unido a perlas). Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar las reacciones hasta que la suspensión de perlas sea uniforme. Selle firmemente la tira del tubo de PCR. No gire la tira del tubo de PCR en esta etapa.
   5. Coloque la tira de tubo de PCR en el termociclador y reanude el programa del termociclador como se especifica en la Tabla 12. Una vez que el programa llegue a su paso final, gire brevemente la tira del tubo de PCR. Coloque la tira del tubo de PCR en el soporte magnético, espere aproximadamente 2 minutos para que la solución se aclare.
   6. Transfiera aproximadamente 50 μL de sobrenadante de cada tira de tubo de PCR al pocillo correspondiente de una nueva tira de tubo de PCR. El tubo de tira que contiene las perlas de estreptavidina se puede desechar.
5. Limpieza de bibliotecas finales
   1. Deje que las perlas magnéticas se equilibren a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes de usarlas. Prepare 4 ml de etanol al 70% con agua libre de nucleasas. Mantener a temperatura ambiente.
   2. Agite bien la suspensión de perlas magnéticas hasta que la mezcla sea uniforme y el color parezca consistente.
   3. Agregue 50 μL de suspensión de perlas a cada tubo de muestra. Selle los tubos y el vórtice durante 5-10 s, gire brevemente (sin granular las perlas magnéticas).
   4. Incube las suspensiones de perlas durante 5 minutos a temperatura ambiente. Transfiera la tira del tubo de PCR a un soporte magnético y espere de 5 a 10 minutos hasta que la solución se aclare.
   5. Mientras mantiene la tira del tubo de PCR en el soporte magnético, retire y deseche con cuidado la solución transparente de cada pocillo. Evite tocar las perlas mientras retira la solución.
      1. Con la tira de tubo de PCR en el soporte magnético, realice dos lavados con etanol al 70% de la siguiente manera: agregue 200 μL de etanol al 70% a cada muestra. Espere 1 minuto para permitir que las perlas alteradas se asienten y elimine el etanol al 70%. Evite tocar las perlas mientras retira la solución.
   6. Después del segundo lavado, selle los tubos y gire brevemente la tira del tubo de PCR para recoger el etanol residual. Coloque la tira de tubo de PCR en el soporte magnético durante 30 s.
   7. Para eliminar el etanol residual, retire la tira del tubo de PCR del soporte magnético y manténgala sin sellar (idealmente dentro de una campana) durante un máximo de 5 minutos. Asegúrese de que las perlas estén completamente secas pero no agrietadas, esto reduciría la eficiencia del proceso de elución.
   8. Eluya el ADN de la biblioteca agregando 25 μL de agua libre de nucleasas a cada tubo de muestra. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10x-15x, selle la tira del tubo de PCR y el vórtice durante 5-10 s. Confirme la ausencia de grumos visibles.
   9. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 min. Coloque la tira del tubo de PCR en un soporte magnético y espere aproximadamente 5 minutos hasta que la solución desaparezca.
   10. Retire con cuidado el sobrenadante aclarado (aproximadamente 25 μL) de cada pocillo y transfiéralo a un pocillo correspondiente en una tira de tubo de PCR nueva. Mantenga las muestras en hielo y deseche las cuentas.
6. Control de calidad
   1. Mida la concentración de ADN del ADN de la biblioteca purificada. Para lograr una mejor sensibilidad, utilice un método basado en fluorescencia para cuantificar el ADN en 1 μL.
7. Secuenciación de próxima generación
   NOTA: Dependiendo de la capacidad de la plataforma utilizada y de la cantidad de datos de secuenciación necesarios por muestra, las bibliotecas indexadas de varios lotes se pueden multiplexar en una sola ejecución de secuenciación.
   1. Antes de agrupar las muestras, ajuste la concentración de ADN de cada muestra a 5 ng/μL. Agrupe las bibliotecas en cantidades equimolares para mantener una representación equilibrada.
   2. Secuenciar las bibliotecas preparadas utilizando un sistema de secuenciación de lectura corta de alto rendimiento con, por ejemplo, una configuración de lectura de extremo emparejado de 150 pb (consulte la Tabla de materiales).

Tabla 9: Programa de termociclador para hibridación. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 10: Preparación de la solución de bloque de ARNasa. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 11: Preparación de la mezcla de hibridación de sonda. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 12: Programa de termociclador de PCR posterior a la captura. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 13: Preparación de la mezcla de reacción de PCR posterior a la captura. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Resultados

Un estudio sobre el brote de LGV de C. trachomatis en Buenos Aires, Argentina, mostró algunas características novedosas en las muestras, a saber, 10 sustituciones de nucleótidos en el gen ompA en comparación con el genotipo L1 de ompA, y una secuencia inusual de tipificación de secuencias multilocus (MLST) tipo 2 17,18,19. Nuestro objetivo era investigar los genomas de estas muestras clínicas, colocándolas en el contexto de los datos globales. Para lograr esto, comparamos el rendimiento de un enfoque de enriquecimiento objetivo con la secuenciación metagenómica directa para WGS de ITS bacterianas de muestras clínicas, en un intento de superar los desafíos planteados por las bajas cargas bacterianas y la abundancia de ADN humano y microbiano.

El ADN utilizado fue de muestras de hisopos rectales recolectadas entre 2017 y 2023 en Buenos Aires, Argentina, colocadas en medio 2-SP (medio sacarosa-fosfato) suplementado con suero fetal de ternera (FCS) al 2% y antibióticos (gentamicina 25 μg/mL, vancomicina 0,5 mg/mL y anfotericina B 2,5 μg/mL) y almacenadas a -80 °C, o uretrales, anorrectales, e hisopos faríngeos recolectados en el Hospital Universitario de Zúrich (USZ) en tampón NAAT (pruebas de amplificación de ácidos nucleicos). El ADN de las muestras de Buenos Aires se extrajo utilizando un kit de extracción manual a base de sílice, mientras que el ADN de las muestras USZ se extrajo utilizando un sistema automatizado basado en perlas magnéticas.

Todas las muestras clínicas incluidas en este estudio se confirmaron positivas mediante un ensayo de PCR en tiempo real multiplex desarrollado internamente (ver Tabla de materiales) con valores de umbral de ciclo (Ct) de qPCR que varían de la siguiente manera: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae:  24-31, T. pallidum: 27-36 y M. genitalium:  30-37. La concentración de ADN se cuantificó mediante un ensayo fluorométrico de alta sensibilidad antes de la secuenciación para caracterizar el material de entrada de las muestras clínicas (ver Tabla de materiales).

Para comparar la secuenciación metagenómica directa con el enriquecimiento objetivo, utilizamos 32 muestras, de las cuales 29 fueron positivas para C. trachomatis, nueve para N. gonorrhoeae, cinco para T. pallidum y tres para M. genitalium. La secuenciación metagenómica directa no dio como resultado ningún genoma completo y, de hecho, apenas logró datos objetivo por encima de la línea de base observada en muestras negativas. El enriquecimiento objetivo con hibridación a 65 ° C dio como resultado resultados mucho mejores para cada patógeno, y en muchos casos se obtuvieron genomas exitosos con este método (Figura 1).

Para evaluar la selección óptima de muestras para el enriquecimiento objetivo, evaluamos la relación entre los valores de diagnóstico de qPCR Ct y la eficiencia de la recuperación del genoma, medida por el porcentaje de lecturas en el objetivo (%OTR). Esta métrica refleja la proporción de lecturas de secuenciación que se asignan al genoma del organismo objetivo y se usa comúnmente para evaluar el rendimiento del enriquecimiento. Se encontró una correlación significativa entre la carga de patógenos y el éxito de la secuenciación de C. trachomatis, con un punto de corte de Ct para el éxito alrededor de Ct30. Aunque los datos para los otros patógenos objetivo fueron limitados, se observó una tendencia similar, donde el éxito de la secuenciación del genoma ocurrió predominantemente en muestras con carga de patógenos por debajo de Ct30 (Figura 2).

Este experimento con una temperatura de hibridación de 65 °C dio tasas de éxito en la secuenciación del genoma con un enriquecimiento objetivo del 75% al 80% para C. trachomatis, N. gonorrhoeae y T. pallidum, basado en muestras con valores de Ct inferiores a 30. Las tres muestras positivas de M. genitalium tenían valores de Ct de 30-37 y lograron una menor cobertura del genoma y una profundidad de lectura media. Para mejorar estos resultados, experimentamos con la reducción de la temperatura de hibridación, lo que mejora la hibridación debido al bajo contenido de %G+C en el genoma de M. genitalium . Usando temperaturas de hibridación más bajas, como la temperatura ahora recomendada de 62,5 ° C, podemos mejorar la recuperación de los genomas de M. genitalium sin comprometer la recuperación de otros genomas (Figura 3). Estos resultados demuestran que el enriquecimiento de objetivos es un enfoque eficaz para obtener información genómica valiosa de muestras clínicas y se puede adaptar a una amplia gama de genomas, también a través de un diseño basado en paneles.

El análisis filogenético de los genomas de C. trachomatis enriquecidos con éxito mostró que la mayoría de las muestras de Buenos Aires se agrupan dentro del clado L2b del genotipo ompA, lo que sugiere un linaje exitoso con circulación global. El análisis también reveló la presencia de un linaje novedoso y distinto en Argentina, causante de LGV. Las muestras de este clado difieren en aproximadamente 600 SNP de los otros linajes de LGV, y este linaje se propone como ompA-genotipo L4 (Figura 4). En la Tabla complementaria 1 se proporciona una descripción detallada de las muestras utilizadas en la Figura 1, la Figura 2 y la Figura 4.

Estos hallazgos subrayan el valor del enriquecimiento de objetivos en el estudio de la diversidad de patógenos y demuestran un alto grado de éxito en la secuenciación del genoma de muestras clínicas.

Figura 1: Enriquecimiento de genomas mediante enriquecimiento de dianas en comparación con la secuenciación metagenómica directa. El porcentaje de lecturas en el objetivo (%OTR), definido como el porcentaje de lecturas de secuenciación que se asignan al genoma del organismo objetivo, muestra el grado de enriquecimiento logrado con el enriquecimiento objetivo. La línea representa la mediana de todos los puntos de datos y el cuadro indica el rango intercuartílico (RIC) del 50%. Los colores de los puntos de datos corresponden a la fuente de la muestra: azul pálido para Argentina y rojo para Suiza. El éxito de la secuenciación del genoma, definido como la cobertura >95% y la profundidad media de lectura >10, se representa con puntos grandes, mientras que el fracaso se indica con puntos pequeños. Tenga en cuenta las diferentes escalas en el eje y. Abreviaturas: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Esta cifra ha sido modificada de¹⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Correlación del % de OTR del enriquecimiento de objetivos con los valores de diagnóstico de qPCR Ct. Los colores de los puntos de datos representan la fuente de la muestra: azul pálido para Argentina y rojo para Suiza. El éxito de la secuenciación del genoma, definido como cobertura >95% y profundidad media de lectura >10, se indica con puntos grandes, mientras que el fracaso se representa con puntos pequeños. Tenga en cuenta las diferentes escalas en el eje y. Abreviaturas: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Esta cifra ha sido modificada de¹⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Efecto de la temperatura de hibridación en la recuperación de genomas completos en todos los patógenos bacterianos de ITS en diez muestras. El ADN humano en el rango del de las muestras clínicas se enriqueció con concentraciones conocidas de ADN bacteriano objetivo por separado (único) y también en conjunto para representar una muestra con múltiples infecciones (combinado). Se realizaron dos experimentos, cada uno con los cinco patógenos / combinaciones: 0,01% y 0,03% para representar el porcentaje aproximado de ADN de cada microorganismo en relación con el ADN total en la muestra (el ADN restante corresponde al ADN humano). La recuperación de M. genitalium mejora a temperaturas más bajas. C. trachomatis El ADN se enriqueció a baja concentración; experimentos adicionales muestran que las temperaturas no afectaron la recuperación de los genomas de C. trachomatis (datos no mostrados). Abreviaturas: CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Filogenia ajustada por recombinación de cepas de LGV de Argentina. El análisis incluye todos los genomas de LGV disponibles con datos publicados. Los metadatos que se muestran a la derecha de la filogenia incluyen muestras de pacientes duplicadas, análisis bayesiano de la estructura de la población (BAPS; clúster = clado, con el grupo polifilético BAPS 6 que representa la diversidad genética de la población), método de secuenciación del genoma (datos de este estudio), genotipo ompA , país y año, como se indica en la clave en la parte superior izquierda. Los datos faltantes se muestran en blanco. Los nombres del genoma de este estudio se resaltan en azul claro para Argentina y azul oscuro para Finlandia (no se obtienen por enriquecimiento objetivo). Estos colores se utilizan únicamente para distinguir los genomas generados en este estudio. Los valores de arranque de 1000 bootstraps ultrarrápidos se muestran como porcentajes en las ramas principales. Esta cifra se ha modificado de¹³. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla complementaria 1: Descripción de materiales, reactivos, instrumentos y equipos utilizados en el estudio. La tabla incluye información detallada sobre el nombre comercial, el fabricante y el número de catálogo de los componentes utilizados para la extracción de ADN, la preparación de bibliotecas, el enriquecimiento de objetivos y la secuenciación. También incluye elementos utilizados para ensayos internos de qPCR y procedimientos generales de biología molecular. Se pueden utilizar alternativas equivalentes para los artículos marcados con un asterisco (*). Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

Generar datos completos del genoma bacteriano a partir de muestras clínicas es particularmente desafiante. Sin embargo, necesitamos estos datos para obtener información sobre los clones circulantes e investigar los perfiles de resistencia a los antimicrobianos, particularmente en bacterias fastidiosas y difíciles de cultivar. Utilizando métodos alternativos como la secuenciación profunda o la secuenciación adaptativa con Oxford Nanopore Technologies, no se pueden obtener datos suficientes para el análisis de la secuencia del genoma completo. En casos como las muestras de ITS, el enriquecimiento objetivo es la técnica óptima para acceder al genoma completo, y este método se puede utilizar en un panel de patógenos bacterianos de ITS. Si bien no es un procedimiento barato, los resultados que puede ofrecer no se pueden obtener de ninguna otra manera¹⁰.

Las muestras apropiadas deben seleccionarse cuidadosamente, idealmente para responder preguntas relevantes e importantes en el diagnóstico y la investigación. El medio utilizado para la recolección no necesariamente juega un papel crítico, con secuencias exitosas obtenidas de medios 2-SP y NAAT. El almacenamiento de muestras es importante, con el objetivo de mantener la integridad del ADN. El factor más importante fue la carga diagnóstica, apuntando a valores aproximados de Ct por debajo de Ct30. Para muestras con valores de Ct superiores a 30, el éxito de la secuenciación completa del genoma es menos probable, pero los datos parciales pueden proporcionar información relevante en algunos casos.

El procedimiento no es trivial, ya que implica muchos pasos, incluidos ciclos de PCR, hibridación y muchos lavados de perlas. Se requiere una atención cuidadosa al procedimiento para obtener resultados óptimos. Los pasos críticos del protocolo (fragmentación del ADN, hibridación con sondas de captura y captura basada en perlas magnéticas con lavado) requieren una ejecución cuidadosa y un manejo adecuado. El protocolo puede ser aprendido por investigadores y técnicos después de un par de intentos. En las primeras rondas, mientras se aprende, el protocolo de 3 días puede ser una ventaja; Con usuarios más experimentados, el protocolo de 2 días puede acelerar los resultados. Como los reactivos son caros, puede valer la pena realizar una prueba sin los costosos componentes, por ejemplo, las sondas. Para conjuntos de cebos alternativos, se puede ajustar la temperatura de hibridación, lo que puede mejorar la sensibilidad o especificidad del enriquecimiento. Si se generan suficientes datos y se observa una proporción considerable de duplicados de PCR, también se puede ajustar el número de ciclos de PCR previos y posteriores a la captura.

Los datos obtenidos de estos experimentos se pueden utilizar para escribir, con MLST y otros objetivos relevantes extraídos. Además, se puede analizar en un contexto epidemiológico, global o localmente, en comparación con genomas relevantes para conocimientos contemporáneos. La recombinación y el análisis de elementos móviles en todo el genoma también infieren cambios a lo largo del tiempo y bajo presión selectiva, y posibles coinfecciones. Con datos suficientes y metadatos asociados, se pueden realizar cálculos temporales y la inferencia de los antepasados de características y linajes específicos, así como posibles rutas y mecanismos de transmisión. Todos estos avances en nuestro conocimiento de un grupo importante de patógenos pueden informar las estrategias de salud pública. Nuestro protocolo y los resultados representativos muestran el uso de conjuntos de sondas diana de panel sindrómico, que son eficaces en muestras bacterianas de ITS y podrían extenderse a otros tipos de muestras.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pipeta de 8 canales 0,5-10 µ L	Eppendorf	3125000010	Investigación de Eppendorf  más, 8 canales, 0.5-10 µ L, gris medio, volumen variable.
Pipeta de 8 canales 10-100 µ L	Eppendorf	3125000036	Investigación de Eppendorf  Además, 8 canales, 10-100 µ L, amarillo, volumen variable.
Combinación de oligoelementos del adaptador para bibliotecas etiquetadas con MBC	Tecnologías Agilent	5500-0147	Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (pre PCR).
Sistema automatizado de extracción de ácidos nucleicos mediante un kit de extracción de ADN viral/patógeno	Qiagen	937036 (Kit) / 9001297 (Instrumento)	Instrumento QIAsymphony SP/AS utilizado con el kit QIAamp DSP Virus/Pathogen para la extracción automatizada de ADN.
Búfer de enlace	Tecnologías Agilent	5190-9687	Parte del kit de enriquecimiento de objetivos SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).
Kit de extracción de ADN e instrumento automatizado	Corporación de Investigación Zymo	D3024/D3025	Kit de minipreparación de ADN rápido utilizado para la extracción total de ADN de muestras clínicas. Compatible con flujo de trabajo manual o automatizado.
End Repair: una mezcla de enzimas de cola	Tecnologías Agilent	5500-0147	Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (pre PCR).
Amortiguador de cola de reparación final	Tecnologías Agilent	5500-0147	Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (pre PCR).
Etanol	Productos químicos VWR BDH	20816.298	Absoluto de etanol ≥ 99,5% Doctorado en Euros, USP
Fluorómetro con ensayo de dsDNA de alta sensibilidad / Método basado en fluorescencia para cuantificar el ADN	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	Q33238, Q33231	Fluorómetro Qubit 4 con kit de ensayo de alta sensibilidad (HS) 1X dsDNA.
Búfer de fragmentación	Tecnologías Agilent	5191-4080	Parte del kit de fragmentación enzimática SureSelect con el nombre ''Buffer de fragmentación 5X''.
Enzima de Fragmentación	Tecnologías Agilent	5191-4080	Parte del kit de fragmentación enzimática SureSelect.
Tampón de ADN polimerasa de alta fidelidad	Tecnologías Agilent	5500-0147	Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (Pre PCR) con el nombre ''Herculase II Buffer''.
Tampón de ADN polimerasa de alta fidelidad con dNTP (5X)	Tecnologías Agilent	5190-9687	Parte del kit de enriquecimiento de objetivos SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) con el nombre ''Herculase II Buffer''.
Enzima de fusión de alta fidelidad para amplificación por PCR	Tecnologías Agilent	5191-5688	Parte del kit de enriquecimiento de objetivos SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) con el nombre ''Herculase II''.
Tampón de lavado a alta temperatura	Tecnologías Agilent	5190-9687	Parte del kit de enriquecimiento de objetivos SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) con el nombre ''Wash buffer 2''.
Tampón de hibridación	Tecnologías Agilent	5500-0147	Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (pre PCR).
Manuales de secuenciación indexada	Tecnologías Agilent	5500-0147	Parte de los pares de cebadores de índice SureSelect XT HS2 1-96 para ILM (pre PCR).
Ensayo de PCR multiplex en tiempo real interno	Tib Molbiol	N/A	Ensayo desarrollado y acreditado internamente basado en kits Lightmix para la detección de ITS
Tampón de ligadura	Tecnologías Agilent	5500-0147	Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (pre PCR).
Perlas magnéticas para limpieza	Tecnologías Agilent	5191-5740	Perlas SureSelect DNA AMPure XP.
Soporte magnético	Material de laboratorio Permagen	MSRLV08	Separador magnético de 8 tiras de PCR de 0,2 ml 5 µ L ~0,2 ml de volumen.
Secuenciación de próxima generación (NGS): sistema de secuenciación de lectura corta de alto rendimiento	Illumina, Inc.	N/A	Secuenciación de 150 pb de extremo emparejado (PE150) realizada en las plataformas Illumina NextSeq1000 y MiSeq.
Agua libre de nucleasas	BioConcept	3-07F04-H	Agua para biología molecular, libre de ADN/ADNasa/RNasa, estéril, libre de inhibidores de PCR.
Mezcla de bloqueadores de oligonucleótidos	Tecnologías Agilent	5500-0147	Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (pre PCR).
Tira de tubo de PCR	avantor, entregado por VWR	732-3608	Tiras de tubo de PCR con tapas planas adjuntas.
Mezcla de imprimación posterior a la captura	Tecnologías Agilent	5190-9687	Parte del kit de enriquecimiento de objetivos SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).
Sonda de ARN	Tecnologías Agilent	5191-6916	Sonda SureSelect Custom Tier4 de 6 Mb-11,9 Mb, por ejemplo, ID de diseño S3465164).
Bloqueador de ARNasa	Tecnologías Agilent	5500-0147	Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (pre PCR).
Tampón de lavado a temperatura ambiente	Tecnologías Agilent	5190-9687	Kit de enriquecimiento de objetivos SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) con el nombre ''Tampón de lavado 1''.
Perlas de estreptavidina	Tecnologías Agilent	5191-5742	Perlas de estreptavidina SureSelect.
ADN ligasa T4	Tecnologías Agilent	5500-0147	Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (Pre PCR).
Método de enriquecimiento de objetivos / método de captura de ADN	Tecnologías Agilent	G9983-90000	Kit de ADN SureSelect XT HS2 con preparación de bibliotecas, enriquecimiento rápido de objetivos y flujo de trabajo de agrupación posterior a la captura. Versión de protocolo F0, mayo de 2023. Para Illumina Platform NGS
Conjunto de sondas de enriquecimiento objetivo para C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum y M. genitalium	Agilent Technologies / Laboratorio de Microbiología Enriquecedora (IMM, UZH)	ID de diseño S3465164	Conjunto de sondas diseñado a medida (~242.000 sondas) para la captura múltiple de cuatro patógenos de ITS. Diseño basado en múltiples genomas de referencia.
Termociclador	Termofischer	4375305	Termociclador Veriti de 96 pocillos.