Aplicación del diseño de arriba y abajo de Dixon para estimar la concentración alveolar mínima de sevoflurano en ratas con clasificación de movimiento refinada

Resumen

El protocolo presentado en este documento busca evaluar la profundidad de la anestesia utilizando el diseño Up-and-Down de Dixon en ratas sedadas sometidas a un estímulo de dolor estandarizado. Además, delinea una clasificación de los diversos patrones de movimiento observados.

Resumen

Cuando se utilizan agentes anestésicos volátiles, la medida estándar de potencia es la concentración alveolar mínima (MAC), definida como la concentración alveolar a la que el 50% de los sujetos no muestran una respuesta motora a un estímulo doloroso. En estudios clínicos y experimentales, el consenso actual establece que solo los "movimientos brutos con propósito" cuentan como una respuesta motora positiva y, por lo tanto, pueden indicar una sedación demasiado leve. Sin embargo, el nivel apropiado de anestesia, tanto en humanos como en animales, varía individualmente en función de varios factores influyentes, como otros medicamentos administrados. Se realizaron dos estudios en animales en ratas para examinar los efectos del tetrahidrocannabinol y el etanol sobre el sevoflurano, uno de los anestésicos volátiles más utilizados. Para estimar el MAC, se empleó el diseño Up-and-Down de Dixon. Para el primer animal, se eligió una dosis predeterminada de sevoflurano. Después de un período de equilibrio de 15 min, se aplicó un estímulo de dolor estandarizado al tercio distal de la cola de la rata utilizando una pinza quirúrgica. La respuesta del animal al estímulo se documentó como positiva o negativa. Si se producía una reacción motora positiva, se aumentaba la dosis para el siguiente animal. Por el contrario, si la rata no exhibía una respuesta motora, se disminuía la dosis para el siguiente animal. Se utilizó regresión isotónica y el método bootstrap para estimar el MAC y los intervalos de confianza del 95%. Este artículo describe un protocolo detallado para evaluar la profundidad anestésica en ratas utilizando el diseño hacia arriba y hacia abajo. También proporciona una descripción y categorización novedosa y detallada de los patrones de movimiento en ratas sedadas cuando se aplica un estímulo doloroso estandarizado para mejorar la reproducibilidad para estudios futuros.

Introducción

El sevoflurano es uno de los anestésicos inhalados volátiles más utilizados¹. Su potencia se evalúa mediante la concentración alveolar mínima (MAC), que se define como la concentración alveolar a la que el 50% de los pacientes no muestran una respuesta motora a un estímulo doloroso ^2,3,4. Para establecer el MAC, las ratas pueden utilizarse como modelos animales debido a su mayor homogeneidad en comparación con los humanos. El estímulo del dolor generalmente se aplica mediante una pinza quirúrgica en el tercio distal de la cola de la rata². El uso de métodos alternativos para las pruebas del dolor no garantizaría la comparabilidad con los estudios realizados anteriormente y, por lo tanto, podría generar resultados divergentes. Debido a la gran variedad de patrones de movimiento en respuesta al estímulo, el consenso actual establece que solo los "movimientos brutos con propósito" deben considerarse reacciones motoras positivas³. Sin embargo, esta definición carece de más refinamiento con respecto a qué categorías específicas calificarían como "con un propósito grave" y en qué medida un movimiento debe cumplir con este criterio. Esto es de suma importancia, ya que una respuesta motora a un estímulo puede indicar, en un entorno clínico, una profundidad insuficiente de sedación.

Varios factores influyen en el estado anestésico, incluida la edad⁵, las comorbilidades⁶, la función hepática deteriorada⁷ o la hipotermia⁸. Además, los medicamentos administrados junto con los anestésicos afectan significativamente la profundidad de la anestesia. Por ejemplo, el fentanilo y el propofol, a menudo utilizados durante la fase de inducción, reducen la cantidad requerida de sevoflurano ^9,10. Además, se ha demostrado que la lidocaína o la pregabalina pueden disminuir el MAC de sevoflurano^11,12. Además, la ingesta reciente de alcohol o sustancias como el tetrahidrocannabinol (THC) también puede reducir la MAC, mejorando así la profundidad de la anestesia^13,14. Por el contrario, se ha sugerido que los agentes simpaticomiméticos pueden aligerar la sedación al estimular el sistema nervioso central¹⁵.

Para mejorar la reproducibilidad para estudios futuros, se proporciona un protocolo detallado y descripciones en video para evaluar el MAC en ratas utilizando el diseño hacia arriba y hacia abajo de Dixon¹⁶ . A diferencia de los estudios anteriores de MAC, este protocolo describe los pasos detallados del procedimiento para respaldar la reproducibilidad en todos los laboratorios. Además, se volvieron a analizar las imágenes de video de dos estudios publicados anteriormente y las respuestas motoras se clasificaron en función de su extensión y patrón (movimientos coordinados: rodar, estirar, saltatorio y curling de movimiento no coordinado). Por lo tanto, este estudio también ofrece una descripción y clasificación innovadora y exhaustiva de los patrones de movimiento en ratas sedadas en respuesta a un estímulo doloroso estandarizado, con el objetivo de mejorar la reproducibilidad para futuras investigaciones.

Protocolo

Todos los estudios experimentales con animales han sido aprobados por el Comité Intramuros de Experimentación Animal de la Universidad Médica de Viena y la autoridad reguladora competente (Ministerio Federal de la Mujer, la Ciencia y la Investigación de Austria). Los experimentos se llevaron a cabo bajo anestesia constantemente mantenida. Los animales no perciben conscientemente el dolor incluso si se produce un movimiento¹⁷. Se utilizaron ratas Wistar adultas de 81 a 95 días de edad.

1. Animales de estudio y alojamiento

1. Aloja a los animales según el peso y el sexo. Separe a los machos y las hembras y alójelos durante un mínimo de 14 días antes de comenzar el experimento para permitir la aclimatación. Coloque un máximo de tres ratas de más de 400 g o cuatro ratas de menos de 400 g por jaula.
2. Mantenga las condiciones ambientales con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, temperatura ambiente de 22 °C y niveles de humedad entre el 45% y el 65%.
3. Pese a cada animal con regularidad y registre el peso corporal antes de cada procedimiento.
4. Transportar animales individualmente desde el área de alojamiento hasta la instalación de prueba. Cubra cada jaula con un paño para reducir el estrés visual y aloje a los animales no probados en una habitación separada para evitar la exposición a procedimientos experimentales.

2. Configuración del equipo

1. Verifique que todo el equipo requerido sea funcional y esté disponible antes de comenzar el experimento. Realice verificaciones de equipos de acuerdo con las pautas institucionales o los procedimientos operativos estándar, incluidas las pruebas de fugas, la calibración y las pruebas de función de energía cuando corresponda.
2. Use una cámara hermética y transparente (15 cm × 20 cm × 9 cm) para colocar la rata. Asegúrese de que la cámara esté equipada con una abertura de 15 mm para guiar externamente la cola y minimizar las fugas de gas.
3. Conecte la línea de entrada a un vaporizador de sevoflurano y una fuente de oxígeno.
4. Conecte la línea de salida en el lado opuesto de la cámara a un sistema de extracción de gas y un monitor de anestesia para registrar las concentraciones de sevoflurano.
5. Confirme que el termómetro rectal, la manta calefactora y la lámpara calefactora infrarroja estén operativos. Pruebe el termómetro con un dispositivo de referencia, verifique que la manta calefactora alcance los rangos de temperatura objetivo y verifique que la lámpara infrarroja se encienda y mantenga una salida estable. Coloque la lámpara directamente sobre la cámara de prueba a una distancia segura de acuerdo con los procedimientos de seguridad locales.
6. Prepare una pinza arterial de 25 cm para ser utilizada para el estímulo de dolor estandarizado.

3. Preparación de medicamentos

1. Preparación de THC (opcional)
   1. Use una formulación de THC con una concentración de 25 mg / ml. Calcule el volumen requerido para cada animal multiplicando el peso corporal en kilogramos por (10 mg / kg / 25 mg / ml), lo que da como resultado 0,4 ml por kg de peso corporal.
   2. Utilice una pipeta de desplazamiento positivo para extraer el volumen exacto calculado para cada animal. No administrar en esta etapa. Prepare la pipeta y déjela a un lado para su administración posterior durante el paso de administración del fármaco (consulte el paso 4.6).
   3. Utilice una punta de pipeta adecuada para la sonda, como una que pueda contener de forma segura hasta 0,3 ml de líquido. Realice la sonda oral directamente con la pipeta cargada. Deseche la punta de la pipeta después de cada uso para evitar la contaminación cruzada.
2. Preparación de etanol (opcional):
   1. Prepare etanol a la concentración de dosis requerida de 1 g / kg o 2 g / kg. Utilice una formulación altamente concentrada de etanol (por ejemplo, 96-100%) como base y disuélvala en solución salina al 0,9% hasta un volumen total de 10 ml / kg de peso corporal para cada animal individual. Use el mismo volumen de solución salina sola que el placebo correspondiente. Siga todas las pautas de seguridad institucionales, particularmente las relacionadas con el manejo y almacenamiento de sustancias inflamables.
   2. Utilice una jeringa adecuada (5 ml o 10 ml, según el peso del animal) para extraer el volumen calculado exacto para cada animal individual. No administre la sustancia en esta etapa. Prepare la jeringa y déjela a un lado para la inyección intraperitoneal durante el paso de administración del fármaco (ver paso 4.6). Coloque una aguja de 23 G para la administración y cúbrala con una tapa correspondiente para evitar lesiones hasta su uso.

4. Aplicación de medicamentos

1. Induzca la anestesia para la administración del fármaco colocando a la rata en la cámara e inundándola con sevoflurano al 3,5% en volumen en oxígeno al 100% a 3 L / min.
2. Espere aproximadamente 3-5 minutos hasta que el animal esté visualmente inconsciente.
3. Realice la prueba del reflejo de adrizamiento inclinando suavemente la cámara para hacer rodar al animal sobre su espalda. Si no intenta enderezarse dentro de los 10 s, asuma la profundidad adecuada de la anestesia.
4. Reduzca temporalmente la concentración de sevoflurano a 0 y enjuague la cámara con oxígeno al 100% durante 15 s para minimizar la exposición al gas anestésico para el experimentador.
5. Retire al animal de la cámara y colóquelo frente a un tubo de suministro de gas que administra la misma concentración de sevoflurano para mantener la anestesia durante la administración. Omita este paso si la administración de la sustancia de prueba es lo suficientemente breve como para evitar la recuperación de la anestesia.
6. Administrar sustancias según el diseño experimental: Administrar 10 mg/kg de THC por sonda gástrica o administrar 1 g/kg o 2 g/kg de etanol por vía intraperitoneal. Consulte la Sección 3 para obtener detalles de preparación y siga las pautas institucionales para realizar procedimientos de administración intraperitoneal y por sonda.
7. Regrese al animal a su jaula para que se recupere.
8. Espere 1 h para el etanol y 2 h para el THC antes de continuar con el procedimiento.

5. Inducción de anestesia para pruebas MAC

1. Después del período de espera, vuelva a colocar la rata en la cámara de prueba hermética e inundérela con la mezcla determinada de sevoflurano y oxígeno. Asegure un flujo de oxígeno constante de 3 L/min. Determine la concentración individual de sevoflurano (paso 9.1) para cada animal, comenzando con 2.6% en volumen (u otro punto de partida predeterminado basado en la planificación estadística) para el primer animal de cada grupo. A continuación se ofrece una descripción detallada del diseño hacia arriba y hacia abajo.
2. Encienda la lámpara de calefacción infrarroja.
3. Espere aproximadamente 3-5 minutos hasta que el animal esté visualmente inconsciente.
4. Realice la prueba del reflejo de adrizamiento inclinando suavemente la cámara para hacer rodar al animal sobre su espalda. Si no intenta enderezarse dentro de los 10 s, asuma la profundidad adecuada de la anestesia.
5. Reduzca temporalmente la concentración de sevoflurano a 0 y enjuague la cámara con oxígeno al 100% durante 15 s para minimizar la exposición al gas anestésico para el experimentador.
6. Abra rápidamente la cámara e inserte el termómetro rectal. Controle la temperatura corporal central durante todo el procedimiento y ajuste la intensidad de la lámpara calefactora infrarroja y la manta calefactora en consecuencia.
7. Lleva la cola hacia afuera a través de la pequeña abertura en la cámara.
8. Cierre la cámara rápidamente.
9. Restablezca inmediatamente la concentración deseada de sevoflurano antes de continuar.

6. Tiempo de equilibrio

1. Deje un período de 15 minutos para equilibrar.
2. Controle continuamente la temperatura central del animal (37,2 °C ± 0,3 °C) y ajuste los dispositivos de calefacción en consecuencia para mantener la normotermia.

7. Estímulo de dolor

1. Identifica el tercio distal de la cola.
2. Aplique el estímulo del dolor bloqueando la pinza en su tercera posición (aproximadamente 50 N de fuerza).
3. Deje la pinza bloqueada en su tercera posición hasta que la rata muestre una respuesta de movimiento positiva, pero durante un máximo de 1 min.
4. Registre en el protocolo la presencia o ausencia de una reacción motora. Proporcione una breve descripción del movimiento observado en términos de su patrón y extensión. Consulte el punto 11 para la clasificación de los patrones de movimiento.

8. Recuperación

1. Apaga el vaporizador y la lámpara de calefacción y vuelve a colocar la rata en la jaula.

9. Diseño hacia arriba y hacia abajo

1. Determine la concentración de sevoflurano para el siguiente experimento utilizando el diseño hacia arriba y hacia abajo de Dixon. Si el animal anterior mostró una respuesta motora al estímulo, aumente la concentración para el siguiente animal en un 0,2% pt. Por el contrario, si el animal anterior no mostró ninguna respuesta motora, disminuya la concentración en un 0,2% pt.

10. Eutanasia (si corresponde)

NOTA: La eutanasia no es inherentemente una parte necesaria de los experimentos. Se debe consultar al Comité Intramuros competente para Experimentos con Animales. Para los dos estudios referenciados, se decidió realizar extracciones de sangre intracardíacas y sacrificar a los animales después. Los animales no fueron devueltos a la jaula como se describe en el paso 8.1, sino que el procedimiento continuó directamente con el paso 9.1.

1. Prepare la solución de eutanasia disolviendo 300 mg de pentobarbital en 1 ml de solución salina. Extraiga la solución en una jeringa y manténgala lista para su uso inmediato después de la extracción de sangre.
2. Saque la rata de la caja y colóquela frente a un tubo de respiración que administra sevoflurano al 3,5% en volumen en oxígeno al 100% para mantener una anestesia constante. Coloque al animal boca arriba para permitir un acceso sin obstrucciones al área torácica.
3. Realice la extracción de sangre intracardíaca con una aguja de 23 G y una jeringa de 5 ml. Palpe suavemente los latidos del corazón con un dedo para localizar el corazón. Inserte la aguja justo caudal a la apófisis xifoides, ligeramente a la izquierda de la línea media y en un ángulo poco profundo.
4. Aspire suavemente mientras ajusta la posición de la aguja hasta que se observe el flujo sanguíneo. Recopile el volumen necesario.
5. Después de completar la extracción de sangre, retire con cuidado la jeringa de la aguja y coloque la jeringa precargada que contiene la solución de pentobarbital. Administre todo 1 ml de la solución por vía intracárdica para garantizar la eutanasia de acuerdo con las pautas éticas institucionales.

11. Continuación de los experimentos

1. Repita el experimento a partir del paso 3 para cada animal de estudio individualmente.

12. Clasificación de patrones de movimiento (opcional)

1. Clasifique las respuestas conductuales en las siguientes categorías:
   1. Rodar: Clasificar como rodar cuando la respuesta conductual implica una rotación axial del cuerpo, generalmente a lo largo del eje longitudinal.
   2. Estiramiento: Se clasifica como estiramiento cuando la respuesta conductual se caracteriza por una extensión bilateral y simétrica hacia afuera de las extremidades y el cuerpo.
   3. Movimiento saltatorio: Se clasifica como movimiento saltatorio cuando la respuesta conductual consiste en patadas o sacudidas repentinas enfocadas en las extremidades traseras que se asemejan a ráfagas cortas de todo el cuerpo.
   4. Curling: Se clasifica como curling cuando la respuesta conductual implica un movimiento descoordinado y dirigido hacia adentro de intensidad variable, lo que hace que el cuerpo se doble hacia su centro.

Resultados

En el estudio de THC, la estimación bootstrap del MAC fue de 2,8% vol en el grupo control (IC 95%: 2,7-2,9 vol%) y 2,1% vol% en el grupo de THC 10 mg/kg (IC 95%: 1,8-2,4% vol%)¹³.

En el estudio de etanol, el MAC estimado fue de 2,24 % vol en el grupo control (IC 95%: 1,97-2,94 vol%). En el grupo de etanol de 1 g/kg, fue de 1,65 % vol (IC 95%: 1,40-1,98 vol%), y en el grupo de etanol 2 g/kg, 1,08 vol% (IC 95%: 0,73-1,42 vol%)¹⁴. El número diferent...

Discusión

Este estudio refina el protocolo para determinar el MAC de sevoflurano en ratas al detallar los pasos metodológicos críticos y abordar los desafíos comunes para contribuir a un enfoque más estandarizado y reproducible para evaluar la profundidad anestésica.

La determinación precisa de MAC es esencial para las prácticas anestésicas experimentales y clínicas. Este trabajo contribuye a la literatura existente al proporcionar un método claro y reproducible para ev...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cámara transparente hermética	N/A	N/A	Genérico
Pinza arterial	KLS Martin	13-410-22-07	25 cm
Drä ger Primus	Drä ger Austria GmbH	Primus
Drä ger Vapor 2000	Drä ger Austria GmbH	Vapor 2000
Unidad de control de manta homeotérmica	Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, EE. UU.	50-7137	230 V
Calentador infantil móvil manual	Fisher/Paykle, Auckland, Nueva Zelanda	IW9210/920